Chapter 固定化技術及其應用

1、Chapter 5 固定化技術及其應用 Section 1 固定化技術1、發(fā)展歷史： 1953年，德國的格魯布霍費（Grubhofer）和施萊思（Schleith）首次制成固定化酶。19691973年，日本的千畑一郎首次在工業(yè)生產上連續(xù)生產L-氨基酸、L-天冬氨酸，開創(chuàng)了固定化酶和固定化微生物細胞應用于工業(yè)生產的先例；1976年，法國首次用固定化酵母細胞生產啤酒和酒精。1978年，日本固定化枯草桿菌細胞生產-淀粉酶的研究取得成功。1986年，我國用固定化枯草桿菌原生質體生產堿性磷酸酶，用固定化黑曲霉原生質體生產葡萄糖氧化酶，用谷氨酸棒桿菌原生質體生產谷氨酸脫氫酶。2、優(yōu)勢 固定化細胞和固定化原

2、生質體以酶等各種代謝產物的生產為目的，可以代替游離細胞進行酶的發(fā)酵生產，具有提高產酶率、縮短發(fā)酵周期并可連續(xù)發(fā)酵生產等優(yōu)點，在酶的發(fā)酵生產中有廣闊的發(fā)展前景。 3、現(xiàn)狀 在工業(yè)上使用的固定化酶還僅限于葡萄糖異構酶、葡萄糖氧化酶和青霉素酰化酶等為數不多的十幾個酶種，仍需大力研究開發(fā)使更多的固定化酶和細胞能適用于工業(yè)規(guī)模生產。 Section 2 酶的固定化 為了解決酶的穩(wěn)定性較差、酶的一次性使用、酶的分離純化等困難，獲得的改善方法之一就是固定化技術的應用。固定化酶（Immobilized Enzyme）：固定在一定載體上并在一定的空間范圍內進行催化反應的酶。 酶的固定化：采用各種方法，將酶與水不

3、溶性載體結合，制備固定化酶的過程。（一）制備方法固定化酶的制備方法很多，常用的有吸附法、包埋法、結合法和交聯(lián)法。根據酶自身的性質、應用目的、應用環(huán)境來選擇固定化載體和方法。1）吸附法（adsorption）：利用各種固體吸附劑將酶吸附在其表面上固定的方法，是固定化中最簡單的方法?？煞譃槲锢砦椒ê碗x子吸附法。 物理吸附法（physical adsorption）：通過物理方法將酶直接吸附在水不溶性載體（纖維素、淀粉、面筋、活性炭、多孔玻璃、硅膠等）表面而使酶固定化的方法，是制備固定化酶最早采用的方法。 離子吸附法（ion adsorption）：通過離子鍵使酶與載體相結合的固定化方法。常用載體

4、有DEAE-纖維素、四乙氨基乙基(TEAE)-纖維素、CMC等。吸附容量一般大于物理吸附法。 吸附法制備固定化酶，操作簡便，條件溫和，載體廉價易得，且可反復使用。但結合力較弱，酶與載體結合不牢固而容易脫落。2）包埋法（entrapment）：將酶或含酶菌體包埋在各種多孔載體中，使酶固定化的方法。根據載體材料的不同，可分為凝膠包埋法和微膠囊包埋法。 凝膠包埋法：酶被包埋成網格型。常用的載體有天然凝膠、合成凝膠或樹脂等。 微膠囊包埋法：酶被包埋成微膠囊。常用于制造微膠囊的材料有聚酰胺、火棉膠、醋酸纖維素等。使酶存在于類似細胞內的環(huán)境中，可以防止酶的脫落，防止酶與微囊外的環(huán)境直接接觸，從而增加了酶的

5、穩(wěn)定性。3） 結合法(binding）：將酶與聚合物載體以共價鍵或離子鍵結合的固定化方法，是固定化酶研究中最活躍的一大類方法。用結合法制備的固定化酶，酶和載體之間結合相當牢固，即使用高濃度底物溶液或鹽溶液，也不會使酶分子從載體上脫落下來，具有酶穩(wěn)定性好、可連續(xù)使用較長時間的優(yōu)點。4） 交聯(lián)法（cross-linking）：借助雙功能試劑使酶分子之間相互交聯(lián)呈網狀結構的固定化方法。應用最廣泛的雙功能試劑是戊二醛。 以上四種固定化酶方法各有其優(yōu)缺點。往往一種酶可以用不同方法固定化，但沒有一種固定化方法可以普遍地適用于每一種酶。在實際應用時，常將兩種或數種固定化方法并用，以取長補短。（二）固定化酶的

