第2講放射性核素標(biāo)記化學(xué)物

1、l 放射性核素標(biāo)記化學(xué)物（Radionuclide labelled compouds）是指化學(xué)物分子中某一原子或某些原子被放射性核素原子所取代的化學(xué)物。放射性核素標(biāo)記化學(xué)物被廣泛用于醫(yī)學(xué)、生物科學(xué)研究中，放射性核素化合物作為一種示蹤劑和分析試劑，可用來研究物質(zhì)在機(jī)體內(nèi)的運(yùn)轉(zhuǎn)、代謝和分布、排泄。并可用來進(jìn)行機(jī)體微量物質(zhì)測定。是示蹤研究最重要的分析試劑和示蹤劑。一、放射性核素的選擇： 1 要不改變原化學(xué)物的理化和生物學(xué)特性；2 要與化學(xué)物結(jié)合牢固穩(wěn)定； 3 要有合適的物理半衰期； 4 射線容易測量； 5 其它要求二、幾個重要參數(shù)： 1 放射性濃度；2 放化純度；3 放射性比活度三、同位素與非同位

2、素標(biāo)記四、定位標(biāo)記與非定位標(biāo)記1放射性核素標(biāo)記物制備技術(shù)的特點(diǎn)：a 原料；b 標(biāo)記物的穩(wěn)定性；c 超微量技術(shù)；d 進(jìn)行冷試驗(yàn)；2常用的基本方法：a 同位交換法；b 化學(xué)合成法；c 生物合成法l放射性碘標(biāo)記化合物的制備l放射性碘制備分析試劑以125I應(yīng)用最廣，現(xiàn)90的放免試劑盒中的示蹤劑都是用125I標(biāo)記的，因?yàn)?25I具有二個重要的優(yōu)點(diǎn)，用125I標(biāo)記的化合物有足夠的穩(wěn)定性。碘的同位素有29種，其中23種是放射性同位素，它們具有很不同的物理特性，制備分析試劑以125I應(yīng)用最廣，因?yàn)?25I具有二個重要的優(yōu)點(diǎn)，一是半衰期（60天）允許標(biāo)記化合物可貯存應(yīng)用一段時間；二是它只發(fā)射28Kev能量的x射

3、線和5Kev的射線，無粒子， 因而輻射自分解少，標(biāo)記化合物有足夠的穩(wěn)定性。 蛋白質(zhì)、多肽碘化的基本反應(yīng)式 Na125I+氧化劑 125I HO-CH2CH-COOH+125I2-HO-CH2CH-COOH- NH2 NH2 上式表示通過氧化劑使碘化物（125I ）氧化成碘分子（ 125I 2）與蛋白質(zhì)分子中的酪氨酸殘基發(fā)生碘化作用，所以只要含有酪氨酸的化學(xué)物或人工地接上酪氨酸基團(tuán)的化合物都可用放射性碘標(biāo)記。蛋白質(zhì)分子中除含酪氨酸外，還有組氨酸和色氨酸殘基，有時也可生成碘化物，但它們的反應(yīng)性遠(yuǎn)不及酪氨酸，因此影響蛋白質(zhì)碘化效率的因素，主要取決于蛋白質(zhì)分子中酪氨酸殘基的數(shù)量及其在分子中的暴露程度，

4、另一方面，碘化物的用量、反應(yīng)條件（PH、溫度、反應(yīng)時間等）及氧化劑的性質(zhì)等也有影響。 (1) 氯胺-T法 (2) 乳過氧化物酶法 (3) 聯(lián)接標(biāo)記法 (4) 固相氧化法 氯胺-T法具有標(biāo)記效率高、重復(fù)性好、試劑便宜易得、是目前應(yīng)用最多的標(biāo)記方法。氯胺-T（Chloramine-T）是一種溫和的氧化劑，它的化學(xué)名是 氯代對苯磺酰胺鈉鹽，在水溶液中產(chǎn)生次氯酸，可使碘陰離子氧化成碘分子，反應(yīng)式如下： 在反應(yīng)試管中依次加入 GH 50g 50l 125I 2mCi 50l Ch-T 100g 50l 室溫反應(yīng)1分鐘 SM 200g 100l 1KI 1mg 100l 標(biāo)記反應(yīng)完成后用凝膠過濾等方法將1

