生物工程專業(yè)實(shí)驗(yàn)講義

1、生物工程專業(yè)實(shí)驗(yàn)講義(適用于生物工程專業(yè))袁麗紅 曹飛制藥與生命科學(xué)學(xué)院二零零四年四月目 錄實(shí)驗(yàn)一 發(fā)酵種子的制備12實(shí)驗(yàn)三 高速冷凍離心機(jī)的使用方法.3實(shí)驗(yàn)四 固定化生物催化劑的制備4實(shí)驗(yàn)五 游離細(xì)胞與固定化細(xì)胞酶活比較5實(shí)驗(yàn)六 固定化生物催化劑的連續(xù)生產(chǎn)6實(shí)驗(yàn)七Asp的分離7實(shí)驗(yàn)八離子交換樹脂的預(yù)處理及交換容量的測(cè)定8實(shí)驗(yàn)一 發(fā)酵種子的制備一、 目的要求1 了解實(shí)驗(yàn)室種子制備過程。2 掌握實(shí)驗(yàn)室不同菌種種子生產(chǎn)方法。二、 原理實(shí)驗(yàn)室種子制備過程包括瓊脂斜面、固體培養(yǎng)基擴(kuò)大培養(yǎng)或搖瓶液體培養(yǎng)。不同菌種其具體制備方法不同，其過程如下圖：種子擴(kuò)大培養(yǎng)過程三、 試驗(yàn)及器材1 菌種：斜面低溫保藏的大

2、腸桿菌（E.coli）2 培養(yǎng)基：牛肉膏 0.5% NaCl 0.5%若配固體培養(yǎng)基，在其中加2%瓊脂。3 器材：天平、滅菌鍋、試管、三角瓶（500mL）四、 操作方法1 按培養(yǎng)基配方配制100mL固體培養(yǎng)基，分裝于試管中。壓力1Kg/cm2滅菌30mins，結(jié)束后取出、趁熱制成斜面。2 按培養(yǎng)基配方配制1000mL液體培養(yǎng)基，分裝于三角瓶中，每瓶100mL，壓力1Kg/cm2滅菌30mins，結(jié)束后取出。3 接于液體培養(yǎng)基中，37培養(yǎng)24hs。4 挑斜面長(zhǎng)好的E.coli約2環(huán)接入液體培養(yǎng)基中，37振蕩培養(yǎng)24hs，轉(zhuǎn)速約150rpm。五、 思考與討論實(shí)驗(yàn)室種子制備的原則是什么？一、 目的要

3、求1 了解發(fā)酵罐的結(jié)構(gòu)，掌握發(fā)酵罐的基本操作技術(shù)。2 了解發(fā)酵罐中微生物生長(zhǎng)的生長(zhǎng)特征。3 掌握實(shí)驗(yàn)室中微生物從斜面搖瓶發(fā)酵罐的無菌操作培養(yǎng)技術(shù)，對(duì)工業(yè)化微生物生產(chǎn)過程作出初步了解。4 掌握酶合成代謝調(diào)控機(jī)制。5 掌握發(fā)酵工藝控制工藝。二、 原理一定數(shù)量的微生物，接種于合適的新鮮培養(yǎng)基中，在適宜的培養(yǎng)條件下，所表現(xiàn)出的群體生長(zhǎng)特征可分為四個(gè)時(shí)期，即延遲期、對(duì)數(shù)期、穩(wěn)定期和衰亡期。微生物在各個(gè)時(shí)期的生理特征各不相同。微生物的生長(zhǎng)過程是其總的代謝活動(dòng)的綜合體現(xiàn)，每一種代謝途徑均由一些特有的酶的反應(yīng)組成，同時(shí)微生物代謝具有高度的調(diào)節(jié)作用，通過本實(shí)驗(yàn)了解酶合成的調(diào)節(jié)機(jī)制之一酶合成的誘導(dǎo)。三、 試劑及器

4、材12 發(fā)酵培養(yǎng)基：牛肉膏 2% 、玉米漿 2%、K2HPO4 0.2%、MgSO4 0.1% 富馬酸銨 0.5%、富馬酸鈉1%、pH 7.5。3. 消泡劑：植物油4器材：發(fā)酵罐、滅菌鍋、721分光光度計(jì)、超凈工作臺(tái)、臺(tái)式高速離心機(jī)、離心管、移液管。四、操作方法1 按配方配制1200mL發(fā)酵培養(yǎng)基，調(diào)pH7.5，裝入發(fā)酵罐中，封好各個(gè)封口，保持1Kg/cm2壓力下滅菌30mins，結(jié)束后取出放在超凈工作臺(tái)上。2 待發(fā)酵點(diǎn)中的培養(yǎng)基冷卻至35左右時(shí)，用火環(huán)接種法將E.coli種子液接發(fā)酵器中，接種量1015%，控制溫度37，轉(zhuǎn)速約為300rpm，空氣流速1L/min，發(fā)酵培養(yǎng)約2224hs，其中