6、優(yōu)缺點1、優(yōu)點：1）無需進行酶的分離純化，大大降低成本；2）提高了酶的穩(wěn)定性和對污染的抵抗力；3）細胞生長停滯時間短，反應快。2、缺點：1）固定化酶的活力有所損失；2）必須保持菌體的完整，需防止菌體的自溶；3）載體、細胞膜或細胞壁會造成底物滲透與擴散的障礙。Section 3 細胞的固定化固定化細胞：固定在一定載體上并在一定的空間范圍內進行生命活動的細胞。細胞的固定化：采用各種方法，將細胞與水不溶性載體結合，制備固定化細胞的過程。細胞固定化方法：吸附法、包埋法。（一）固定化微生物細胞的特點1、保持了細胞的完整結構和天然狀態(tài)，穩(wěn)定性好，可按照原來的代謝途徑進行新陳代謝，并進行有效的代謝調節(jié)控制。

7、2、發(fā)酵穩(wěn)定性好，可以反復使用或者連續(xù)使用較長的一段時間。3、密度提高，可以提高產率。（二）固定化植物細胞的特點1、由于有載體的保護作用，可提高植物細胞的存活率和穩(wěn)定性。2、細胞被束縛在一定的空間范圍內進行生命活動，不容易聚集成團。3、可反復使用或連續(xù)使用較長的一段時間，大大縮短生產周期，提高產率。4、易于與培養(yǎng)液分離，利于產品的分離純化，提高產品質量。（三）固定化動物細胞的特點1、由于有載體的保護作用，可提高動物細胞的存活率。2、動物細胞固定化后，可先在生長培養(yǎng)基中生長繁殖，使細胞在載體上形成最佳分布并達到一定的細胞密度后，轉移至發(fā)酵培養(yǎng)基，控制發(fā)酵條件，使細胞從生長期轉變到生產期，以利于提

8、高產率。3、可反復使用或連續(xù)使用較長的時間。4、易于與產物分開，利于產物分離純化，提高產品質量。Section4 原生質體的固定化 固定化細胞只能用于生產細胞外酶和其他能夠分泌到細胞外的產物；而且由于載體的影響、使營養(yǎng)物質和產物的擴散受到一定的限制；為解決這些問題，很多人從不同的角度進行研究。 微生物細胞和植物細胞除去細胞壁后，就可獲得原生質體。原生質體很不穩(wěn)定，容易破裂，若將原生質體用多孔凝膠包埋起來，制成固定化原生質體，由于有載體的保護作用，就會使原生質體的穩(wěn)定性提高，免至破裂。同時，固定化原生質體由于去除了細胞壁這一擴散障礙，有利于氧的傳遞、營養(yǎng)成分的吸收和胞內產物的分泌。 固定化原生質

9、體的制備主要包括原生質體的制備和原生質體固定化兩個階段。一、原生質體的制備將對數生長期的細胞收集起來，懸浮在含有滲透壓穩(wěn)定劑的高滲緩沖液中。然后加入適宜的細胞壁水解酶，在一定的條件下作用一段時間，使細胞壁破壞。分離除去細胞壁碎片、未作用的細胞以及細胞壁水解酶，而得到原生質體。要進行原生質體固定化，必須將微生物細胞和植物細胞的細胞壁破壞而分離出原生質體。同時要在破壞細胞壁的時候，不能影響到細胞膜的完整性，更不能使細胞內部的結構受到破壞，為此只能使用對細胞壁有專一性作用的酶。細菌原生質體制備時主要采用從蛋清中得到的溶菌酶；酵母細胞壁采用1,3-葡聚糖酶；霉菌的細胞壁需有幾丁質酶與其他有關酶共同作用

10、；植物細胞壁應用纖維素酶和果膠酶。二、原生質體固定化 原生質體制備好后，把離心收集到的原生質體重新懸浮在含有滲透壓穩(wěn)定劑的緩沖液中，配成一定濃度的原生質體懸浮液，然后采用包埋法制成固定化原生質體。 原生質體固定化一般采用凝膠包埋法。常用的凝膠有瓊脂凝膠、海藻酸鈣凝膠、角叉菜膠和光交聯(lián)樹脂等。 固定化原生質體具有下列特點。 由于解除了細胞壁這一擴散屏障，可增加細胞膜的通透性，有利于氧氣和營養(yǎng)物質的傳遞和吸收，也有利于胞內物質的分泌，可顯著提高產率。 由于有載體的保護作用，具有較好的操作穩(wěn)定性和保存穩(wěn)定性，可反復使用和連續(xù)使用較長的時間，利于連續(xù)化生產。在冰箱保存較長時間后仍能保持其生產能力。 易

