酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)流程

1、模塊七 蛋白質(zhì)之間的相互作用1. 實(shí)驗(yàn)?zāi)康谋緦?shí)驗(yàn)以重組質(zhì)粒和酵母細(xì)胞為材料, 學(xué)習(xí)檢測蛋白質(zhì)相互作用的基本原理和技術(shù)方法。 主要介 紹酵母雙雜交的基本原理與操作技術(shù); 讓學(xué)生了解和掌握酵母雙雜交系統(tǒng)的應(yīng)用; 掌握酵母感受態(tài)的 制備的基本原理和主要的操作步驟。2. 實(shí)驗(yàn)原理1989年 Fields 和 Song 等人根據(jù)當(dāng)時(shí)人們對真核生物轉(zhuǎn)錄起始過程調(diào)控的認(rèn)識(即細(xì)胞內(nèi)基因轉(zhuǎn) 錄的起始需要轉(zhuǎn)錄激活因子的參與 ,提出并建立了酵母雙雜交系統(tǒng)。該系統(tǒng)作為發(fā)現(xiàn)和研究活細(xì)胞 體內(nèi)的蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)之間的相互作用的技術(shù)平臺,近幾年得到了廣泛的運(yùn)用和發(fā)展。相比于其它蛋白質(zhì)篩選系統(tǒng),酵母雙雜交系統(tǒng)具有以下優(yōu)點(diǎn):(

2、1檢測在真核活細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行,在 一定程度上代表細(xì)胞內(nèi)的真實(shí)情況。 (2作用信號是在融合基因表達(dá)后,在細(xì)胞內(nèi)重建轉(zhuǎn)錄因子的作 用而給出的,省去了純化蛋白質(zhì)的繁瑣步驟。 (3檢測結(jié)果是基因表達(dá)產(chǎn)物的積累效應(yīng),因而可檢測 存在于蛋白質(zhì)之間的微弱或暫時(shí)的相互作用。 (4酵母雙雜交系統(tǒng)可采用不同組織、器官、細(xì)胞類型 和分化時(shí)期材料構(gòu)建 cDNA 文庫,能分析細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核及膜結(jié)合蛋白等多種不同亞細(xì)胞部位及功 能蛋白。 (5 通過 mRNA 產(chǎn)生多種穩(wěn)定的酶使信號放大。同時(shí),酵母表型、 X-Gal 及 HIS3 蛋白表 達(dá)等檢測方法均很敏感。酵母雙雜交系統(tǒng)也具有一定的局限性。 首先, 經(jīng)典的雙雜交系統(tǒng)分析蛋

3、白間的相互作用定位于細(xì) 胞核內(nèi), 因而限制了該系統(tǒng)對某些細(xì)胞外蛋白和細(xì)胞膜受體蛋白的研究。 酵母雙雜交系統(tǒng)的另一個局 限性是“假陽性” 。在酵母雙雜交系統(tǒng)建立的初期階段,由于僅僅采用 -半乳糖苷酶這一單一的報(bào)告 基因體系,這種報(bào)告基因的表達(dá)往往不能十分嚴(yán)謹(jǐn)?shù)乇豢刂?因此容易產(chǎn)生假陽性。由于某些蛋白本 身具有激活轉(zhuǎn)錄的功能或在酵母中表達(dá)時(shí)發(fā)揮轉(zhuǎn)錄激活作用, 使 DNA 結(jié)合結(jié)構(gòu)域融合蛋白在無特異 激活結(jié)構(gòu)域的情況下也可被激活轉(zhuǎn)錄。 另外某些蛋白表面含有對多種蛋白質(zhì)的低親和力區(qū)域, 能與其 他蛋白形成穩(wěn)定的復(fù)合物,從而引起報(bào)告基因的表達(dá),產(chǎn)生“假陽性”結(jié)果。產(chǎn)生“假陰性”結(jié)果的 原因可能有許多蛋白

