三種抗血小板藥物在體外對(duì)血小板活化的抑制作用研究

1、論著基金項(xiàng)目:國(guó)家衛(wèi)生部科學(xué)研究基金資助項(xiàng)目(96212261作者單位:100034北京大學(xué)第一醫(yī)院檢驗(yàn)科三種抗血小板藥物在體外對(duì)血小板活化的抑制作用研究王建中曹凌袁家穎王淑娟【摘要】目的探討阿司匹林、噻氯匹啶和西洛他唑三種藥物在體外對(duì)血小板活化的抑制作用。方法流式細(xì)胞術(shù)三色分析三種抗血小板藥物在體外對(duì)活化血小板膜表面纖維蛋白原受體(FI B 2R 和P 2選擇素(C D62P 表達(dá)的抑制作用。結(jié)果三種藥物對(duì)ADP 活化血小板膜表面FI B 2R 和C D62P 表達(dá)的抑制作用明顯不同,西洛他唑能顯著抑制FI B 2R 和C D62P 的表達(dá);噻氯匹啶抑制FI B 2R 表達(dá)的作用顯著,但對(duì)C

2、 D62P 表達(dá)的抑制較小;阿司匹林對(duì)FI B 2R 和C D62P 表達(dá)的抑制作用較差。結(jié)論與阿司匹林、噻氯匹啶相比,西洛他唑是一種較強(qiáng)的抗血小板活化藥物,既可抑制FI B 2R 的表達(dá)而降低血小板的聚集性,又可抑制血小板的釋放反應(yīng)而降低其促凝血活性,在血栓性疾病的防治中有重要作用?！娟P(guān)鍵詞】阿司匹林;血小板活化;流式細(xì)胞術(shù)Study on the action of three kinds of anti 2platelet drugs for in vitro inhibiting platelet activation WANG Jianzhong,C AO Ling ,YUAN Ji

3、aying ,WANG Shujuan.Peking Univer sity Fir st Hospital ,Beijing 100034,China【Abstract 】Objective T o study the action of aspirin ,ticlopidine and cilostazol in inhibiting platelet activation in vitro.Methods Three kinds of anti 2platelet drugs ,which inhibited the expression of fibrinogen receptor (

4、FI B 2R and P 2selectin (C D62P on activated platelets surface in vitro ,were analyzed by tri 2color flow cytometry.R esults Three kinds of anti 2platelet drugs inhibited the expression of FI B 2R and C D62P on ADP activating platelet membrane surface differently.Cilostazol could inhibit the express

5、ion of FI B 2R and C D62P of the platelets markedly.T iclopidine could inhibit the FI B 2R expression markedly ,but C D62P indistinctly.Aspirin could not inhibit the expression of either FI B 2R and C D62P on ADP activating platelets.Conclusion Cilostazol is a strong anti 2platelet drug as compared

6、with aspirin and ticlopidine.It could not only inhibit FI B 2R expression of activated platelets ,which can prevent platelet aggregation ,but als o decrease the release reaction and procoagulative activities of activated platelets.【K ey w ords 】Aspirin ;Platelet activation ;Flow cytometry血栓栓塞性疾病是當(dāng)前危

7、害人類健康,導(dǎo)致病死率最高的原因之一。預(yù)防血栓形成(防栓,治療血栓形成(治栓,將已形成的血栓溶解(溶栓,已成為當(dāng)前臨床上重要的防治方法1。血小板活化水平增高是導(dǎo)致血栓形成的重要因素。血小板的活化功能雖然對(duì)于止血是必不可少的,但其活化水平增高也是許多疾病,包括心肌梗死、卒中和不穩(wěn)定型心絞痛的重要發(fā)病機(jī)制2,3。有效的抗血小板藥物對(duì)于防栓、治栓是極為重要的。然而,目前常用的抗血小板藥物對(duì)血小板活化的抑制作用仍不十分清楚。血小板活化的特征是形態(tài)改變、纖維蛋白原受體(FI B 2R 表達(dá)和顆粒內(nèi)含物的釋放,從而導(dǎo)致血小板聚集和血小板血栓形成2。本研究通過(guò)體外試驗(yàn),觀察阿司匹林、噻氯匹啶和西洛他唑三種最

