吉林大學(xué)大學(xué)生生物試驗(yàn)技能競(jìng)賽比賽科目指引吉林大學(xué)

1、附件 1：吉林大學(xué)大學(xué)生生物實(shí)驗(yàn)技能競(jìng)賽比賽科目指南吉林大學(xué)大學(xué)生生物實(shí)驗(yàn)技能競(jìng)賽組織委員會(huì)二0四年三月Hucker 改進(jìn)的革蘭氏染色法鑒定微生物一、實(shí)驗(yàn)器材1、設(shè)備：顯微鏡尼康 YS100、YS2-H 2、材料：酒精燈、接種環(huán)、雙層瓶?jī)?nèi)裝香柏油和二甲苯 、載玻片、蓋 片、擦鏡紙、白紙、革蘭氏染色液結(jié)晶紫染液、碘液、 95%乙醇、番紅液、 生理鹽水3、菌種：1大腸桿菌； 2枯草芽孢桿菌二、實(shí)驗(yàn)步驟1、涂片取一塊潔凈載玻片，在載玻片的左、中、右 3 處各滴加一小滴無(wú)菌生理鹽 水，且均勻分布，用接種環(huán)以無(wú)菌操作方式分別從大腸桿菌和枯草芽孢桿菌斜 面上挑取少許菌苔于左、右一水滴中，從大腸桿菌斜面和枯

2、草芽孢桿菌斜面上 各挑取少許菌苔同置于中間一水滴中，分別混勻并涂成薄膜。2、枯燥室溫自然枯燥。3、固定涂面朝上，通過(guò)火焰 2-3 次。此操作目的是使細(xì)胞質(zhì)凝固，以固定細(xì)胞形態(tài)，并使之牢固附著在載玻片 上。4、初染滴加結(jié)晶紫液，以剛好將菌膜覆蓋為宜，染色 1-2min，水洗。5、媒染用碘液沖去殘水，并用碘液覆蓋約 1min，水洗。6、脫色用濾紙吸去玻片上的殘水，將玻片傾斜，在白色背景下，用滴管流加 95% 乙醇脫色，直至流出的乙醇無(wú)紫色時(shí)，立即水洗。7、復(fù)染用番紅液復(fù)染約2min，水洗。8、鏡檢枯燥后，用油鏡觀察，比擬。正確結(jié)果：菌體被染成深紫色的是革蘭氏陽(yáng)性菌，被染成紅色的是革蘭氏 陰性菌。三

3、、要求1、競(jìng)賽選題內(nèi)容應(yīng)在 2 小時(shí)內(nèi)完成；2、載玻片要潔凈無(wú)油跡；要用活潑生長(zhǎng)期的幼培養(yǎng)物做革蘭氏染色；涂片 不宜過(guò)厚，以免脫色不完全造成假陽(yáng)性；3、固定操作中，火焰不宜過(guò)熱，以玻片不燙手為宜；4、革蘭氏染色結(jié)果是否正確，乙醇脫色是革蘭氏染色操作的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。 色缺乏，陰性菌被誤染成陽(yáng)性菌；脫色過(guò)度，陽(yáng)性菌被誤染成陰性菌；脫色時(shí) 間一般為 20-30s；5、顯微鏡使用時(shí)，物鏡應(yīng)從低倍到高倍依次轉(zhuǎn)換；6、在顯微鏡視野下觀察出兩種菌大腸桿菌；枯草芽孢桿菌的形態(tài)，在 混菌中區(qū)分革蘭氏陰性菌和陽(yáng)性菌，并作圖；7、寫出實(shí)驗(yàn)報(bào)告，包括實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹⒃?、器材與材料、實(shí)驗(yàn)步驟、結(jié)果與討論胰蛋白酶比活力的測(cè)定、實(shí)

