散發(fā)性錯配修復缺陷大腸癌的臨床及分子生物學特征

1、    散發(fā)性錯配修復缺陷大腸癌的臨床及分子生物學特征         摘要目的：探討散發(fā)性大腸癌中表現(xiàn)微衛(wèi)星不穩(wěn)定性(microsatellite instability,MSI)大腸癌的臨床病理和分子生物學特征。方法：79例未接受術前抗腫瘤治療的大腸癌根治術組織收入研究，分析14個微衛(wèi)星位點、K-ras基因和TGF-RII基因異常。結果：30/79例（38%）大腸癌顯示不同程度MSI。11/79（14%）顯示高度MSI(3 個位點)，其中9例（81%）顯示TGF-RII基

2、因（A）10處的框架移位，而只有1/10（10%）腫瘤帶有K-ras基因突變，這組患者有較好預后的傾向；低度MSI腫瘤在2位點中顯示MSI，其分子生物學特征與非MSI腫瘤無差異。結論：腫瘤示高度MSI的患者，其臨床病理及分子生物學特征與HNPCC相似，并有較好預后的傾向。應在診治過程中注意鑒別這組患者，積極治療。關鍵詞結腸腫瘤；直腸腫瘤；微衛(wèi)星不穩(wěn)定性；錯配修復中國書分類號文獻標識碼A文章編號1001-7399（2000）04-0290-04Clinical and molecular biological characters of sporadic mismatch repair defi

3、cient colorectal cancerSun Menghong(Dept of Pathol,Cancer Hospital,Shanghai Medical University,Shanghai200032)Johannes Gebert， Magnus von Knebel Doeberitz(Division of Molecular Diagnosis and Therapy,Dept of Surg, University of Heidelberg, Heidelberg, Germany)ABSTRACTPurposeTo analyze a patient subgr

4、oup with colorectal cancer(CRC) showing MSI (microsatellite instability) and compare the clinicopathological parameters with the molecular phenotype of their tumors. MethodsSeventy-nine tumors derived from CRC patients without adjuvant treatment were included in the study. Alterations in 14 mostly i

5、ntragenic microsatellite markers, mutations in the K-ras gene and the TGF-RII gene were studied. Results30/79 (38%) CRC displayed different level MSI, with 11/79 (14%) showing high level MSI (MSI3 loci in the loci studied). Major high level MSI tumors (9/11, 81%) had a frameshift mutation at (A)10,

6、while only 1 out 10 (10%) tumor possessed K-ras gene mutation. Patients with low level MSI and no MSI has no difference in their molecular characters and clinical phenotypes. ConclusionThe subgroup of patients with high MSI has similar clinicopathological behavior like HNPCC associated cancers such

7、as predominantly proximal tumor site, mucinous tumor type and a better prognosis than remaining sporadic CRC.KEY WORDScolon neoplasms; microsatellite instability (MSI)； mismatch repair 大腸癌分為遺傳性及散發(fā)性。遺傳性大腸癌包括HNPCC (hereditary nonpolyposis colorectal cancer)和FAP (familial adenomatous polyposis)等，在西方國家占

8、所有大腸癌的10%20%。其中大多數遺傳性大腸癌是HNPCC。散發(fā)性大腸癌中約15%無家族史者表現(xiàn)與HNPCC相似的分子遺傳學發(fā)病途徑14。作者對散發(fā)性大腸癌中表現(xiàn)微衛(wèi)星不穩(wěn)定性(microsatellite instability, MSI)大腸癌的臨床病理和分子生物學特征作一些探討。1材料與方法11材料收集19861988年德國海德堡大學外科醫(yī)院的79例接受大腸癌根治術患者腫瘤組織及其隨訪資料。術前均未經任何抗腫瘤治療。不包括符合HNPCC標準者。12PCR及電泳微解剖分離癌組織(癌細胞含量80%)及正常粘膜并用常規(guī)酚/氯仿法提取基因組DNA。14對引物用于在PCR中擴增含微衛(wèi)星重復序列的

9、片段。PCR產物在ALF自動測序儀行聚丙烯凝膠電泳。電泳結果用片段分析軟件（fragment manager, Pharmacia）分析5。13MSI的判斷參照Tibodeau6的標準：在正常組織的兩個條帶（峰）之外，至少有一個附加條帶（峰）。在兩個等位基因重疊時（not informative）, MSI的附加條帶出現(xiàn)在主條帶以外的區(qū)域。14K-ras及TGF-RII基因測序參見文獻5。15統(tǒng)計學分析采用2分析。2結果21MSI的發(fā)生頻率和型式30/79（38%）大腸癌顯示不同程度MSI。其中11/79(14%)顯示2個以上位點MSI。另19(24%)例腫瘤，9例在2個位點顯示MSI，10例

