人剪切修復(fù)基因XPD對(duì)肝癌細(xì)胞生長的抑制作用

1、人剪切修復(fù)基因 XPD 對(duì)肝癌細(xì)胞生長的抑制作用作者：黃神安，徐江晶，張吉翔，熊瑛，尹東，李軍作者單位：1.330006 南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院消化內(nèi)科；2.江西省分子醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室【摘要】【摘要】目的探討野生型人剪切修復(fù)基因著色性干皮病基因 D(xerodermapigmentosum D,XPD)對(duì)肝癌細(xì)胞 SMMC7721 增殖的影響，并探討其機(jī)制。方法用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法瞬時(shí)轉(zhuǎn)染 SMMC7721 細(xì)胞，轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒 XPDN2 和空載質(zhì)粒N2，并用未轉(zhuǎn)染的與 XPDN2、N2 具有相同遺傳背景和代數(shù)的 SMMC7721 細(xì)胞作為空白對(duì)照。熒光顯微鏡觀察綠色熒光蛋白報(bào)告基因表達(dá)情況，流式細(xì)胞儀

2、檢測細(xì)胞周期，逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RTPCR）、Western blot 法檢測細(xì)胞中 XPD、cmyc、cdc25A、cdK2 表達(dá)量變化，MTT 法觀察細(xì)胞增殖的活力。結(jié)果提取出的重組質(zhì)粒 pEGFPN2XPD 用酶切鑒定，與 Genebank 上的相符。在熒光顯微鏡下，可以在 SMMC7721pEGFPN2、SMMC7721pEGFPN2XPD 細(xì)胞中觀察到綠色熒光蛋白的表達(dá)，質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染效率為 30%左右。流式細(xì)胞儀結(jié)果顯示，pEGFPN2XPD 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入細(xì)胞后，肝癌細(xì)胞進(jìn)入 S 期發(fā)生阻滯，停滯在 G1 期。RTPCR、Western blot 檢測發(fā)現(xiàn) SMMC7721pEGF

3、PN2XPD 細(xì)胞與 SMMC7721pEGFPN2 和SMMC7721 兩對(duì)照組相比，其 XPD 表達(dá)明顯增高（P0.05）。cmyc、cdc25A、cdK2 相對(duì)表達(dá)量明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.05）。與兩對(duì)照組相比，SMMC7721pEGFPN2XPD 細(xì)胞增殖率明顯減弱（P0.05）。結(jié)論野生型 XPD 基因可以在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平抑制SMMC7721 細(xì)胞內(nèi) cmyc、cdc25A、cdK2 的表達(dá)。而且野生型 XPD 基因通過抑制 cdK2 的表達(dá)作用于 S 期 DNA 損傷檢控點(diǎn)，從而抑制 SMMC7721 細(xì)胞增殖?！娟P(guān)鍵詞】【關(guān)鍵詞】肝癌； XPD；cmyc；cdc25A

4、；cdK2；DNA 損傷檢控點(diǎn)Xeroderma Pigmentosum D Gene InhibitsProliferation of HumanHepatocellular Carcinoma Cell Line SMMC7721HUANG Shenan1, XU Jiangjing2, ZHANG Jixiang1,2, XIONGYing1, YIN Dong2, LI Jun11Department of Gastroenterology, The Second AffiliatedHospital of Nanchang University, Nanchang, Jiangxi

5、330006, China；2Jiangxi Provincial Key Laboratory of Molecular MedicineCorresponding Author:ZHANG Jixiang,Email:Abstract：Objective The Xeroderma Pigmentosum D (XPD)gene plays an important role in the path to DNA repair. It has beenreported that cells obtained high tumorsusceptibility whenmutation hap

6、pened in XPD gene. The purpose of this study is toinvestigate the influence of XPD gene in the growthandproliferation of hepatoma carcinoma cells (HCC).MethodspEGFPN2 andpEGFPN2XPD were transfected into SMMC7721 cell lines byLipofectamine2000 method. The expression of green fluorescent protein(GFP)