4、質(zhì)間的相互作用依賴于翻譯后加工如糖基化、 磷酸化和二硫鍵形成, 還有些蛋白 的正確折疊和功能有賴于某些非酵母蛋白的輔助等?，F(xiàn)在的酵母雙雜交系統(tǒng)大都采用多種報(bào)告基因,如 AH109酵母株含有三類報(bào)告基因 ADE2、 HIS3、 MEL1/lacZ,這三類報(bào)告基因受控于三種完全不同、異源性的 GAL4-反應(yīng)元件和三類啟動子元 件 -GAL1、 GAL2以及 MEL1(如圖 6-1-1 。通過這種方法就消除了兩類最主要的假陽性,一類是融 合蛋白可以直接與 GAL4結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合或者是在結(jié)合位點(diǎn)附近結(jié)合所帶來的假陽性; 另一類是融合蛋 白和某種轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合后再結(jié)合到特定的 TA TA 盒上所帶來的假陽性

5、。 ADE2一種報(bào)告基因就已經(jīng)能 夠提供較強(qiáng)的營養(yǎng)選擇壓力,這時(shí)選擇性地使用 HIS3報(bào)告基因,一來可以降低假陽性率;二來可以 控制篩選的嚴(yán)格性(如果需要篩選與誘餌蛋白具有較強(qiáng)結(jié)合的蛋白,就可以同時(shí)使用 ADE2、 HIS3兩 種報(bào)告基因; 如果只需要篩選與誘餌蛋白具有中等強(qiáng)度或較弱結(jié)合的蛋白, 就可以使用 ADE2或 HIS3兩者中的一種 。 MEL1和 lacZ 分別編碼 -半乳糖苷酶和 -半乳糖苷酶,可以作用于相應(yīng)的底物X-Gal 和 X-Gal 使酵母變藍(lán)。其中, -半乳糖苷酶是外分泌酶,在酵母表面就能直接檢測到; -半乳糖苷酶是內(nèi)分泌酶, 需要將酵母破碎后才能檢測到。 用藍(lán)斑顯示酵母

6、細(xì)胞內(nèi)兩個蛋白的相互作用 的方法不僅具有較高的敏感性,而且藍(lán)斑的深淺還可以反映兩個蛋白相互作用的強(qiáng)弱。隨著酵母雙雜交系統(tǒng)的廣泛應(yīng)用, 這一系統(tǒng)得到了不斷的完善及改進(jìn), 除了經(jīng)典的雙雜交系統(tǒng)以 外,同時(shí)也衍生出單雜交系統(tǒng)、三雜交系統(tǒng)、反向酵母雙雜交系統(tǒng)、 hSos/Ras募集系統(tǒng)(hSos/Ras recruitment systems 、泛素分裂系統(tǒng)(Split-ubiquitin systems 、雙誘餌系統(tǒng)(Dual-bait systems等一 系列相關(guān)系統(tǒng),根據(jù)這些系統(tǒng)的不同特點(diǎn),可以分別應(yīng)用于蛋白質(zhì)與 DNA 、 RNA 的相互作用、蛋白 質(zhì)復(fù)合體之間的相互作用、 膜蛋白質(zhì)之間的相互

7、作用、 篩選阻斷蛋白間相互作用的藥物等一系列領(lǐng)域, 對經(jīng)典的酵母雙雜交系統(tǒng)起到了很好的補(bǔ)充,并有力地推動了酵母雙雜交系統(tǒng)的發(fā)展與應(yīng)用。酵母雙雜交系統(tǒng)的原理是利用轉(zhuǎn)錄激活因子在結(jié)構(gòu)上是組件式的, 即這些因子往往由兩個或兩個 以上相互獨(dú)立的結(jié)構(gòu)域構(gòu)成,其中有 DNA 結(jié)合結(jié)構(gòu)域(DNA binding domain, DB 和轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu) 域(activation domain, AD ,它們是轉(zhuǎn)錄激活因子發(fā)揮功能所必需的。單獨(dú)的 DB 雖然能和啟動子結(jié) 合,但是不能激活轉(zhuǎn)錄。而不同轉(zhuǎn)錄激活因子的 DB 和 AD 形成的雜合蛋白仍然具有正常的激活轉(zhuǎn)錄 的功能。根據(jù)轉(zhuǎn)錄因子的這一特性,將 BD 與已