8、常用的抗血小板藥物對(duì)活化血小板膜表面FI B 2R 和P 2選擇素(C D62P 分子表達(dá)的抑制作用,進(jìn)一步探討其抗血小板活化的機(jī)制,為臨床更有效的選擇抗血小板活化藥物提供依據(jù)。材料和方法一、主要試劑與儀器11抗血小板藥物:西洛他唑(cilostazol ,原料藥,中國(guó)大冢制藥公司提供。噻氯匹啶(ticlopidine ,原料藥,法國(guó)賽洛菲制藥公司提供。阿司匹林(aspirin ,原料藥,Baker 公司產(chǎn)品。21試劑:單克隆抗體(McAb ,異硫氰酸熒光素 A 1陰性對(duì)照;B 11010m ol/L ;ADP 活化血小板圖1流式細(xì)胞術(shù)三色分析血小板活化熒光散點(diǎn)圖(FITC 標(biāo)記的抗血小板纖維

9、蛋白原受體(FI B 2R 的McAb (PAC 21FITC 。藻紅蛋白(PE 標(biāo)記的抗血小板P 2選擇素(C D62P PE ,又稱顆粒膜蛋白2140(G MP 2140的McAb 。Peridinin 葉綠素蛋白(peridinin chlorophyll protein ,PerCP 標(biāo)記的抗血小板膜糖蛋白a 的McAb (C D61PerCP 。藻紅蛋白標(biāo)記的鼠免疫球蛋白G (MIgG 1PE 。以上均為美國(guó)BD 公司產(chǎn)品。二磷酸腺苷(ADP ,美國(guó)Sigma 公司產(chǎn)品。RG DS 肽(FI B 2R 阻斷劑,人工合成的精氨酰2甘氨酰2天冬氨酰2絲氨酰多肽(RG DS 肽,配成5mg

10、/ml H 2O ,美國(guó)Sigma 公司產(chǎn)品。31流式細(xì)胞儀:FACS ort 型,美國(guó)BD 公司產(chǎn)品。二、方法11采血:取5名正常人空腹靜脈血,用106mm ol/L 枸櫞酸鈉真空抗凝管(美國(guó)BD 公司產(chǎn)品抗凝,血液與抗凝劑比例為91。21藥物與血小板作用:西洛他唑用N 1N 2二甲基酰胺(DMF 溶解,噻氯匹啶用生理鹽水溶解,阿司匹林用無(wú)水乙醇溶解,分別配制成20000、10000、2000、1000、200m ol/L ,各取5l ,分別加入445l 立即采集的抗凝血中輕輕混勻,置室溫10min 。另取各三種溶劑5l 作為對(duì)照,同上述操作。31ADP 活化血小板:在上述加入西洛他唑、噻氯

11、匹啶和阿司匹林的血液中各加入50l ADP (30m ol/L 并輕輕混勻,置37激活5min 。41熒光素標(biāo)記的抗血小板單克隆抗體免疫熒光染色:在陰性對(duì)照管中加PAC 21FITC 、RG DS 10l (5mg/ml 、MIgG 1PE 和C D61PerCP 各10l ,在測(cè)定管中加PAC 21FITC 、C D62P PE 和C D61PerCP 各10l ,再分別加入各種濃度藥物作用后并經(jīng)ADP 活化的血液5l 混勻,置室溫、避光反應(yīng)20min ,立即加入110ml 1%多聚甲醛(26混勻,4冰箱保存,24h 內(nèi)在流式細(xì)胞儀上分析。51流式細(xì)胞術(shù)(FC M 三色分析血小板:將上述用熒

12、光素標(biāo)記的抗血小板單克隆抗體免疫熒光染色的標(biāo)本在流式細(xì)胞儀上分析,以C D61PerCP/SSC 雙參數(shù)設(shè)定血小板門,分析FI B 2R (PAC 21和C D62P 陽(yáng)性血小板(見(jiàn)圖1百分率及其相對(duì)表達(dá)量(平均熒光強(qiáng)度,MFI 。三、抑制率計(jì)算各種不同濃度藥物和溶劑對(duì)照的血液標(biāo)本,經(jīng)FC M 分析獲得PAC 21和C D62P 陽(yáng)性血小板百分率及其相對(duì)表達(dá)量(平均熒光強(qiáng)度,按下式計(jì)算ADP 活化血小板表面FI B 2R 和C D62P 表達(dá)受藥物的抑制率。抑制率(%=1-陽(yáng)性血小板百分率×平均熒光強(qiáng)度(濃度藥物陽(yáng)性血小板百分率×平均熒光強(qiáng)度(溶劑對(duì)照×100%結(jié)