11、于和發(fā)酵產物分開，有利于產物的分離純化，提高產品質量。 發(fā)酵的培養(yǎng)基中需要添加滲透壓穩(wěn)定劑，以保持原生質體的穩(wěn)定性。這些滲透壓穩(wěn)定劑在發(fā)酵結束后，可用層析或膜分離技術等方法與產物分離。 Section 5 固定化酶反應器酶反應器：以酶作為催化劑進行反應所需的裝置。根據酶催化劑類型的不同，分為游離酶反應器和固定化酶反應器。固定化酶反應器：攪拌罐型反應器、填充床式反應器、流化床式反應器、膜型反應器1攪拌罐型反應器分類：包括分批攪拌罐式反應器（BSTR）和連續(xù)流攪拌罐式反應器（CSTR）。連續(xù)流攪拌罐式反應器在運轉過程中，底物以恒定的流速流入反應器，與此同時，反應液則以同樣的流速流出反應器。反應桶內

12、裝有攪拌器，使反應組分與固定化酶顆?；旌暇?，出口處有過濾膜，可使不斷補充新鮮底物與反應液流量維持動態(tài)平衡。優(yōu)缺點：結構簡單，溫度和pH容易控制，造價較低，傳質阻力很小，反應能迅速達到穩(wěn)態(tài)，主要應用在飲料和食品工業(yè)中。其缺點是操作麻煩，在反復回收過程中固定化酶容易損失。2填充床式反應器 填充床式反應器(packed column reactor，PCR)是把顆粒狀或片狀固定化酶填充于填充床內，底物按一定方向以恒定速度通過反應床。它是一種單位體積催化劑負荷量多、效率高的反應器。當前工業(yè)上多數采用此類反應器。填充床式反應器可使用高濃度的催化劑，反應產生的產物和抑制劑可從反應器中不斷地流出。3流化床

13、式反應器流化床式反應器(fluidized bed reactor，F(xiàn)BR)是一種裝有較小顆粒的垂直塔式反應器(形狀可為柱形、錐形等)。底物以一定速度由下向上流過，使固定化酶顆粒在浮動狀態(tài)下進行反應。流體的混合程度可認為是介于CSTR和PFR之間。它具有下列優(yōu)點：具有良好的傳質及傳熱的性能，pH、溫度控制及氣體的供給比較容易；不易堵塞，可適用于處理黏度高的液體；能處理粉末狀底物；即使應用細粒子的催化劑，壓力降也不會很高。但其也有如下缺點：需保持一定的流速，運轉成本高，難于放大；由于顆粒酶處于流動狀態(tài)，因此易導致粒子的機械破損；由于流化床的空隙體積大，所以酶的濃度不高；由于底物的高速流動使酶沖出

14、，從而降低了轉化率。使底物進行循環(huán)是避免催化劑沖出、使底物完全轉化成產物的常用方法。也可以使用幾個流化床組成的反應器組或使用錐形流化床反應器。4膜型反應器 由膜狀或板狀固定化酶或固定化微生物組裝的反應器均稱為膜型反應器(membrane reactor，MR)。固定化酶膜型反應器是以膜作為固定化酶的載體，酶通過吸附、交聯(lián)、包埋、化學鍵合等方式被“束縛”在膜上，在進行酶促反應的同時，利用膜的選擇性透過作用，在有外推力(壓差、電位差等)的情況下，實現(xiàn)產品的分離、濃縮和酶的回收再利用。可以說酶膜反應器集催化反應、產物分級、分離與濃縮以及催化劑回收于一體。 第四節(jié) 固定化技術的應用（一）固定化酶的應用