7、was observed through fluorescence microscope. Cell cycle of theplasmidtransfected SMMC7721 cells was analyzed by Flow cytometry(FCM). The expressions of wildtype XPD, cmyc, cdc25A and cdK2were detected by RTPCR and Western blot. Cell proliferation wasmeasured by MTT assay.ResultsThe recombinant plas

8、mid pEGFPN2XPDwas successfully transfected into SMMC7721 cells and greenfluorescence in cells was observed by fluorescent microscopy. Around30% transfection efficiency was obtained in this experiment. Inaddition, we have found that wild type XPD blocked the hepatoma cellsfrom S stage to G1 stage The

9、 expression of XPD inSMMC7721pEGFPN2XPD cells was significantly higher than thosein control group of SMMC7721 and SMMC7721pEGFPN2 cells(P0.05). The expressions of cmyc, cdc25A and cdK2 inSMMC7721pEGFN2XPD cells were significantly lower than thosein control cells (all P0.05). Furthermore,SMMC7721pEGF

10、PN2XPD has reduced proliferation ability thanempty plasmidtransfected cells (P0.05).ConclusionWildtype XPDdownregulated the expression of cmyc, cdc25A, and cdK2. Our resultssuggested that XPD inhibit the proliferation of SMMC7721 cellsprobably due to the blockage at S period DNA damage checkpoint in

11、hepatocellular carcinoma cell cycle.Key words：Liver cancer; XPD; CMyc; Cdc25A; CdK2; DNA damagecheckpoint1 1 材料和方法材料和方法1.1 材料1.1.1 細(xì)胞株和質(zhì)粒來源人肝癌細(xì)胞 SMMC7721 購自中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)。重組質(zhì)粒 pEGFPN2XPD 本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建。1.1.2 主要試劑和產(chǎn)地 RPMI1640 購自美國 Gibco BRL 公司。胎牛血清（FBS）購自南非 Hyclone 公司。Trypsin、Monoclonal Antibody Againsta

12、ctin 購自美國 Sigma 公司。Lipofectamine2000TM、TrizolTM 試劑購自美國 Invetrogen 公司。Wazard PureFection Plasmid DNA PufiicationSystem、MMLV Reverse Transcriptase、RNasin、dNTP、Oligo(dT)15 購自美國 Promega 公司。DMSO、DEPC 購自美國 Amresco 公司。PCR 引物購自上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司。Taq 酶購自日本 TaKaRa 公司。DNA 2000 LadderMarker 購自北京華美生物工程公司。MTT 購自上海普飛生

13、物技術(shù)有限公司。單克隆抗體 XPD、cmyc、cdc25A 和 cdK2 購自美國 Santa Cruz 公司。山羊抗鼠IgG辣根過氧化物酶、山羊抗兔 IgG辣根過氧化物酶購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。1.2 方法1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) SMMC7721 細(xì)胞在含 15% FBS 的 RPMI1640 培養(yǎng)基中，37、5%CO2 的條件下孵箱（Forma Scientific Inc,USA）中培養(yǎng)，以0.25%胰蛋白酶消化，23 天傳代一次。1.2.2 質(zhì)粒鑒定用堿裂解法提取空載質(zhì)粒 pEGFPN2 和重組質(zhì)粒pEGFPN2XPD，提取出的質(zhì)粒以 KPN、BGI和 SPH酶切鑒定。1.2.