10、僅在1個位點上顯示MSI。我們將3位點MSI的稱為高度MSI，而2個位點的MSI稱為低度MSI(表1)。在14個微衛(wèi)星位點中，MSI出現(xiàn)的頻率不同。以高度MSI為例，NF1/2和D2S123位點示 100%的MSI，p53（5 bp重復序列）僅顯示10% MSI。在低度MSI中，除DCC2(50%)外，均示較低MSI頻率（表1）。MSI的型式也不同。在高度MSI中，一種MSI表現(xiàn)為在主峰周圍或離開主峰的多個小峰，第二種MSI表現(xiàn)為一個或一個以上與主峰幾乎一致的獨立于主峰之外的峰型。在低度MSI中， MSI的峰型多表現(xiàn)為在主峰旁的一個附加峰。無論在何種MSI其型式都是由大小不一的插入和缺失引起，

11、插入和缺失的范圍在222 bp之間，均為微衛(wèi)星重復單位或重復單位的整倍數。1示不同位點不同的MSI型式。2.2 LOH的發(fā)生頻率LOH在高度MSI腫瘤中少見。在僅有的5個LOH中，3個LOH分別出現(xiàn)hMLH1、 p53、 TAP1位點。另兩個LOH出現(xiàn)在同一腫瘤的p53、 TAP1位點上，似乎集中在p53和TAP1基因。在低度MSI腫瘤中，LOH的頻度很高，與非MSI腫瘤無區(qū)別。23TGF-RII基因和K-ras基因測序9/11（81%）腫瘤帶有TGF-RII基因(A)10的框架移位，其中8例為一個A缺失，1例為兩個A缺失。12例低度MSI和10例非MSI腫瘤均未顯示TGF-RII(A)10突

12、變。在10例高度MSI病例中，只有1/10（10%）顯示K-ras基因編碼子12的突變。16例非MSI腫瘤和7例低度MSI分別顯示較高ras基因突變率（6/16，35%；2/7，28%）。24MSI與臨床病理的關系帶有高度MSI表型的腫瘤多發(fā)于右半結腸（8/11，73%，P=0.002)；多為粘液腺癌（8/11，73%，P=0.003）。這組患者無家族史、無同時和異時腸內外腫瘤。19例低度MSI腫瘤與非MSI腫瘤以上指標未顯示有統(tǒng)計學上的差異。11例腫瘤顯示高度MSI的患者，與68例不顯示MSI和低度MSI的患者比較，患者術后生存率有較高的傾向，但未顯示統(tǒng)計學意義（P=0.07）。 

13、    1不同MSI型式A、B示高度MSI，A中附加為主峰周圍的小峰。B中為與主峰相似的附加峰。C、D示低度MSI。新增峰為主峰旁的一個附加峰。     表1高度和低度MSI腫瘤在各位點中的頻率次別D5S107BRCA1ACTCD18S34DCC2D3S1611D2S123NF1/1NF1/2NF2/1NF2/2P53RBTAP1高度MSI10/119/1010/1110/117/115/1111/119/118/87/86/81/109/115/10(%)919091916445100901008875108150低度MS

14、I4/200/204/205/2010/200/201/201/190/111/150/201/190/202/20(%)2002025500550705010     3討論 將這些腫瘤按其受累及的微衛(wèi)星位點多少區(qū)分為高度MSI(3個位點) 和低度MSI（2位點）腫瘤。兩組間存在以下的不同：（1）高度MSI腫瘤很少出現(xiàn)重要抑癌基因位點的LOH ，MSI出現(xiàn)在所檢大部分位點上，TGF-RII基因框架移位突變常見，而ras基因極少突變。低度MSI腫瘤的分子生物學特征與非MSI腫瘤差異無顯著性，表現(xiàn)為較高的LOH和ras基因突變率。（2）組織學類型：8/11

15、例高度MSI腫瘤為粘液腺癌或印戒細胞癌（P=0.002）。（3）腫瘤的部位：8/11例高度MSI腫瘤位于右半結腸(P=0.003)。（4）腫瘤的預后：高度MSI腫瘤的預后與其他兩組腫瘤相比有較好的傾向（P=0.07）。散發(fā)性大腸癌中這一組表現(xiàn)錯配修復功能缺陷的高度MSI腫瘤，其分子生物學特征、臨床病理表現(xiàn)及預后都與HNPCC的發(fā)病驚人地相似，在其他作者的研究中也發(fā)現(xiàn)這一現(xiàn)象4,6，7。關于這部分患者的來源，看法不一。一種認為這些是未歸類的HNPCC病人，因不符合HNPCC標準而無法診斷為HNPCC。但多數作者認為這是一組有別于HNPCC的亞群，因為他們無明顯家族史，發(fā)病年齡較高，雖然表現(xiàn)明顯的

