課題3　分解纖維素的微生物的分離 (6)

1、8(14分分)苯酚是工業(yè)生產(chǎn)排放的有毒污染物質(zhì)，自然界苯酚是工業(yè)生產(chǎn)排放的有毒污染物質(zhì)，自然界中存在著降解苯酚的微生物。某工廠產(chǎn)生的廢水中含中存在著降解苯酚的微生物。某工廠產(chǎn)生的廢水中含有苯酚，為了降解廢水中的苯酚，研究人員從土壤中有苯酚，為了降解廢水中的苯酚，研究人員從土壤中篩選獲得了只能降解利用苯酚的細菌菌株，篩選的主篩選獲得了只能降解利用苯酚的細菌菌株，篩選的主要步驟如圖所示，要步驟如圖所示，為土壤樣品。請回答下列問題：為土壤樣品。請回答下列問題：（2）為對照，微生物在為對照，微生物在中不生長，在中不生長，在中生長，中生長，與與培養(yǎng)基的主要區(qū)別在于培養(yǎng)基的主要區(qū)別在于 ；使；使 用用 法

2、可以在法可以在上獲得單菌落。采用固體上獲得單菌落。采用固體平板培養(yǎng)細菌時為什么進行倒置培養(yǎng)平板培養(yǎng)細菌時為什么進行倒置培養(yǎng)?碳源不同碳源不同 平板劃線平板劃線 避免培養(yǎng)過程產(chǎn)生的水分影響微生物的生長。避免培養(yǎng)過程產(chǎn)生的水分影響微生物的生長。有、無苯酚有、無苯酚 （3）如何比較不同菌株降解苯酚能力的大小）如何比較不同菌株降解苯酚能力的大小 （4）實驗過程中如何防止其它微生物的污染）實驗過程中如何防止其它微生物的污染 用相同濃度的苯酚培養(yǎng)液培養(yǎng)不同菌株，一定時用相同濃度的苯酚培養(yǎng)液培養(yǎng)不同菌株，一定時間后，測定培養(yǎng)液中苯酚的含量來確定。間后，測定培養(yǎng)液中苯酚的含量來確定。培養(yǎng)基滅菌，接種環(huán)境滅菌，

3、接種過程無菌操作。培養(yǎng)基滅菌，接種環(huán)境滅菌，接種過程無菌操作。 8(14分分)苯酚是工業(yè)生產(chǎn)排放的有毒污染物質(zhì)，自然界苯酚是工業(yè)生產(chǎn)排放的有毒污染物質(zhì)，自然界中存在著降解苯酚的微生物。某工廠產(chǎn)生的廢水中含中存在著降解苯酚的微生物。某工廠產(chǎn)生的廢水中含有苯酚，為了降解廢水中的苯酚，研究人員從土壤中有苯酚，為了降解廢水中的苯酚，研究人員從土壤中篩選獲得了只能降解利用苯酚的細菌菌株，篩選的主篩選獲得了只能降解利用苯酚的細菌菌株，篩選的主要步驟如圖所示，要步驟如圖所示，為土壤樣品。請回答下列問題：為土壤樣品。請回答下列問題：9. (16分分)焦化廠活性污泥中富含難降解的有機物苯甲焦化廠活性污泥中富含難

4、降解的有機物苯甲酰胼酰胼,是當前焦化行業(yè)環(huán)保治理的難點。某同學(xué)通過查是當前焦化行業(yè)環(huán)保治理的難點。某同學(xué)通過查閱資料發(fā)現(xiàn)可通過細菌生物降解方法處理焦化廠污染閱資料發(fā)現(xiàn)可通過細菌生物降解方法處理焦化廠污染物。請回答下列有關(guān)問題：物。請回答下列有關(guān)問題：(1) 目的菌的篩選：選擇目的菌應(yīng)該從目的菌的篩選：選擇目的菌應(yīng)該從_中篩選，在配制培養(yǎng)基時僅加入中篩選，在配制培養(yǎng)基時僅加入_作為碳源，作為碳源，從功能上講該培養(yǎng)基屬于從功能上講該培養(yǎng)基屬于_培養(yǎng)基培養(yǎng)基,所選目的所選目的菌的同化作用類型是菌的同化作用類型是_。(2) 優(yōu)質(zhì)菌株的馴化：欲要選出高效降解污染物的優(yōu)質(zhì)優(yōu)質(zhì)菌株的馴化：欲要選出高效降解污