8、知的誘餌蛋白質(zhì) X 融合,構(gòu)建出 BD-X 質(zhì)粒載體; 將 AD 基因與 cDNA 文庫,基因片段或基因突變體(以 Y 表 融合,構(gòu)建 AD-Y 質(zhì)粒載體。兩個 穿梭質(zhì)粒載體共轉(zhuǎn)化至酵母體內(nèi)表達(dá)。 蛋白質(zhì) X 和 Y 的相互作用導(dǎo)致了 BD 與 AD 在空間上的接近, 從而激活 UAS 下游啟動子調(diào)節(jié)的酵母菌株特定報(bào)告基因(如 LacZ , HIS 3, LEU 2等 的表達(dá)(圖 6-1-2 ,使轉(zhuǎn)化體由于 HIS3或 LEU2表達(dá),而可在特定的缺陷培養(yǎng)基上生長,同時(shí)因 LacZ 表達(dá)而 在 X-Gal 存在下顯藍(lán)色。 酵母雙雜交原理示意圖3. 實(shí)驗(yàn)儀器微量取液器(2 L; 20 L; 200

9、 L; 1,000 L 、低溫離心機(jī)、臺式離心機(jī)、瓊脂糖凝膠電泳系 統(tǒng)、蛋白凝膠電泳系統(tǒng)、凝膠成像系統(tǒng)、半干轉(zhuǎn)移系統(tǒng)、恒溫?fù)u床、恒溫孵箱、通風(fēng)櫥、制冰機(jī)、振 蕩器、恒溫金屬浴、無菌接種環(huán)、 10 cm培養(yǎng)皿、 15 cm培養(yǎng)皿。4. 實(shí)驗(yàn)試劑(1裂解緩沖液(Cracking buffer :尿素 8 mol/LSDS 5 %Tris-HCl (pH 6.8 40 mmol/LEDTA 0.1 mmol/L溴酚藍(lán) 0.4 mg/ml(2 各種基礎(chǔ)培養(yǎng)基和營養(yǎng)缺陷培養(yǎng)基:minimal SD base, minimal SD agar base, YPD medium, YPD agar medi

10、um, -Leu DO supplement, -Trp DO supplement, -Leu/-Trp DO supplement, -Leu/-Trp/-His DO supplement, -Leu/-Trp/-His/-Ade DO supplement, 腺苷酸 (adenine , PEG8000, Carring DNA, 二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide, DMSO , TE/LiAC buffur, PEG/LiAC, X-gal 或 X-gal 。(3酵母質(zhì)粒提取試劑盒, LB 培養(yǎng)基,羧芐青霉素和卡那霉素。(4蛋白標(biāo)準(zhǔn)。(5 Z-buffer (pH7.

11、0 :Na2HPO47H2O 16.1 g/LNaH2PO4H2O 5.5 g/LKCI 0.75 g/LMgSO47H2O 0.246 g/L(6 Z-buffer/X-Gal 液體:Z-buffer 100 ml-巰基乙醇 0.27 mlX-Gal 儲存液 1.67 ml5. 實(shí)驗(yàn)方法酵母的復(fù)蘇與表型驗(yàn)證:(1復(fù)蘇前 12 天,配制 YPDA 瓊脂并于高壓消毒后倒板。(2用無菌接菌環(huán)在酵母凍存管中挑取一小團(tuán)酵母細(xì)胞,接種到 YPDA 瓊脂板上。(3 30 倒置孵育 35天。(4待酵母長到直徑 23 mm后,將其接種到不同營養(yǎng)缺陷型培養(yǎng)基上進(jìn)行表型驗(yàn)證。質(zhì)粒轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞(常規(guī)轉(zhuǎn)化 :(1挑取

12、一直徑約 23 mm的酵母克隆接種到 0.5 ml YPDA培養(yǎng)基中。(2劇烈震蕩使細(xì)胞凝塊均勻分散。(3將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到含有新鮮 YPDA 培養(yǎng)基的錐形瓶中。(4 30, 250 rpm,振蕩孵育 1618 hr,直到穩(wěn)定期(OD 600>1.5 。(5將過夜培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移到含有新鮮 YPDA 培養(yǎng)基的椎形瓶中,進(jìn)一步擴(kuò)增酵母細(xì)胞。(6 30 , 230270 rpm,振蕩孵育使 OD 600達(dá)到 0.5 ± 0.1(一般需要 3 hr(7將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到數(shù)個 50 mL離心管中,轉(zhuǎn)速 1 000 g,室溫離心 5 min。(8棄去上清,加入 2550 mL消毒 H 2O ,振蕩重懸、清