16、錯配修復缺陷表型，但hMLH1和hMSH2基因很少出現(xiàn)生殖細胞突變，腫瘤組織中體細胞突變也不多見8。其發(fā)病可能通過其他不常見的錯配修復基因突變或目前還未認識的與錯配修復有關的基因受損。有研究證明錯配修復基因的高甲基化可能是這部分患者錯配修復缺陷及發(fā)病的原因9。在我們的研究中高度MSI病例數（14%）與文獻報道（15%左右）相似4, 6, 10。低度MSI腫瘤代表另一類大腸癌亞型。我們目前的分析無法將它們在臨床病理上與一般散發(fā)性大腸癌區(qū)分開來。根據這種微衛(wèi)星變化不出現(xiàn)在正常組織中這一事實，我們認為，單一附加峰有其特定的遺傳學意義。其機制及對大腸腫瘤的影響還有待于進一步認識。MSI有不同的基本型式

17、。這些不同峰型提示腫瘤細胞的錯配修復缺陷有不同的方式。這些小的峰值可能還提示腫瘤組織中存在不同的克隆，他們的微衛(wèi)星出現(xiàn)不同的變化，成為幾種并存的峰型。TGF-RII是由腸上皮細胞合成的膜受體，可識別TGF并與之結合，抑制上皮細胞生長、促進細胞分化。TGF-RII在HNPCC患者和高度MSI腫瘤中顯示很高的突變率。突變集中在第三外顯子的10個單堿基重復序列A中，在第七外顯子的GTGTGT中也可出現(xiàn)GT 插入。我們的研究證明81%高度MSI腫瘤攜帶(A)10的突變。1個A和2個A缺失分別導致不同的蛋白截短（編碼子161和129處）。TGF-RII 與TGF的結合點在肽鏈的-COOH端，截短蛋白的形

18、成使這一結合位點消失而喪失識別功能，從而使這些細胞逃避TGF 的生長抑制和促進分化作用，進入無限制生長。TGF-RII作為一種結腸癌抑癌基因，在90%的以微衛(wèi)星不穩(wěn)定性為發(fā)病途徑的腫瘤中突變。而這一突變發(fā)生于腺瘤重度非典型性增生腺癌的惡變過程中11。Grady發(fā)現(xiàn)，在15%表現(xiàn)高度MSI的病例帶有TGF-RII基因突變以外，另有15%非MSI大腸癌帶有這一基因突變。除此之外，55%微衛(wèi)星穩(wěn)定大腸癌顯示TGF-RII下游的TGF信號傳導受阻11。這說明，TGF和TGF-RII傳導通路受阻在散發(fā)性大腸癌發(fā)病中起重要作用。許寧建議，將RER (高度MSI) 作為亞臨床分型的依據，并在臨床用藥中注意R

19、ER腫瘤對某些藥物的耐藥性12。無疑高度MSI腫瘤的臨床病理、分子生物學特征和預后與一般散發(fā)性大腸癌不同，應該在診斷治療中注意區(qū)分，積極治療?；痦椖浚旱聡５卤?曼海姆腫瘤中心（Tumorzentrum Heidelberg/Mannheim, IV-I-2）和德國癌癥援助項目資助（Deutsche Krebshilfe 70-1940-Ge I）作者簡介：孫孟紅，女，39歲，醫(yī)學博士，助理研究員。研究方向：腫瘤分子病理學，主要研究大腸癌和淋巴瘤的分子病理學孫孟紅（上海醫(yī)科大學腫瘤醫(yī)院病理科分子病理室200032）J Gebert（Division of Molecular Diagnosi

20、s and Therapy, Dept of Surgery, University of Heidelberg, Heidelberg, Germany）M v Knebel Doeberitz（Division of Molecular Diagnosis and Therapy, Dept of Surgery, University of Heidelberg, Heidelberg, Germany）參考文獻1， 徐寧，徐莉，邱紅明. DNA復制錯誤與腫瘤. 臨床與實驗病理學雜志， 1999;15(3):5045052， 羅敏捷, 高玉彤, 來茂德. 檢測微衛(wèi)星不穩(wěn)定性的銀染色方法.

21、 臨床與實驗病理學雜志， 1998;14(2):1931943， 孫孟紅, 孫莉霞. 遺傳性非息肉癥性大腸癌及錯配修復基因. 臨床與實驗病理學雜志， 1999;15(suppl):58604， Kim H, Jen J, Vogelstein B et al. Clinical and pathological characteristics of sporadic colorectal carcinomas with DNA replication errors in microsatellite sequences. Am J Pathol, 1994；145:1481565， 孫孟紅,

22、Gebert J, M v Knebel Doeberitz. 散發(fā)性大腸癌腫瘤相關基因位點雜合性丟失分析. 中華實驗外科雜志, 1999;16(6):5255266， Tibodeau SN, Bren G， Schaid D. Microsatellite instability in cancer of the proximal colon. Science, 1993；260:8168197， Liu B, Nicolaides NC, Markotitz S et al. Mismatch repair gene defects in sporadic colorectal cancers with microsatellite instability. Nat Genet, 199