5、25I-GH與游離的125I離子分離。a.氯胺-T水溶液遇光或暴露至空氣中很不穩(wěn)定，需要在臨用時配制；b.氯胺-T的用量，按氧化2mCi無載體的Na125I只需要0.15g， 而實(shí)際需要量大大超過此值，經(jīng)驗(yàn)認(rèn)為用2mCi新鮮無載體125I時，Ch-T用量約為100g。如用量過大，會明顯降低標(biāo)記化學(xué)物的免疫活性和生物活性，用量不足又降低標(biāo)記率，甚至標(biāo)記不上去，此外如碘溶液中含有保護(hù)劑（一般用Na2SO3等還原劑），因它需要消耗Ch-T，固用量就需要相應(yīng)加大。c.加入Ch-T后必須迅速混勻，以防止標(biāo)記不均勻，在0240C下，加入Ch-T 后的反應(yīng)時間一般為一分鐘左右，但也有延長至10分鐘的。d.加

6、入偏重亞硫酸鈉（SM）終止碘化反應(yīng)，SM的用量一般為Ch-T量的1.21.5倍就足夠。e.反應(yīng)體積要小，使微量的蛋白質(zhì)保持高濃度，才能保證一定的碘化效率， 含中等量酪氯酸的蛋白質(zhì)其濃度為300mg/ml時，碘化效率一般為80 90 ， 而如含50mg/ml時，則碘化效率可降至6070f.PH對碘化效率的影響：碘化反應(yīng)最適的PH依據(jù)蛋白質(zhì)的性質(zhì)而定，一般蛋白質(zhì)所需的PH為7.37.8，通常Na125I溶液中都含有相當(dāng)量的NaOH（可高達(dá)0.1M），因此所用的緩沖液必須具有足夠的緩沖容量，如常用0.20.5M磷酸鹽緩沖液。 利用乳過氧化物酶（LPO）有促進(jìn)微量過氧化氫對125I-的氧化作用， 生成

7、125I+并標(biāo)記在蛋白質(zhì)酪胺酸分子上。標(biāo)記方法如下：在反應(yīng)試管中依次加入： 蛋白質(zhì) 10g 50l Na 125I 12mCi 50l LPO 20100ng 50l H2O2 80150ng 50l（可分二次加入間隔710分鐘） 室溫下反應(yīng)1020分鐘 疏基乙醇 10mmol 500l 或PB 0.05M 1ml 終止反應(yīng)后用凝膠過濾法分離125I -蛋白質(zhì)與游離125I 。a.乳過氧化物酶的用量應(yīng)少于總蛋白質(zhì)用量的1，以減少酶自身碘化而帶入放射性雜質(zhì)，b.過氧化氫應(yīng)保持低濃度，如濃度高于0.1mM， 則對酶的活性有抑制作用。c.該法的主要優(yōu)點(diǎn)是反應(yīng)條件溫和，過氧化氫只需極低濃度（0.01m

8、M），能保持標(biāo)記化學(xué)物原有的生物活和免疫活性。不足之處是標(biāo)記率較低，一般為2040。 該法是先用Ch-T法將?；瘎?-(對羥基苯)丙酸-N琥珀亞胺脂 Bolton- Hunter試劑）碘化， 然后再用此?；瘎┡c蛋白質(zhì)分子中游離氨基酸相縮合而引入蛋白質(zhì)分子中，方法如下： 125I-酰化劑 510mol 吹干 蛋白質(zhì) 510g 50l 緩沖液 PH88.5 100l 水浴反應(yīng)1530分鐘 加入過量的甘氨酸，使剩余的125I-?；瘎┫牡舳K止反應(yīng)。優(yōu)點(diǎn)是：避免了蛋白質(zhì)與氧化劑直接接觸，可防止碘源中的有害物質(zhì)對蛋白質(zhì)的損傷，適用于標(biāo)記缺乏酪氨酸的蛋白質(zhì)或因酪氨酸在蛋白質(zhì)的活性中心，引入碘原子后會使