5、染物的優(yōu)質(zhì)菌株，需采用逐步提高菌株，需采用逐步提高_的方法馴的方法馴化目的菌，培養(yǎng)出的目的菌株經(jīng)稀釋涂布分離后得到化目的菌，培養(yǎng)出的目的菌株經(jīng)稀釋涂布分離后得到_以備鑒定和使用。以備鑒定和使用。焦化廠活性污泥焦化廠活性污泥（焦化廠污染物）（焦化廠污染物）苯甲酰肼苯甲酰肼選擇選擇異養(yǎng)型異養(yǎng)型苯甲酰肼濃度苯甲酰肼濃度單一菌落單一菌落(3) 優(yōu)質(zhì)菌株優(yōu)質(zhì)菌株降解降解污染物污染物能力的測定：能力的測定：將分離得將分離得到的優(yōu)質(zhì)菌株到的優(yōu)質(zhì)菌株_到經(jīng)過到經(jīng)過_處理處理的污染物液體培養(yǎng)基中，在適宜條件下培養(yǎng)的污染物液體培養(yǎng)基中，在適宜條件下培養(yǎng),一一定時間后，定時間后，測定殘余污染物的濃度測定殘余污染物的

6、濃度。接種接種 滅菌滅菌課題背景纖維素：棉棉花花是自然界是自然界中纖維素含中纖維素含量最高的天量最高的天然產(chǎn)物；然產(chǎn)物；纖維素是地球上含量最豐富的纖維素是地球上含量最豐富的多糖類多糖類物質(zhì)，植物質(zhì)，植物每年產(chǎn)生的纖維素超過物每年產(chǎn)生的纖維素超過7070億噸；分布植物的億噸；分布植物的根、莖、葉中；根、莖、葉中；1 1、在草食性動物等的消化道內(nèi)，也、在草食性動物等的消化道內(nèi)，也共生有分解纖維素共生有分解纖維素的微生物的微生物，其原理也是產(chǎn)生纖維素酶而分解纖維素，其原理也是產(chǎn)生纖維素酶而分解纖維素，而人沒有分解纖維素的能力。而人沒有分解纖維素的能力。2 2、農(nóng)作物秸稈農(nóng)作物秸稈 等富等富含大量的纖

7、維素，被利用的機會很少、效率低；含大量的纖維素，被利用的機會很少、效率低； 纖維素生物燃料：纖維素生物燃料：最有希望替代石油能源最有希望替代石油能源 科學(xué)家正致力于研究，怎樣將科學(xué)家正致力于研究，怎樣將農(nóng)業(yè)廢棄物、木材及生長更為迅農(nóng)業(yè)廢棄物、木材及生長更為迅速的草本植物，速的草本植物，轉(zhuǎn)化為種類繁多轉(zhuǎn)化為種類繁多的生物燃料的生物燃料（甚至是航空燃油）。（甚至是航空燃油）。一、基礎(chǔ)知識一、基礎(chǔ)知識纖維素酶纖維素酶纖維二糖纖維二糖C C1 1酶、酶、CxCx酶酶葡萄糖苷酶葡萄糖苷酶葡萄糖葡萄糖纖維素纖維素一、基礎(chǔ)知識一、基礎(chǔ)知識閱讀閱讀P27頁：頁： 在在2支支20mL的試管中，分別放入的試管中，