13、洗并收集細(xì)胞。(9轉(zhuǎn)速 1 000 g,室溫離心 5 min,棄上清(10加入 1 mL新鮮配置的無菌的 1 TE / LiAC重懸細(xì)胞。(11準(zhǔn)備 1.5 mL無菌 EP 管,在每個管中加入需要轉(zhuǎn)染的質(zhì)粒以及擔(dān)體(carrier DNA 。(12加入經(jīng) 1 TE/LiAC重懸的感受態(tài)細(xì)胞,輕柔混勻。 (13每個管中加入適量體積的 1PEG/LiAC,高速震蕩混勻。(14 30 , 200 rpm,振蕩孵育 0.5 hr。(15加入適量體積的 DMSO ,溫和顛倒混勻,不要振蕩。(16 42 水浴熱休克 15 min,對于大量轉(zhuǎn)化,應(yīng)經(jīng)常搖動以混勻。(17置于冰上 510 min,室溫 12,

14、000 g離心細(xì)胞 5 sec。(18移去上清,根據(jù)鋪的板數(shù)加入適量體積的 1TE 重懸細(xì)胞。(19鋪板,倒置平板于 30 孵育直到克隆出現(xiàn)。 檢測目的蛋白在酵母細(xì)胞中的表達(dá):(1挑取一直徑約 2 mm、含有目的蛋白基因片段的 BD/X新鮮酵母克隆于 5 mL 相應(yīng)營養(yǎng)缺陷液體培養(yǎng)基中, 30 、 230 rpm振蕩孵育 16 hr。(2 將過夜培養(yǎng)物在 50 mL YPDA培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng), 30 , 220250 rpm, 使 OD 600值達(dá)到 0.40.6。(3 1,000 g離心 5 min,棄上清。(4加入 30 mL H2O ,重懸細(xì)胞。 1,000 g,離心 5 min,棄上清

15、,加入液氮速凍沉淀。(5待液氮揮發(fā)完全以后,按照 100 L/7.5 OD600的比例加入 cracking buffer重懸細(xì)胞并移入到一個小量轉(zhuǎn)化 大量轉(zhuǎn)化 質(zhì)粒 DNA0.1 g 20200 g carrierDNA 0.1 mg 2 mg 質(zhì)粒*7 每管中加入感受態(tài)細(xì)胞的 體積根據(jù)酵母細(xì)胞的數(shù)量以 及鋪板的大小而定, 通常小量 轉(zhuǎn)化每管加入 100 L 的感受 態(tài)細(xì)胞; 大量轉(zhuǎn)化每管加入 1 mL 的感受態(tài)細(xì)胞。 如果長出來以后克隆太密則可適量減 少每管中加入的感受態(tài)細(xì)胞 的體積; 反之則可適當(dāng)增加感 受態(tài)細(xì)胞的體積。轉(zhuǎn)化酵母菌結(jié)果1.5 mL的 EP 管。(6按 80 L/7.5 O

16、D600的比例向 EP 管中加入酸性玻璃微珠(glass beads 。 70 加熱 10 min。劇烈震蕩 1 min。(7 12,000 g, 4 離心 5 min。將上清轉(zhuǎn)移到一個新的 1.5 mL EP管中,置于冰上。(8 100 水浴中 35 min,劇烈震蕩 1 min。(9 12,000 g, 4 離心 5 min。將兩次上清合到一個 EP 管中。(10取 20 L 上清,加入上樣緩沖液, 100 變性 5 min。(11 SDS-PAGE 電泳后,采用 Western blot技術(shù)檢測目的蛋白在酵母細(xì)胞中的表達(dá)情況。 小規(guī)模酵母雜合(mating :(1在無菌的 1.5 mL