9、其失活。缺點(diǎn)是：操作較麻煩，需要二步反應(yīng)，125I的利用率較低，不宜標(biāo)記短肽，只適用于標(biāo)記分子量大于10000的蛋白質(zhì)。 本法是將氯甘脲（Iodogen）制成固相氧化劑，氯甘脲的化學(xué)名為1,3,4,6- 四氯3a,6a-二苯-甘脲。 它與氯胺-T同屬氯酰胺類化合物， 二者使I- 氧化的化學(xué)反應(yīng)本質(zhì)相同， 但I(xiàn)odogen在一定的PH及溫度范圍內(nèi)在水溶液中的溶解度極低， 固可制成固相催化劑，方法是取Iodogen 1mg用二氯甲烷1ml溶解后分裝成50l/管，放置反應(yīng)試管底部，微微加熱，使溶劑揮發(fā)后，在反應(yīng)試管底部就形成一層Iodogen薄膜， 蓋上塞子放入有干燥劑的塑料袋中于20c保存，可使用

10、半年。 取涂有Iodogen管 1支 0.5M PB PH7.6 100l Mc-Ab 50g 50l 125I 0.5mCi 10l 200C室溫反應(yīng)15分鐘 0.5M PH7.9 PB 150l終止反應(yīng) 反應(yīng)液用Sephadex G-100分離純化， Iodogen法是一種簡便、高效、廣譜的碘標(biāo)記方法，由于Iodogen被固定在試管壁上，與溶液中的標(biāo)記蛋白質(zhì)不直接接觸，這就減少了氧化劑對標(biāo)記物的損傷，使反應(yīng)更加溫和，簡化了操作步驟，每次標(biāo)記前無需配制氧化劑溶液，省去了用還原劑終止反應(yīng)一步，Iodogen法延長了反應(yīng)時間（15分鐘）， 這樣使反應(yīng)更容易控制。提高了標(biāo)記結(jié)果的重復(fù)性。是一種很有

11、生命力的標(biāo)記方法。 不論用何種方法制備，要想得到合格的標(biāo)記化學(xué)物，必須將反應(yīng)物仔細(xì)純化，標(biāo)記化學(xué)物在保存過程中也會出現(xiàn)一些不純的物質(zhì)，同樣需要再次純化，因此要求標(biāo)記化學(xué)物的放化純度大于95%，而且在示蹤過程中要穩(wěn)定。否則所得的示蹤結(jié)果不可靠。標(biāo)記率是指放射性核素被標(biāo)記到待標(biāo)記化學(xué)物上的量所占放射性核素總投入量的百分比：即標(biāo)記率=標(biāo)記物的放射性/投入的總放射性X100%標(biāo)記率的測定方法1放射性紙層析； 2薄層層析；3柱層析； 4蛋白沉淀法 標(biāo)記化學(xué)物的純化方法：色譜法或叫層析法，包括紙層析、薄板層析、柱層析等，柱層析又可分為離子交換法、凝膠過濾法、親和層析法，另外還有透析法、電泳法等等。 紙層析

12、是以層析紙作為固定相、以適當(dāng)?shù)恼归_液作為流動相，當(dāng)流動相沿著纖維素分子上行時，待測樣品（點(diǎn)在濾紙的下端）也隨之移動，由于樣品中各個組分的性質(zhì)不同，在固相的吸附能力和在流動相中的溶解度不同，因而各組分隨流動相移動的速度也就不同，也就是說各個組分在固定相上移動的距離不一樣，從而樣品中的各個組分能有效的分開 1 凝膠過濾法 凝膠過濾是利用凝膠把分子大小不同的物質(zhì)進(jìn)行分離的一種方法，常用的有葡聚糖凝膠（ Sephadex G ）系列， 分離標(biāo)記蛋白與游離碘時常用Sephadex G-25或G-50，然后再用G-100進(jìn)一步純化；這種即有離子交換作用又有凝膠過濾作用，純化效果較好，2 離子交換法 一般是