14、3 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)設(shè) 3 組，每組 2 孔，分別為無轉(zhuǎn)染空白對(duì)照組（SMMC7721），空載質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞組（SMMC7721pEGFPN2）以及重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞組(SMMC7721pEGFPN2XPD)。以 2105 個(gè)細(xì)胞/孔的密度將SMMC7721 細(xì)胞鋪于 6 孔板內(nèi)，24h 細(xì)胞鋪 90%，pEGFPN2、pEGFPN2XPD每孔 0.4g，脂質(zhì)體每孔 10l 介導(dǎo)轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染 6h 后換有血清的培養(yǎng)基在37、5%CO2 的條件下孵育。40h 后在熒光顯微鏡下觀察，熒光顯微鏡激發(fā)光波長 395nm，觀察 pEGFP 釋放波長為 508nm 的綠色熒光。1.2.4 流式細(xì)胞儀（重復(fù) 3 次）

15、用胰酶消化收集上述各組轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞，應(yīng)用 FACSCalibar 流式細(xì)胞儀（Beckton Dickinson 公司，USA）分析，氬離子激光器激發(fā)波長為 488nm，在流式細(xì)胞儀上進(jìn)行細(xì)胞周期分析，得出細(xì)胞各周期的百分率。1.2.5RTPCR 測定基因表達(dá)量使用 Trizol 試劑提取各組細(xì)胞總 RNA，按照 SuperstcriptTM 試劑盒說明合成 cDNA。使用核酸蛋白分析儀（Eppendof公司,German）測定總 RNA 以及 cDNA 濃度。根據(jù) GenBank 中公布的人類 XPDmRNA 序列，人類 cmyc mRNA 序列、人類 cdc25A mRNA 序列，人類 c

16、dK2 mRNA序列，以及人類actin mRNA 序列設(shè)計(jì)引物。XPD 正義：5GCCCGCTCTGGATTATACG3，反義：5CTATCATCTCCTGGCCCCC3，擴(kuò)增片段長度 436bp；cmyc 正義：5AACCCTTGCCGCATCCAC3，反義：5CCTCCTCGTCGCAGTAGAAA3，擴(kuò)增片段長度 317bp；cdc25A 正義：5TGATGAGGATGATGGCTTCG3，反義：5CTGCACCCTTGATGTGGC3，擴(kuò)增片段長度 562bp；cdK2 正義：5ACTGGCATTCCTCTTCCC3，反義：5CTGGCTTGGTCACATCCTG3，擴(kuò)增片段長度 5

17、89bp；actin 正義：5CTTCCTGGGCATGGAGTC3，反義：5GCCGATCCACACGGAGTA3，擴(kuò)增片段長度 232bp。6l PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng) 1.5%瓊脂糖（含溴乙錠 5g/ml）電泳，通過 FR200 圖像分析軟件（上海復(fù)日公司）讀取目的電泳條帶的斑點(diǎn)密度掃描值，以各組actin 條帶的掃描值標(biāo)化其相應(yīng)組的 XPD、cmyc、cdc25A、cdK2 條帶的密度掃描值，獲得其相對(duì)表達(dá)量，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。1.2.6MTT 法（重復(fù) 4 次）在 96 孔板中進(jìn)行 3 組細(xì)胞的轉(zhuǎn)染，每組 6孔，每孔 1103 個(gè)細(xì)胞，對(duì)照組只加培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)染后培養(yǎng) 40h，每孔加入5mg

18、/ml MTT 10l，繼續(xù)培養(yǎng) 4h，棄上清，加入 100l DMSO，振蕩 10min，酶標(biāo)儀（Labststems,芬蘭）測定 492nm 處各孔吸光度（A）值，取每孔平均值。計(jì)算細(xì)胞抑制率，細(xì)胞抑制率=(1-A 實(shí)驗(yàn)組A 對(duì)照組)100%。1.2.7 蛋白表達(dá)檢測（Western blot）使用蛋白抽提液分別提取三組細(xì)胞的總蛋白，使用全自動(dòng)生化分析儀（Beckman,USA）測定蛋白濃度。取同量蛋白上樣于 8%聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳，繼而轉(zhuǎn)移蛋白于硝酸纖維素膜；將膜置于含 5%脫脂奶粉的 TBST 中 4封閉過夜，加封閉液稀釋的一抗(1200)過夜，用 TBST 洗膜 315min，加