4、驗(yàn)原理胰蛋白酶能催化蛋白質(zhì)的水解，該酶對(duì)于由堿性氨基酸如精氨酸，賴氨 酸的羧基與其他氨基酸所形成的肽鍵具有高度專一性。本實(shí)驗(yàn)利用胰蛋白酶 能催化N-苯甲酰-L-精氨酸乙酯BAEE 水解生成N-苯甲酰-L-精氨酸BA 的原理，進(jìn)行胰蛋白酶的活力測(cè)定。由于BAEE在253nm處的紫外吸收遠(yuǎn)低于 BA，而BAEE在胰蛋白酶的催化下逐漸生成 BA，反響體系在253nm的紫外吸 收值隨之增加，因此可以以/ A253nm來(lái)計(jì)算胰蛋白酶的酶活力。胰蛋白酶的酶活力單位定義底物BAEE :在本實(shí)驗(yàn)條件下，以 BAEE為底物，每分鐘使/ A253nm增加0.001所需的酶量定義為1個(gè)酶活力單位。二、實(shí)驗(yàn)器材1、設(shè)

5、備：分光光度計(jì)UVmini-1240 、旋渦混合器QL-901、微量移液 器。2、材料：試管、試管架、石英比色皿、記號(hào)筆、槍頭1000微升、200微 升、10微升、5mL移液管、吸耳球、擦鏡紙、濾紙、洗瓶、燒杯。3、試劑：胰蛋白酶樣品濃度為 mg/mL，體積為Xml，需用Tris-HCI緩 沖液水自行稀釋指定倍數(shù)后測(cè)定這里可以指定幾個(gè)倍數(shù)，視實(shí)際酶活力 而定、0.05mol/L pH 7.8 Tris-HCl 緩沖液、2mmol/L BAEE。三、實(shí)驗(yàn)步驟1、取多支試管，分別標(biāo)號(hào)為1、2、3、4等，1號(hào)為空白組，其余為測(cè)定 組，按照表1順序參加各相關(guān)試劑。表1.胰蛋白酶活性測(cè)定加樣程序試劑/m

6、L空白組測(cè)定組0.05mol/L，pH 7.8 Tris-HCl 緩沖液1.51.5待測(cè)胰蛋白酶0.1去離子水0.12mmol/L BAEE1.51.5總體積3.13.12、以空白組校正A253nm值至0，測(cè)定組中參加底物液BAEE后，立即混合均勻，用比色皿在UVmini-1240分光光度計(jì)上測(cè)定光吸收值 A253nm，同時(shí)記錄 時(shí)間3、每間隔 1min 讀取 A 253nm 值一次，至 6min 終止讀數(shù)。4、 通過(guò)調(diào)節(jié)酶的濃度，控制測(cè)定組測(cè)得/ A253nm/min在之間數(shù)據(jù) 視為有效。5、計(jì)算每分鐘平均A253nm增加值即/ A253nm/min。/ A253nm =【(A6min-A

7、3min)/3 + (A 5min-A 2min)/3 + (A 4min-A 1min)/31 /3四、要求1 、競(jìng)賽選題內(nèi)容應(yīng)在 2 小時(shí)內(nèi)完成；2、微量移液器在吸取液體時(shí)防止平置、倒置等狀態(tài)，防止液體流入移液器 腔體內(nèi)；3、微量移液器用后要調(diào)至最大量程放置；4、測(cè)吸光度之前要分別用水和樣品潤(rùn)洗比色杯；5、濾紙用于吸干比色杯上殘留的液體，擦鏡紙用于擦試比色杯的光面；6、比色杯用完后要用水清洗干凈，并倒扣在平皿上；7、寫出實(shí)驗(yàn)報(bào)告，包括實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、原理、器材與材料、實(shí)驗(yàn)步驟、結(jié)果與 討論。8、實(shí)驗(yàn)報(bào)告需計(jì)算出/ A253nm/min、所用胰蛋白酶的總活力、胰蛋白酶的比活力離體蛙心及蟾蜍坐骨神經(jīng)