13、制成離子交換層析柱，適于分離短肽標(biāo)記物。3 親和層析法 利用蛋白質(zhì)與其特異抗體或受體的結(jié)合來分離純化標(biāo)記蛋白質(zhì)，此法特異性強(qiáng)，保持生物活性好，但操作較復(fù)雜。a.根據(jù)純化物的分子量適當(dāng)選用不同型號的葡聚糖凝膠或樹脂葡聚糖凝膠，后者分離效果比前者好；b.粒子粗細(xì)的選擇，一般選用中等大?。?0150）顆粒， 細(xì)顆粒比粗顆粒分離效果好； c.Sephadex G使用前用緩沖液浸泡24小時以上，使之充分膨脹，或在沸水中煮2小時； d.根據(jù)純化要求適當(dāng)選用層析柱，裝好的凝膠不可有氣泡、斜面及中間斷裂，平衡緩沖液內(nèi)應(yīng)加入防腐劑，防止霉菌的生長； e.層析柱使用前要充分平衡，要求平衡液的用量是柱床體積的34倍

14、； f.洗脫時流速不宜太快，每分鐘不超過0.5ml，一般每分鐘在0.20.3ml， 太快可造成分離不純； g.多數(shù)標(biāo)記多肽或蛋白在上柱分離前，應(yīng)先用蛋白（如BSA或兔血清等）， 以免標(biāo)記物吸附于柱上而受損失。 根據(jù)標(biāo)記物和放射性雜質(zhì)的分子量的大小不同，選擇孔隙合適的透析袋，將樣品置于透析袋中，并將其懸浮在較大體積的緩沖液中，在攪拌條件下，每6小時更換一次透析液，經(jīng)過24小時透析作用，較小分子的放射性雜質(zhì)基本上擴(kuò)散到透析袋之外，而大分子的標(biāo)記物則存留在透析袋之內(nèi)。能將標(biāo)記蛋白與小分子化學(xué)物很好的分離。本法簡便但較費(fèi)時。經(jīng)純化后的標(biāo)記化學(xué)物，要對其化學(xué)、生物學(xué)性能、質(zhì)量進(jìn)行鑒定，鑒定包括：1.放射

15、化學(xué)純度鑒定；2.放射性濃度；3.放射性比活度測定；4.生物活性和免疫活性測定等5.其它指標(biāo)：產(chǎn)品的總放射性活度、放射性濃度、以及測量的時間等。放射化學(xué)純度（Radiochemical Purity） 放射化學(xué)純度（）特定化學(xué)形態(tài)的放射性活度/樣品總放射性活度x100%放射化學(xué)純度受制備方法及原料的化學(xué)純度、產(chǎn)品存放條件等影響，一般放化純度控制在95以上。放射化學(xué)純度的檢測方法有：a.放射性紙層析和放射性薄層層析；b.放射性高效液相層析；c.凝膠電泳法。 放射性濃度：取1ml產(chǎn)品測其放射性活度，即為放射性濃度，單位為Bq/ml。 放射性比活度（Specific Activity）過去也稱比放射

16、性。放射性比活度放射性活度/單位化學(xué)量a.直接測定計算法：將純化后的標(biāo)記物配成合適的溶液，測量其放射性濃度(Bq/L)及其化學(xué)濃度(mmol/L)。放射性比活度=放射性濃度/化學(xué)濃度(Bq/mmol) b.估算法：設(shè)標(biāo)記時投入的待標(biāo)記物的質(zhì)量為W，投入的放射性核素的總活度為A，標(biāo)記率(即標(biāo)記原子的利用率)為Y，那么從理論上講該標(biāo)記化學(xué)物的比活度應(yīng)=AY/W。c.自身取代計算法 ：本法是根據(jù)體外竟?fàn)幗Y(jié)合的原理，間接地測定標(biāo)記物的比活度。l基本方法：l1.作一條常規(guī)的RIA標(biāo)準(zhǔn)曲線即在一系列試管中加入一定量的標(biāo)記抗原并加入不同量(由低向高)的非標(biāo)記抗原和限量抗體進(jìn)行竟?fàn)幮悦庖呓Y(jié)合反應(yīng)，然后將結(jié)合和