17、EP管,加入 0.5 mL 2 YPDA 培養(yǎng)基。(2挑取直徑約 23 mm 、新鮮的含有表達(dá)質(zhì)粒 pGBKT7-X 的 AH109酵母克隆和含有表達(dá)質(zhì)粒pGADT7-Y 的 Y187酵母克隆于上述 EP 管中。(3劇烈震蕩 1 min,使酵母細(xì)胞完全懸浮。(4 30 , 200 rpm振搖孵育 2024 hr。(5 將雜交混合液按 1:100稀釋到 0.5YPDA 培養(yǎng)基中, 取 100 mL鋪到 SD/-Trp/-Leu/X-Gal 板上。(6倒置平板于 30 孵育直到克隆出現(xiàn)。 濾紙轉(zhuǎn)移法檢測 -半乳糖苷酶的分泌:(1待酵母長到直徑 1.53 mm大小時(shí),取無菌、大小合適的 Whatma

18、n 濾紙貼在酵母板上。(2待濾紙被瓊脂板上的水分基本浸濕后,揭下濾紙,這時(shí)酵母克隆被轉(zhuǎn)移到了濾紙上。(3將附著有酵母克隆的濾紙?jiān)谝旱兴賰?10 sec以上。(4將新配制 Z-buffer/X-Gal 液體滴在另一無菌的 Whatman 濾紙上,并完全浸濕濾紙。 酵母雜交操作步驟流程圖Y187 Mating SD/-His/-Leu/X-Gal-Gal SD/-Ade/-Leu/-Trp/ X-Gal AH109（5）將附著有酵母克隆的濾紙小心地貼放在浸有 Z-buffer/X-b-Gal 的濾紙上。 （6）室溫孵育 816 hr 等待藍(lán)斑出現(xiàn)。 濾紙轉(zhuǎn)移法檢測 b-半乳糖苷酶的表達(dá)量 誘餌蛋

19、白的文庫篩選： Y187 BD-bait AH109 AD-library Pick out positive clone Mating Extracting plasmids TDO/x-a-Gal DDO/X-a-Gal QDO/X-a-Gal Thransform DH5 LB/Kan+ Extracting plasmids Retransform into AH109 SD/-Leu Mating with BD/Vector Mating with BD/bait Mating with BD/lam DDO plate DDO plate DDO plate QDO/X-a-Ga

20、l plate QDO/X-a-Gal plate QDO/X-a-Gal plate 酵母雙雜交文庫篩選操作流程圖 （1） 挑取一新鮮、 直徑為 23 mm 的 BD-bait 酵母 AH109 于 50 ml SD/-Trp 液體培養(yǎng)基， ， 30 250270 rpm，1618 hr，培養(yǎng)至 OD600 值>0.8。 （2）1,000 ´ g 離心 5 min，棄上清。用剩余的 5 mL 左右殘液重懸細(xì)胞。 （3）室溫水浴融化凍存的文庫（約 1 mL） ，輕柔震蕩，留取 10 mL 文庫用于文庫滴度測定（文庫滴 度測定方法見后） 。 （4） 快速將步驟 2 和步驟 3 的

21、兩種液體混合到 2 L 的燒瓶中并加入 45 mL 2 YPD/Kan Kan50 mg/mL） （ 輕柔震蕩；用 1 mL 2´YPD/Kan 沖洗裝文庫的離心管兩次，并將沖洗液加入到燒瓶中。 （5）30 過夜孵育（2024 hr）并輕柔震蕩（3050 rpm） 。 （6）將雜交混合液轉(zhuǎn)移到一無菌離心瓶中，1,000 ´ g 離心 10 min，棄上清。再用 50 mL 2×YPD/Kan 沖洗雜交瓶兩次，將兩次沖洗液混合在一起重懸細(xì)胞。 （7）1,000 ´ g 離心 1 0 min，棄上清。用 10 mL 的 0.5´YPD/Kan 重懸