8、分別放入16cm的的濾紙條濾紙條（或復(fù)印紙），（或復(fù)印紙），再分別加入再分別加入pH為為4.8、物質(zhì)的量濃度為物質(zhì)的量濃度為0.1mol/L的醋酸的醋酸-醋酸鈉醋酸鈉緩沖液緩沖液10mL、11mL。在加入在加入10mL緩沖液的試管緩沖液的試管中中加入加入1mL纖維素酶纖維素酶（7080U/mL）。將）。將2支試支試管固定在管固定在50mL的錐形瓶中，在搖床上以的錐形瓶中，在搖床上以140r/min的轉(zhuǎn)速振蕩反應(yīng)的轉(zhuǎn)速振蕩反應(yīng)1h，觀察結(jié)果觀察結(jié)果。圖。圖2-12 旁欄：旁欄：1U表示表示1個個酶活力單位，是指在溫酶活力單位，是指在溫度為度為25，其他反應(yīng)，其他反應(yīng)條件，如條件，如pH等，均為等

9、，均為最適的情況下，在最適的情況下，在1min內(nèi)轉(zhuǎn)化內(nèi)轉(zhuǎn)化1mmol的的底物所需的酶量。底物所需的酶量。濾紙條（纖維素）濾紙條（纖維素） 葡萄糖葡萄糖纖維素酶纖維素酶在一支試管中添加纖維素酶，在一支試管中添加纖維素酶，另一支試管不添加纖維素酶；另一支試管不添加纖維素酶；思考思考1實驗分析：實驗分析：P27頁的頁的小實驗是如何構(gòu)成對照的？小實驗是如何構(gòu)成對照的？濾濾紙紙崩崩潰潰法法（二）纖維素分解菌的篩選（二）纖維素分解菌的篩選（閱讀（閱讀P28頁頁3、4段）段）1、篩選纖維素分解菌的方法、篩選纖維素分解菌的方法_。該方法可以通過該方法可以通過_反應(yīng)直接篩選。反應(yīng)直接篩選。剛果紅染色法剛果紅染色

10、法顏色顏色2、其原理是：剛果紅（、其原理是：剛果紅（CR）可以與纖維素形成）可以與纖維素形成_，當纖維素被，當纖維素被_分解后，分解后，紅色復(fù)合物無法形成，出現(xiàn)以紅色復(fù)合物無法形成，出現(xiàn)以_為中心的為中心的_，可以通過，可以通過_ 來篩選纖維素分解菌。來篩選纖維素分解菌。紅色復(fù)合物紅色復(fù)合物纖維素酶纖維素酶纖維素分解菌纖維素分解菌 透明圈透明圈是否產(chǎn)生透明圈是否產(chǎn)生透明圈可根據(jù)是否可根據(jù)是否產(chǎn)生產(chǎn)生透明圈透明圈來篩選纖維來篩選纖維素分解菌素分解菌練一練：練一練：1.1.下列關(guān)于纖維素酶的說法，錯誤的是下列關(guān)于纖維素酶的說法，錯誤的是A. 纖維素酶是一種復(fù)合酶，至少包括三種纖維素酶是一種復(fù)合酶，

11、至少包括三種B. 纖維素酶可把纖維素分解成葡萄糖纖維素酶可把纖維素分解成葡萄糖C. 纖維素酶可用于去掉植物的細胞壁纖維素酶可用于去掉植物的細胞壁D. 葡萄糖苷酶可把纖維素分解成葡萄糖葡萄糖苷酶可把纖維素分解成葡萄糖2.利用剛果紅法可以篩選出纖維素分解利用剛果紅法可以篩選出纖維素分解菌，下列說法錯誤的是菌，下列說法錯誤的是A. 剛果紅能與纖維素形成紅色復(fù)合物剛果紅能與纖維素形成紅色復(fù)合物 B. 剛果紅能與纖維二糖形成紅色復(fù)合物剛果紅能與纖維二糖形成紅色復(fù)合物 C. 剛果紅不能與葡萄糖形成紅色復(fù)合物剛果紅不能與葡萄糖形成紅色復(fù)合物D. 若培養(yǎng)基上產(chǎn)生了透明圈，則說明已篩若培養(yǎng)基上產(chǎn)生了透明圈，則說