8、腓腸肌標(biāo)本制作一、實(shí)驗(yàn)器材1、材料：鐵支架共用、雙凹夾、竹試管夾、蛙板、玻璃板或光面瓷磚、 杭剪大剪刀 、組織剪、有齒組織鑷、眼科剪、眼科鑷、脊髓探針、玻璃分針、 器械盤、吸管、小燒杯、蛙心插管、手術(shù)線、培養(yǎng)皿。2、試劑：任氏液3、動(dòng)物：蟾蜍二、實(shí)驗(yàn)步驟1、破壞腦和脊髓 取蟾蜍一只，左手持蟾蜍，用食指按壓其頭部前端，拇指 按壓背部，使其脊柱伸直， 右手持脊髓探針從枕骨大孔處垂直向下刺入， 轉(zhuǎn)向前 刺入顱腔， 充分搗毀腦組織。 然后將探針退至枕骨大孔處， 轉(zhuǎn)向后刺入椎管搗毀 脊髓。此時(shí)如蟾蜍的四肢無(wú)肌張力、呼吸消失，即說(shuō)明腦和脊髓已破壞完全。將蟾蜍仰臥位置于蛙板上，用有齒組織鑷從劍突下夾起上腹部

9、皮膚 V 型剪 開；提起胸骨柄， V 型剪開胸骨并剪斷，暴露心臟；用眼科鑷夾起心包膜剪開 心包膜。2、心室插管 在左右主動(dòng)脈下穿一條手術(shù)線備用。用眼科剪在左主動(dòng)脈剪 一斜口， 將盛有任氏液的蛙心插管插入主動(dòng)脈， 至動(dòng)脈圓錐時(shí)略向后退， 于心室 收縮時(shí)經(jīng)主動(dòng)脈瓣進(jìn)入心室。假設(shè)插管成功，管內(nèi)液面會(huì)隨著心跳波動(dòng)。結(jié)扎、固 定插管，并將結(jié)扎線固定于插管側(cè)鉤上； 提起蛙心插管剪斷周圍血管等組織， 使 心臟離體。 吸凈插管內(nèi)血液， 用任氏液反復(fù)沖洗致液體澄清， 液面高度應(yīng)高于心 臟 1-2 厘米。3、剪除軀干上部和內(nèi)臟 將蟾蜍俯臥位置于蛙板上，左手在骶髂關(guān)節(jié)處提起 蟾蜍，使蟾蜍頭和內(nèi)臟自然下垂，右手持剪刀

10、，在骶髂關(guān)節(jié)水平上 1cm 處剪斷 脊柱，并沿脊柱兩側(cè)剪除一切內(nèi)臟和頭胸部，留下后肢、骶骨、脊柱以及緊貼于 脊柱兩側(cè)的坐骨神經(jīng)。4、皮膚剝離 用有齒組織鑷夾住脊柱斷端，右手提起其上的皮膚邊緣，用 力向下剝?nèi)ト亢笾钠つw，把標(biāo)本置于盛有任氏液的培養(yǎng)皿中。5、別離后肢 將標(biāo)本腹面朝上放于蛙板，沿正中線用杭剪沿脊柱和恥骨聯(lián)合正中線將標(biāo)本一分為二，將別離后的標(biāo)本浸入盛有任氏液的培養(yǎng)皿中。6、制備坐骨神經(jīng)腓腸肌標(biāo)本1游離坐骨神經(jīng) 用玻璃分針沿脊柱旁游離坐骨神經(jīng)，并沿坐骨神經(jīng)溝 繼續(xù)別離坐骨神經(jīng)至腘窩處。 用玻璃分針仔細(xì)剝離， 眼科剪剪斷坐骨神經(jīng)的所有 分支，然后用杭剪剪斷脊柱，僅保存約 1cm 與坐骨神經(jīng)相連的脊柱。2完成坐骨神經(jīng)小腿標(biāo)本 將已手術(shù)別離的坐骨神經(jīng)置于腓腸肌上，剪 掉膝關(guān)節(jié)以上的全部肌肉，然后在股骨中部用杭剪剪去上段股骨，保存約 1cm 的股骨，剩余的局部即為坐骨神經(jīng)小腿標(biāo)本。3完成坐骨神經(jīng)腓腸肌標(biāo)本將上述坐骨神經(jīng)小腿標(biāo)本在跟腱處穿線結(jié)扎后，于遠(yuǎn)心端剪斷跟腱。 游離腓腸肌至膝關(guān)節(jié)處， 然后用組織剪剪掉其余的小 腿局部