22、細(xì)胞，并估算重懸后的總體積， 鋪板。 （8）倒置平板于 30 孵育 821 天直到克隆出現(xiàn)。 （9）挑取陽性克隆于 300 mL YPDA 和 150 mL 消毒甘油的混合液中，凍存于-80 。 陽性克隆驗(yàn)證： （1）用接種環(huán)挑取單個陽性克隆接種到新的 SD/-Trp/-Leu/-His/ X-Gal 平板上，30 倒置平板孵育。 （2）待陽性克隆長出后，再用接種環(huán)挑取單個陽性克隆，接種到新的 SD /-Trp/-Leu/-His/X-Gal 平板 或 SD/-Trp/-Leu/-Ade/ -His/X-Gal 平板上，倒置平板于 30 孵育。 （3）挑取單個陽性克隆于 5 mL YPDA/K

23、an 培養(yǎng)基中 30 ，250270 rpm 振搖 1216 hr。 （4）使用酵母質(zhì)粒微量抽提試劑盒提取質(zhì)粒。 （5）將提取到的質(zhì)?；旌衔铮˙D/bait、AD/cDNA）采用經(jīng)典轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化 DH5a 大腸桿菌，鋪 LB 抗 生素平板。LB 平板中的抗生素與 AD/cDNA 載體所帶的抗性一致，這樣最終得到的克隆只含有 AD/cDNA。 （6）挑取單個陽性克隆于 5 mL LB 培養(yǎng)基（含相應(yīng)抗生素）中 37 ，250270 rpm 振搖 1216 hr。 （7）提取質(zhì)粒，做 PCR 鑒定。 （8）將 pGADT7-cDNA 表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)入 AH109 酵母株中將 pGBKT7-bait 表達(dá)

24、質(zhì)粒轉(zhuǎn)入 Y187 酵母中， 待克隆長出對帶有 AD-文庫蛋白的 AH109 酵母克隆進(jìn)行自激活驗(yàn)證， 另外再將帶有 AD-文庫蛋 白的 AH109 酵母克隆與帶有 BD-bait 蛋白的 Y187 酵母克隆進(jìn)行雜交，驗(yàn)證陽性克隆的真實(shí)性。 2 000bp 500bp 2 000bp 500bp 2 000bp 2 000bp 500bp 500bp 文庫 cDNA 片段的 PCR 鑒定 文庫滴度的測定： （1）將預(yù)留的 10 mL 文庫與 10 mL LB 混合均勻。 （2）取 1 mL 混合液到 1 mL LB 培養(yǎng)基中，混合均勻，制成稀釋溶液 A（1:103） 。 （3）再從溶液 A 中

25、取 1 mL 到 1 mL LB 培養(yǎng)基中，混合均勻，制成稀釋溶液 B（1:106） 。 （4）從溶液 A 中取 1 mL 到 50 mL LB 培養(yǎng)基中，混合均勻，鋪板。 （5）從溶液 B 中分別取 50 mL 和 100 mL 鋪板。 （6）將板倒置 3031 ，孵育 3648 hr。 （7）克隆計(jì)數(shù)并計(jì)算文庫滴度（cfu/mL） ，計(jì)算文庫滴度的方法如下： A：克隆數(shù) ´ 103´ 103 ´ 2 = cfu/mL B： （克隆數(shù)/鋪板體積）´ 103´ 103 ´ 103 ´ 2 = cfu/mL 6. 注意事項(xiàng) （1）酵母雙雜交對照的設(shè)定 常規(guī)的酵母雙雜交操作時(shí)一般會設(shè)定陽性對照、陰性對照以及顯色系統(tǒng)對照三種對照，以 MATCHMAKER GAL4 酵母雙雜交篩選系統(tǒng)為例： 陽性對照：pGADT7-T + pGBKT7-53，其中 T 蛋白和 53 蛋白是已經(jīng)明確在酵母細(xì)胞內(nèi)能夠發(fā)生 結(jié)合并啟動報(bào)告基因表達(dá)的兩種蛋白。 陰性對照：pGADT7-T + pGBKT7-lam，其中已經(jīng)明確 T 蛋白和 lam 蛋白在酵母細(xì)胞內(nèi)不能發(fā)生 結(jié)合。 系統(tǒng)顯色對照，pGADT7-Pcl1，該表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)入酵母細(xì)胞就能引起 b-半乳糖苷酶和 a-半乳糖苷 酶的分泌，從而檢測顯色系統(tǒng)是否有問題。 （2）假陽性現(xiàn)象 多種