17、游離*Ag分離，分別測量F和B的放射性，以B/F為縱座標(biāo)，以不同量的非標(biāo)記抗原為橫座標(biāo)作標(biāo)準(zhǔn)曲線A；l2.同1，每管加入同量的標(biāo)記抗原和同量的抗體，但分別再加放不同量的標(biāo)記抗原，按1同樣的方法分離B、F并分別測量，繪制一條B/F對標(biāo)記抗原的自身取代曲線B，l3.由于兩條曲線所用的抗體的質(zhì)量完全相同，在B/F相同的情況下， 曲線A所對應(yīng)的抗原量和曲線B所對應(yīng)的標(biāo)記抗原量的放射性是等效的。 特異結(jié)合試驗(yàn)：a觀察標(biāo)記物與抗體的結(jié)合率，方法是用過量抗體與標(biāo)記抗原結(jié)合。結(jié)合率高說明標(biāo)記物的免疫活性好，b觀察標(biāo)記抗原與非標(biāo)記抗原對抗體的親和力。方法是用不同稀釋度的抗體分別與標(biāo)記抗原及與標(biāo)記抗原加非標(biāo)記抗原

18、的混合物進(jìn)行特異結(jié)合，其中混合抗原的總濃度要和單獨(dú)使用標(biāo)記抗原的濃度相同，(如單獨(dú)用標(biāo)記抗原為1.0ng，而混合抗原的總濃度亦為1.0ng，其中標(biāo)記抗原為0.1ng， 非標(biāo)記抗原為0.9ng)，比較兩者的結(jié)合率，如基本相同說明標(biāo)記抗原保持了原來親和力，在標(biāo)記過程中末受到明顯損傷。A為標(biāo)記抗原與抗血清的滴度曲線B為非標(biāo)記抗原(加入少量標(biāo)記抗原)的滴度曲線C與A相同，但標(biāo)記抗原免疫活性已有降低 1 蛋白質(zhì)、多肽分子上碘原子的參入量，由于將碘原子參入到蛋白質(zhì)的酪氨酸殘基中去，是非同位素標(biāo)記，對多數(shù)蛋白質(zhì)來說，碘化程度對其生物學(xué)性質(zhì)的保持有決定性的影響，每分子中引入的碘原子越少活性的改變也越小。 2

19、與酪氨酸殘基在蛋白質(zhì)分子中的地位有關(guān)，隨著蛋白質(zhì)碘化程度的提高，關(guān)鍵氨基酸殘基被碘化的可能性增加，因而失活的可能性也增加，對放免所用的分析試劑最好實(shí)現(xiàn)單碘標(biāo)記，這個比活度已能滿足靈敏度的需要。 3 氧化損傷 主要由氧化劑直接造成，也可由氧化生成的I2造成，氧化損傷主要涉及蛋白質(zhì)分子中的蛋氨酸、色氨酸殘基及二硫鍵，使用溫和的氧化劑及合理選用氧化劑的用量可減少氧化損傷，標(biāo)記物分離純化后加入適量的BSA 能有效的防止氧化損傷及放射線引起的輻射損傷。 4 輻射自分解 放射線可使標(biāo)記物自身發(fā)生電離輻射分解，這種輻射自分解可引起化學(xué)鍵的斷裂，其裂解產(chǎn)物還可通過結(jié)合、加成、聚合、取代等方式生成一些付產(chǎn)品，從而形成一此化學(xué)雜質(zhì)和放化雜質(zhì)。l由于放射性核素電離輻射作