19、封閉液稀釋 HRP 標(biāo)記二抗（12000），4過夜，TBST 洗膜 330min，顯色。1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 數(shù)據(jù)以s 表示，方差齊使用卡方檢驗(yàn)，方差不齊使用秩和檢驗(yàn)，并應(yīng)用 SPSS11.5 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。2 2 結(jié)果結(jié)果2.1pEGFPN2XPD 質(zhì)粒鑒定重組質(zhì)粒經(jīng) KPN和 BGI雙酶切后電泳應(yīng)在 4737bp 位置和約 2300bp 位置各有一條帶。此外，限制性核酸內(nèi)切酶SPH在 pEGFPN2 純質(zhì)粒的 2332、2404、3167bp 位置和 XPD 的 636bp 位置各有一酶切位點(diǎn)，同時(shí)我們的 XPD 是在 pEGFPN2 質(zhì)粒的 612bp 和 652bp 之間以正義方向插

20、入，所以重組質(zhì)粒經(jīng) SPH單酶切后電泳應(yīng)包括 2818、3344、763和 72bp 四條帶。與 Genebank 中公布的人類 XPD 完整 mRNA 序列 NM_000400.2 相符合,見圖 1。2.2pEGFPN2XPD 轉(zhuǎn)染成功鑒定 pEGFPN2 載體在其多克隆位點(diǎn)后帶有綠色熒光蛋白報(bào)告基因。通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染方式將 pEGFPN2 和 pEGFPN2XPD重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入 SMMC7721 細(xì)胞 40h 后，在熒光顯微鏡下觀察到了細(xì)胞中綠色熒光蛋白的表達(dá)，見圖 2。未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的純 SMMC7721 細(xì)胞則沒有。通過激光共聚焦顯微鏡觀察 pEGFPN2XPD 的轉(zhuǎn)染效率，轉(zhuǎn)染后 40h，

21、轉(zhuǎn)染效率為 30%左右。2.3pEGFPN2XPD 重組質(zhì)粒對(duì) SMMC7721 細(xì)胞周期的影響SMMC7721pEGFPN2XPD 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞組與兩對(duì)照組相比 G1 期細(xì)胞明顯增多，S 期細(xì)胞明顯減少，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.05）。SMMC7721pEGFPN2 空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞組與 SMMC7721 細(xì)胞組 G1、S 期差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,見表 1。因此 SMMC7721pEGFPN2XPD 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞進(jìn)入 S 期出現(xiàn)障礙，停滯在 G1 期的細(xì)胞增多。表 1 流式細(xì)胞儀分析各組細(xì)胞細(xì)胞周期情況2.4 三組細(xì)胞內(nèi) XPD、cmyc、cdc25A、cdK2 mRNAs 的表達(dá)情況2

22、.5 三組細(xì)胞內(nèi) XPD、cmyc、cdc25A、cdK2 蛋白的表達(dá)情況轉(zhuǎn)染野生型XPD 后，SMMC7721 細(xì)胞內(nèi) XPD 表達(dá)明顯增高,cmyc、cdc25A、cdK2 表達(dá)明顯下降（P0.05），見圖 4。2.6pEGFPN2XPD 重組質(zhì)粒對(duì) SMMC7721 細(xì)胞增殖活力的影響重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組 SMMC7721XPD 細(xì)胞增殖有了明顯變化，與空質(zhì)粒 N2 轉(zhuǎn)染組細(xì)胞SMMC7721pEGFPN2 和空白對(duì)照組細(xì)胞 SMMC7721 相比，SMMC7721XPD 細(xì)胞增殖明顯減少。SMMC7721pEGFPN2XPD 細(xì)胞組相對(duì)于 SMMC7721 細(xì)胞組抑制率為 50%（P0.05