13、果11ADP 激活血小板膜糖蛋白變化:用不同濃度ADP (0、011、012、015、110、210、510、1010、2010m ol/L 加入正常人抗凝血液中輕輕混勻,37激活5min 后測(cè)定血小板膜表面FI B 2R 和C D62P 陽(yáng)性血小板百分率和平均熒光強(qiáng)度(MFI ,發(fā)現(xiàn)011m ol/L ADP 可致血小板明顯活化,其中部分熒光直方圖比較見(jiàn)圖2和圖3,1010m ol /LADP 即可使活化血小圖2不同濃度ADP 活化血小板膜纖維蛋白原受體(PAC 21表達(dá)熒光直方圖比較板膜表面FI B 2R 和C D62P 表達(dá)至峰值,FI B 2R 和C D62P 陽(yáng)性血小板百分率分別為(

14、89±6%和(84±8%。在上述濃度ADP 激活的血液標(biāo)本測(cè)定管中分別加入1010l RG DS 后再測(cè)定血小板膜表面FI B 2R 和C D62P 陽(yáng)性血小板百分率和MFI ,發(fā)現(xiàn)RG DS 能競(jìng)爭(zhēng)性抑制McAb PAC 21與活化血小 圖3不同濃度ADP 活化血小板顆粒膜蛋白CD62P 表達(dá)熒光直方圖比較板膜FI B 2R 的結(jié)合。21西洛他唑、噻氯匹啶和阿司匹林對(duì)活化血小板膜表面纖維蛋白原受體表達(dá)的抑制作用比較:5名正常人血液標(biāo)本與不同濃度西洛他唑、噻氯匹啶或阿司匹林作用后,經(jīng)ADP 活化血小板膜表面纖維蛋白原受體和C D62P 表達(dá)的平均抑制率變化見(jiàn)圖4和圖5 。圖

15、4三種抗血小板藥物對(duì)活化血小板表面纖維蛋白原 受體表達(dá)的抑制作用比較圖5三種抗血小板藥物對(duì)活化血小板表面CD62P 表達(dá)的抑制作用比較討論血小板可被多種因素激活,其活化的機(jī)制也不盡相同,但最終都是使血小板膜表面暴露纖維蛋白原受體(FI B 2R 并與纖維蛋白原結(jié)合使血小板聚集,從而導(dǎo)致血小板血栓形成。活化血小板胞漿中顆粒如顆粒等發(fā)生脫顆粒反應(yīng),顆粒內(nèi)含物釋放至血液中促進(jìn)血栓形成,而顆粒膜蛋白如P 2選擇素(C D62P 則暴露于血小板表面3。因此,本研究中選擇FI B 2R 和C D62P 作為分子標(biāo)志物,以流式細(xì)胞術(shù)(FC M 全血法、三色免疫熒光染色分析血小板活化水平3,4。從不同濃度的A

16、DP 激活的血小板膜表面FI B 2R 和C D62P 表達(dá)的動(dòng)態(tài)變化可見(jiàn),011m ol/L ADP 可致血小板明顯活化,1010m ol/L ADP 即可使活化血小板膜表面FI B 2R 和C D62P 表達(dá)至峰值3。為了使藥物對(duì)血小板活化的抑制作用觀察更為靈敏,故選擇310m ol/L ADP 濃度作為激活血小板的終濃度;ADP 活化血小板與FI B 2R 阻斷劑(RG DS 作用后則不能與FI B 2R 的單克隆抗體(PAC 21結(jié)合3。以上結(jié)果表明,FC M 檢測(cè)血小板表面FI B 2R 和C D62P 表達(dá)評(píng)價(jià)藥物抗血小板活化作用具有較高的靈敏度與特異性。本研究結(jié)果表明,三種藥物對(duì)

17、ADP 活化血小板膜表面FI B 2R 和C D62P 表達(dá)的抑制作用明顯不同,西洛他唑能顯著抑制FI B 2R 和C D62P 的表達(dá);噻氯匹啶對(duì)FI B 2R 表達(dá)的抑制作用顯著,但對(duì)C D62P 表達(dá)的抑制作用較小;阿司匹林對(duì)FI B 2R 和C D62P 表達(dá)的抑制作用較差。由此可見(jiàn),西洛他唑是一種較強(qiáng)的抗血小板活化藥物,既可抑制FI B 2R 的表達(dá)降低血小板的聚集性,又可抑制血小板的釋放反應(yīng)而降低其促凝血活性,從而起到防止血栓形成的作用。雖然西洛他唑作為一種較新的磷酸二酯酶抑制劑被美國(guó)食品與藥品管理局(FDA 批準(zhǔn)用于治療間隙性跛行5,但其抗血小板活化作用對(duì)防栓、治栓可能更有價(jià)值。