12、明已篩選出了纖維素分解菌選出了纖維素分解菌土壤土壤取樣取樣選擇選擇培養(yǎng)培養(yǎng)樣品樣品梯梯度度稀釋稀釋將樣品涂將樣品涂布到布到鑒別鑒別培養(yǎng)基培養(yǎng)基挑選挑選菌落菌落計數(shù)計數(shù)到什到什么樣么樣的環(huán)的環(huán)境取境取樣樣?培養(yǎng)的目的培養(yǎng)的目的? ? 選擇培養(yǎng)基的選擇培養(yǎng)基的特點特點? ? ( (這步可省略這步可省略不做）不做）挑選什挑選什么樣的么樣的菌落菌落? ?鑒別培養(yǎng)基鑒別培養(yǎng)基的特點的特點? ?如何鑒別如何鑒別? ?根據(jù)根據(jù)微生物對微生物對生存環(huán)境的要生存環(huán)境的要求，到相應(yīng)環(huán)求，到相應(yīng)環(huán)境中去找；境中去找；目的：目的：增加纖維增加纖維素分解菌的濃度，素分解菌的濃度，以確保從樣品中分以確保從樣品中分離到所需

13、要的微生離到所需要的微生物；物；培養(yǎng)基以纖培養(yǎng)基以纖維素作為唯一碳源。維素作為唯一碳源。剛果紅染色法，剛果紅染色法，通過顏色反應(yīng)來通過顏色反應(yīng)來篩選菌落篩選菌落二、二、實驗設(shè)計實驗設(shè)計閱讀閱讀P28旁欄旁欄閱讀閱讀P29操作提示操作提示1、纖維素分解菌選擇培養(yǎng)基、纖維素分解菌選擇培養(yǎng)基屬于屬于_（固體、液體）培（固體、液體）培養(yǎng)基，原因是養(yǎng)基，原因是_【資料二】選擇培養(yǎng)【資料二】選擇培養(yǎng)閱讀資料二閱讀資料二“選擇培養(yǎng)基選擇培養(yǎng)基”，回答以下幾問題：，回答以下幾問題：液體液體沒有添加瓊脂沒有添加瓊脂2、該培養(yǎng)基對微生物、該培養(yǎng)基對微生物_（具有，不具有）選擇作用。（具有，不具有）選擇作用。如果具

14、有，其選擇機制是如果具有，其選擇機制是_ 具有具有 以以纖維素粉為唯一纖維素粉為唯一碳源，能碳源，能分解纖維素的微生物可以大分解纖維素的微生物可以大量繁殖；量繁殖；【資料一】土壤取樣【資料一】土壤取樣設(shè)置一個對照組，控制的變量是將培養(yǎng)基的_改為_。3、你能否設(shè)計一個對照實驗，說明選擇培養(yǎng)基、你能否設(shè)計一個對照實驗，說明選擇培養(yǎng)基的作用？的作用？葡萄糖葡萄糖纖維素粉纖維素粉培養(yǎng)后選擇培養(yǎng)基只有纖維素分解菌培養(yǎng)后選擇培養(yǎng)基只有纖維素分解菌培養(yǎng)基組成培養(yǎng)基組成提供的主要營養(yǎng)物質(zhì)提供的主要營養(yǎng)物質(zhì)CMC-Na 510g主要碳主要碳源源酵母膏酵母膏 1g碳源、氮源、生長因子碳源、氮源、生長因子KH2PO

15、4 0.25g無機鹽無機鹽土豆汁土豆汁 100mL碳源、生長因子碳源、生長因子瓊脂瓊脂 15g凝固劑凝固劑上述物質(zhì)溶解后，加蒸上述物質(zhì)溶解后，加蒸餾水定容至餾水定容至1000mL氫元素、氧元素氫元素、氧元素鑒別鑒別纖維素分解菌的培養(yǎng)基纖維素分解菌的培養(yǎng)基（固體還是液體培養(yǎng)基？）（固體還是液體培養(yǎng)基？）(水溶性羧甲基纖維素鈉水溶性羧甲基纖維素鈉)【資料三】剛果紅染色法【資料三】剛果紅染色法方法一：方法一：先培養(yǎng)微生物，再加入先培養(yǎng)微生物，再加入剛果紅進行顏色反應(yīng)（后置染色剛果紅進行顏色反應(yīng)（后置染色法）法）方法二：方法二：在倒平板時就加入剛果紅在倒平板時就加入剛果紅（前置染色法）（前置染色法）挑