15、固定化酶的優(yōu)點： 酶的穩(wěn)定性增加，減少溫度、pH值、有機溶劑和其他外界因素對酶的活力的影響，可以較長期地保持較高的酶活力。 固定化酶可反復使用或連續(xù)使用較長時間，提高酶的利用價值，降低生產成本。 固定化酶易于和反應產物分開，有利于產物的分離純化，從而提高產品質量。故此，固定化酶已廣泛地應用于食品、輕工、醫(yī)藥、化工、分析、環(huán)保、能源和科學研究等領域。1、固定化酶在工業(yè)生產中的應用：（1）氨基?；福菏澜缟系谝环N工業(yè)化生產的固定化酶。用結合法獲得固定化氨基?；负?，可以將L-乙酰氨基酸水解生成L-氨基酸，生產成本可節(jié)省40%。（2）葡萄糖異構酶：世界上生產規(guī)模最大的一種固定化酶。用結合法或交聯(lián)法獲

16、得固定化葡萄糖異構酶后，可以催化葡萄糖異構化生成果糖，用于連續(xù)生產果葡糖漿。（3）青霉素酰化酶：在醫(yī)藥工業(yè)上廣泛應用。用結合法獲得固定化青霉素?；?，可以催化青霉素水解生成6-氨基青霉烷酸（6-APA）。（4）天冬氨酸酶：采用包埋法制成固定化天冬氨酸酶，可將延胡索酸轉化生產L-天冬氨酸。（5）延胡索酸酶：采用包埋法制成固定化延胡索酸酶，可從延胡索酸制造L-蘋果酸。（6）乳糖酶：采用結合法制成固定化乳糖酶，可用于水解乳中存在的乳糖，生成半乳糖和葡萄糖，用于制造低乳糖奶。（7）天冬氨酸脫羧酶：采用包埋法制成固定化天冬氨酸脫羧酶，可催化L-天冬氨酸生成L-丙氨酸。 2固定化酶在酶傳感器方面的應用 研

17、究得最多、應用最廣泛的是酶電極，如葡萄糖氧化酶電極：用聚丙烯酰胺凝膠包埋法將葡萄糖氧化酶固定化，制成厚度為2050 m的酶膜，再與氧電極及使氧容易通過的聚四氟乙烯等高分子薄膜密切結合，組成葡萄糖氧化酶電極。使用時，把酶電極進入樣品溶液中，樣品液中的葡萄糖擴散到酶膜中，酶催化葡萄糖與氧反應，生成葡萄糖酸，使氧被消耗，再由氧電極測定氧濃度的變化，即可知道樣品中葡萄糖的濃度。 酶電極用于樣品組分的分析檢測，有快速、方便，靈敏、精確的特點。二、固定化微生物細胞的應用 固定化微生物細胞的應用范圍很廣，歸納起來主要用在兩個方面：一是利用固定化微生物細胞發(fā)酵生產各種胞外產物；二是利用固定化微生物細胞與各種電

18、極結合制成微生物電極。1利用固定化微生物生產各種產物：其中主要有下面幾類物質。(1)酒精酒類：固定化酵母等微生物可用于生產酒精、啤酒、葡萄酒、米酒等。(2)氨基酸：固定化氨基酸生產菌可用于生產谷氨酸、賴氨酸、精氨酸、瓜氨酸等氨基酸。(3)有機酸：固定化黑曲霉等微生物可生產蘋果酸、檸檬酸、葡萄糖酸、乳酸、醋酸等有機酸。(4)酶和輔酶：固定化微生物可用于生產-淀粉酶、糖化酶、蛋白酶、果膠酶、纖維素酶、溶菌酶等胞外酶，及輔酶A、ATP等輔酶。(5)抗生素：固定化微生物可用于生產青霉素、四環(huán)素、頭孢霉素、氨芐青霉素等抗生素。 (6)用于有機溶劑、維生素、化工產品等的生產，甾體轉化、廢水處理等。2固定化微生物細胞制造微生物傳感器微生物傳感器：由固定化微生物細胞與各種能量轉換器(電極、燃料電池、場效應管等)密切結合而成的傳感裝置，可分為呼吸活性測定型和電極活性測定型兩種。微生物傳感器應用范圍：用于測定可發(fā)酵性糖、葡萄糖、甲酸、乙酸、甲醇、乙醇、頭孢霉素、谷氨酸、氨、硝酸鹽、生化需氧量(BOD)、細胞數量等。三、固定化動物細胞的應用 1、生產疫苗：小兒麻痹癥疫苗、風疹疫苗、狂犬病疫苗、麻疹疫苗、肝炎疫苗、口蹄疫疫苗等；2、生產激素：生長激素、干擾素、胰島素、前列腺素、催乳激素、白細胞介素、促性腺激素等；3、生產血纖維溶酶原激活劑、膠原酶等酶類；4、生產抗菌肽等多肽藥物；5、生產