18、K oda 等6發(fā)現(xiàn)西洛他唑可使豬頸動(dòng)脈完全栓塞的時(shí)間明顯延長(zhǎng)、血小板聚集明顯抑制,而噻氯匹啶既不能使豬頸動(dòng)脈完全栓塞的時(shí)間延長(zhǎng),也對(duì)血小板聚集率抑制不顯著,表明西洛他唑?qū)τ谝种祁i動(dòng)脈血栓形成和防止腦缺血發(fā)作有重要作用。噻氯匹啶通過(guò)阻止纖維蛋白原結(jié)合到血小板膜上的受體而抑制血小板聚集1,7。本研究表明噻氯匹啶對(duì)ADP 活化血小板膜表面FI B 2R 表達(dá)有明顯的抑制作用,但對(duì)血小板釋放反應(yīng)的抑制作用小于西洛他唑。Y oon等8通過(guò)比較噻氯匹啶和阿司匹林(T +A與西洛他唑和阿司匹林(C+A組合應(yīng)用于300例冠狀動(dòng)脈擴(kuò)張術(shù)患者的治療,其術(shù)后血栓和出血等并發(fā)癥發(fā)生率兩者無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,認(rèn)為T+A與C

19、 +A在冠狀動(dòng)脈擴(kuò)張后抗栓治療具有同樣的功效,但C+A更安全、不導(dǎo)致中性粒細(xì)胞減少。因此,西洛他唑有可能取代噻氯匹啶用于抗血小板活化治療。阿司匹林是臨床最常用的抗血小板活化藥物,但在本次實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)對(duì)活化血小板膜表面FI B2R和C D62P表達(dá)的抑制作用較差,這有可能是由于阿司匹林抗血小板活化的機(jī)制與西洛他唑和噻氯匹啶不同所致。盡管阿司匹林在防止血管栓塞方面的作用已經(jīng)被充分的肯定,可以降低卒中、心肌梗死等的危險(xiǎn)性,但大約在10年前就已了解到噻氯匹啶比阿司匹林抗血小板活化更有效9。由于阿司匹林主要抑制血小板花生四烯酸代謝1,而噻氯匹啶則抑制血小板膜表面FI B2R表達(dá),故這兩種藥物常作為一種標(biāo)準(zhǔn)

20、的組合應(yīng)用于抗血栓治療8。參考文獻(xiàn)1王振義,李家增,阮長(zhǎng)耿,主編.血栓與止血2基礎(chǔ)理論與臨床.第二版.上海:上?？茖W(xué)技術(shù)出版社,1996.3962412.2Fabre J E,Nguyen M,Latour A,et al1Decreased platelet aggregation, increased bleeding time and resistance to thromboembolism in P2Y12 deficient mice1Nut M ed,1999,5:119921202.3王建中,曹凌,賀茂林,等.流式細(xì)胞術(shù)三色分析循環(huán)活化血小板及其在缺血性腦血管病中的臨床意義.中

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24、收稿日期:2001205218(本文編輯:張莉讀者來(lái)信建議統(tǒng)一應(yīng)用抗生素的英文縮略語(yǔ)王金良國(guó)內(nèi)期刊雜志(包括中華檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志抗菌藥物的縮略字應(yīng)用的不一致,給讀者帶來(lái)不便,也易發(fā)生誤解?，F(xiàn)建議統(tǒng)一應(yīng)用美國(guó)臨床微生物學(xué)雜志(Journal of Clinical Microbiology稿約中抗生素的英文縮略語(yǔ)。左氟沙星(lev ofloxacin LVX;linezolid(LNZ;洛美沙星(lomeflaxacin LOM;loracarbef(LOR;美羅培南(meropenem ME M;甲氧西林(methicillin MET;美洛西林(mezlocillin MEZ;米諾霉素(minocycline MI N;拉氧頭孢(m oxalactam M OX;莫西沙星(m oxifloxacin MXF;萘啶酸(nalidixic acid NA L;呋喃妥因(nitrofurantoin NIT;奈替米星(netilmicin NET ;諾氟沙星(norfloxacin NOR;氧氟沙星(ofloxacin OFX;苯唑西林(oxacillin OX A;青霉素(penicillin PE N;哌拉西林(piperacillin PFP;哌拉西林2他唑巴坦(piperacillin2tazobatam TZP;奎奴普汀