16、選產(chǎn)生明顯透明圈的菌落，即為分解纖維挑選產(chǎn)生明顯透明圈的菌落，即為分解纖維素的菌落。素的菌落。染色法染色法優(yōu)點優(yōu)點缺點缺點后置染后置染色法色法 前置染前置染色法色法 顯示的顏顯示的顏色反應(yīng)色反應(yīng)基本上就是基本上就是纖維纖維素分解菌的作用素分解菌的作用 操作繁瑣，剛果紅會操作繁瑣，剛果紅會使菌落間使菌落間發(fā)生混雜發(fā)生混雜操作簡便操作簡便，不存在菌落不存在菌落混雜問題混雜問題使產(chǎn)生淀粉酶的微生物使產(chǎn)生淀粉酶的微生物也產(chǎn)生模糊透明圈，也產(chǎn)生模糊透明圈，出出現(xiàn)假陽性反應(yīng)現(xiàn)假陽性反應(yīng)，也有些，也有些微生物能降解色素，也微生物能降解色素，也形形成明顯的透明圈。成明顯的透明圈。？ P29頁旁欄思考：這兩種方

17、法各有哪頁旁欄思考：這兩種方法各有哪些優(yōu)點與不足？些優(yōu)點與不足？? ?旁欄思考旁欄思考P28P28 1. 1.本課題先通過選擇培養(yǎng)，使纖維素分解本課題先通過選擇培養(yǎng)，使纖維素分解菌增殖后，再將菌液梯度稀釋涂布在鑒別培養(yǎng)菌增殖后，再將菌液梯度稀釋涂布在鑒別培養(yǎng)基上。其他步驟基本相同?；稀Ｆ渌襟E基本相同。 2 2、此環(huán)境的纖維素分解菌含量相對高，這、此環(huán)境的纖維素分解菌含量相對高，這樣獲得菌株的機率高。樣獲得菌株的機率高。 3 3、能使纖維素分解菌相對聚集。應(yīng)該埋在、能使纖維素分解菌相對聚集。應(yīng)該埋在深約深約10cm10cm的腐殖土中。的腐殖土中。P29P292 2、能夠使適應(yīng)這種營養(yǎng)條件的微

18、生物迅速繁、能夠使適應(yīng)這種營養(yǎng)條件的微生物迅速繁殖，而那些不適應(yīng)的微生物的繁殖被抑制。殖，而那些不適應(yīng)的微生物的繁殖被抑制。三、操作提示（閱讀三、操作提示（閱讀P29P29頁）頁）四、結(jié)果分析與評價四、結(jié)果分析與評價 1.1.如何判斷培養(yǎng)基的制作是否合格以及選擇培養(yǎng)基如何判斷培養(yǎng)基的制作是否合格以及選擇培養(yǎng)基是否篩選出菌落？是否篩選出菌落？ 空白空白對照組的培養(yǎng)基在培養(yǎng)過程中沒有菌落生長對照組的培養(yǎng)基在培養(yǎng)過程中沒有菌落生長則說明培養(yǎng)基制作合格。則說明培養(yǎng)基制作合格。 如果觀察到產(chǎn)生透明圈的菌落，則說明可能獲得如果觀察到產(chǎn)生透明圈的菌落，則說明可能獲得了分解纖維素的微生物。了分解纖維素的微生物。 為了進一步確定分離得到的是纖維素分解為了進一步確定分離得到的是纖維素分解菌，還需要進行菌，還需要進行_實驗，纖維素實驗，纖維素酶的發(fā)酵方法有酶的發(fā)酵方法有_ _ 發(fā)酵和發(fā)酵和_ _ 發(fā)酵。發(fā)酵。纖維素酶的測定方法是對纖維素酶分解濾紙等纖維素酶的測定方法是對纖維素酶分解濾紙等纖維素所產(chǎn)生的纖維素所產(chǎn)生的_ _ 含量進行定量測定。含量進行定量測定。發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶 液