23、）；SMMC7721pEGFPN2 細(xì)胞組相對(duì)于 SMMC7721 細(xì)胞組抑制率為 5%（P=0.45）。這說明 XPD 基因降低了 SMMC7721 細(xì)胞代謝，抑制了 SMMC7721 細(xì)胞的增殖。3 3 討論討論近年來的研究發(fā)現(xiàn)，哺乳動(dòng)物基本轉(zhuǎn)錄因子H (TFH)特別是 XPD 參與了核酸切除修復(fù)（NER）。研究者指出，XPD 基因發(fā)生突變時(shí)，腫瘤易感性更高2。我們把野生型 XPD 基因轉(zhuǎn)染入肝癌細(xì)胞中，發(fā)現(xiàn)肝癌細(xì)胞中的 cmyc、cdc25A、cdK2 基因在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平表達(dá)量明顯減少；細(xì)胞周期停滯在 G1期，不能進(jìn)入 S 期；肝癌細(xì)胞增殖明顯受到抑制。肝癌中 cmyc 表達(dá)常過量，本

24、實(shí)驗(yàn)組已證實(shí)野生型的 TFH 之一 XPB 可以抑制 cmyc 表達(dá)3。XPD 可以通過 Fuse 結(jié)合蛋白（FBP）影響 cmyc 的表達(dá)；FBP 有潛在的轉(zhuǎn)錄活化和抑制功能，是 cmyc 表達(dá)所必需的；FBP 干擾抑制子（FIR）可通過 TFH 阻斷轉(zhuǎn)錄，而 FBP 可結(jié)合 cmyc 基因的單鏈上游活化元件（FUSE）來抑制 cmyc 表達(dá)4。當(dāng) XPD 發(fā)生突變時(shí)，突變型 XPD 可以阻斷 FUSE 結(jié)合蛋白（FBP）的活化，而后者的活化可以使 cmyc 表達(dá)下降，當(dāng) XPD 發(fā)生缺陷或突變時(shí) cmyc表達(dá)量常增加；將 FBP 或/與 XPD 轉(zhuǎn)入進(jìn) XPD 缺陷的細(xì)胞后 cmyc 表達(dá)

25、量可下降5。cdc25A 在多種腫瘤中如結(jié)腸癌、乳腺癌、肝癌6等均有過度表達(dá)，并且與患者預(yù)后有關(guān)，cdc25A 被認(rèn)為是一種癌基因，分別在 G1/S 期和 G1 期中發(fā)揮作用。cdc25A 過度表達(dá)可導(dǎo)致細(xì)胞生長失控后惡化。cdc25A 是 cmyc 的靶基因之一7。本實(shí)驗(yàn)在 SMMC7721 細(xì)胞中轉(zhuǎn)染 XPD 后，細(xì)胞中癌基因cmyc、cdc25A 表達(dá)量均下降，野生型 XPD 抑制了 cmyc、cdc25A 基因的表達(dá)。癌基因表達(dá)下降，可引起癌細(xì)胞的生長力降低。cdK2 是 S 期的關(guān)鍵性激酶，在進(jìn)入 S 期和 DNA 復(fù)制過程中發(fā)揮其引擎作用8。在 DNA 復(fù)制過程中如果遇到 DNA

26、損傷，被激活的 Chk1 磷酸化 cdc25A，cdc25A 能夠去除 cdK2 上的抑制性磷酸根。這樣抑制了 cdc25A 最終抑制了 cdK2 的活性，從而抑制了尚未起始的 DNA 復(fù)制起始點(diǎn)的發(fā)動(dòng)。cdc25A、cdK2 基因都是與細(xì)胞周期密切相關(guān)的基因。在細(xì)胞周期進(jìn)程中，G1 期是個(gè)重要的調(diào)控點(diǎn)，它決定細(xì)胞是否通過 G1期，進(jìn)入 S 期，從而進(jìn)行細(xì)胞增殖，因此 G1/S 轉(zhuǎn)換的調(diào)控機(jī)制成為腫瘤研究的熱點(diǎn)，細(xì)胞周期 G1 期和 G1/S 轉(zhuǎn)換期各調(diào)節(jié)因子的異常改變與細(xì)胞癌變關(guān)系尤為密切9。我們的流式細(xì)胞儀分析結(jié)果指出：XPD 基因轉(zhuǎn)入肝癌細(xì)胞后，細(xì)胞停滯在 G1 期，進(jìn)入 S 期發(fā)生障礙

27、。表明 XPD 基因可以使癌細(xì)胞停滯在 G1 期，從而使癌細(xì)胞增殖大幅度減少，MTT 結(jié)果也證實(shí)了這一結(jié)論。腫瘤的發(fā)生與機(jī)體 DNA 修復(fù)能力有關(guān)。細(xì)胞在長期進(jìn)化過程中發(fā)展了一套能夠檢測 DNA 損傷、維護(hù)細(xì)胞遺傳穩(wěn)定性和完整性的機(jī)制，這個(gè)機(jī)制被稱為 DNA 損傷檢控點(diǎn)（DNAdamage checkpoint）。cdc25A 基因是 DNA 損傷檢控點(diǎn)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的效應(yīng)器。在細(xì)胞損傷修復(fù)過程中，ATM、ATR 和 Chk1、Chk2 通過限制 cdc25A 的活性和濃度，將 DNA 復(fù)制所需的 cdK2 活性保持在一個(gè)較低的水平，從而限制著 DNA復(fù)制進(jìn)行的速度，防止腫瘤的形成和基因突變。

28、本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果指出 XPD 基因有可能也通過了類似的途徑來抑制肝癌細(xì)胞的生長。本實(shí)驗(yàn)對(duì) XPD 基因抑制肝癌細(xì)胞生長的機(jī)制作了探討，可能的機(jī)制：(1)XPD 基因抑制癌基因 cmyc、cdC25A 基因的表達(dá)，從而抑制肝癌的增殖；(2)XPD 基因抑制 cdK2 基因的活性，從而抑制了尚未起始的 DNA 復(fù)制起始點(diǎn)的發(fā)動(dòng)，肝癌細(xì)胞周期停滯在 G1期，使細(xì)胞進(jìn)入 S 期發(fā)生障礙，細(xì)胞復(fù)制顯著減少；(3)已有研究指出 XPD 基因可以激活 p5310，p53 是抑癌基因，本實(shí)驗(yàn)組已證實(shí)它可以抑制肝癌細(xì)胞的生長3；p53 是 DNA 損傷檢控點(diǎn)中最關(guān)鍵的激活因子11，XPD 基因通過激活 p53，進(jìn)

29、一步激活 DNA 損傷檢控點(diǎn)；（4）過去的研究表明：XPD 基因發(fā)生突變時(shí)，DNA 損傷檢控點(diǎn)受到破壞12。野生型 XPD 基因可以激活 DNA 損傷檢控點(diǎn)，我們的實(shí)驗(yàn)指出 XPD 基因抑制了 cdc25A 的表達(dá)，肝癌細(xì)胞中 cdc25A 的表達(dá)量下調(diào)，從而使 cdK2 的表達(dá)更加減少，激活了 S 期 DNA 損傷檢控點(diǎn)，XPD 基因通過 DNA 損傷檢控點(diǎn)，防止腫瘤的形成和基因突變。我們的實(shí)驗(yàn)為以后 XPD基因抑制其他癌細(xì)胞生長提供了理論基礎(chǔ)，為肝癌及其他惡性實(shí)體瘤的綜合治療提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。但是 XPD 基因抑制肝癌生長的具體機(jī)制不是很清楚，還需要進(jìn)一步的研究。【參考文獻(xiàn)】【參考文獻(xiàn)】1Z

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