5、每間隔1hr取樣測(cè)pH值和OD660值（樣品進(jìn)行適當(dāng)稀釋）紀(jì)錄發(fā)酵全過程中pH值變化和菌體生長(zhǎng)情況。3 發(fā)酵結(jié)束后放罐、收集發(fā)酵液并測(cè)量其總體積（V）。吸取1 mL發(fā)酵液于離心管中，放入臺(tái)式高速離心機(jī)中離心，轉(zhuǎn)速8000 rpm，時(shí)間10 min，測(cè)濕菌體重（W）計(jì)算發(fā)酵產(chǎn)菌率。五、思考與討論1 哪些因素影響產(chǎn)菌率。2 如何提高發(fā)酵效率。3 討論酶合成生產(chǎn)的調(diào)節(jié)方式。實(shí)驗(yàn)三 高速冷凍離心機(jī)的使用方法一、 目的要求1 了解高速冰凍離心機(jī)的結(jié)構(gòu)、使用方法及注意事項(xiàng)。2 掌握生物物質(zhì)、微生物菌體離心分離的原理。二、 原理離心機(jī)是利用離心力對(duì)混合溶液進(jìn)行分離和沉淀的一種專用儀器，高速冰凍離心機(jī)在實(shí)驗(yàn)室

6、分離和制備工作中是必不可少的工具，其最高速度可以達(dá)到25000 rpm，最大離心力可達(dá)89000g。這類離心機(jī)通常帶有冷卻離心腔的制冷設(shè)備，溫度控制是由裝在離心腔內(nèi)的熱電偶檢測(cè)離心腔的溫度。高速冰凍離心機(jī)有多個(gè)內(nèi)部可變換的角式或甩平式轉(zhuǎn)頭，它們大多用于收集微生物菌種細(xì)胞碎片，大的細(xì)胞器以及一些沉淀物等。三、 試劑與器材 E.coli發(fā)酵液、天平、Beckmen高速冰凍離心機(jī)、離心管四、操作方法1 使用前先檢查調(diào)速旋鈕、定時(shí)旋鈕等是否在“0”處，離心管是否泄漏。2 選擇合適的轉(zhuǎn)頭安裝到離心腔內(nèi)承載轉(zhuǎn)頭的軸上。3 接通電源，打開電源開關(guān)。4 將待離心的液體裝入合適的離心管中，盛量不宜過多（占管的2

7、/3體積）以免益處，蓋上離心管蓋，精密平衡離心管，并對(duì)稱的放入轉(zhuǎn)頭中。5 調(diào)節(jié)速度旋鈕和定時(shí)旋鈕，至所需的速度和時(shí)間。6 打開起動(dòng)開關(guān)，并觀察離心機(jī)上的各個(gè)指示儀表是否正常工作。7 離心結(jié)束后自動(dòng)關(guān)機(jī)、關(guān)閉冷凍開關(guān)、電源開關(guān)、切斷電源。8 將轉(zhuǎn)頭取出，將離心機(jī)的蓋子敞開放置。9 收集離心物，洗凈離心管。五、注意事項(xiàng)1 高速離心機(jī)的轉(zhuǎn)頭是鑲置在一個(gè)較細(xì)的軸上，因此精密的平衡離心管及內(nèi)含物是十分重要的。2 當(dāng)轉(zhuǎn)頭只是部分裝載時(shí)，管子必須相互對(duì)稱的放在轉(zhuǎn)頭上，以便使負(fù)載均勻地分布在轉(zhuǎn)頭的周圍。3 裝載溶液時(shí)，要根據(jù)離心管的具體操作說明進(jìn)行，要根據(jù)離心液體的性質(zhì)、體積選擇合適的離心管，液體不得裝的過多

8、，以防離心時(shí)甩出，造成轉(zhuǎn)頭生銹或者腐蝕。4 每次使用時(shí)，要仔細(xì)檢查轉(zhuǎn)頭，及時(shí)清洗、擦干，轉(zhuǎn)頭是離心機(jī)中須重點(diǎn)保護(hù)的部件，搬動(dòng)時(shí)不能碰撞，避免造成傷痕。轉(zhuǎn)頭長(zhǎng)時(shí)間不用時(shí)，要涂一層光蠟保護(hù)。5 轉(zhuǎn)頭在使用前應(yīng)放置在冰箱或置于離心機(jī)的轉(zhuǎn)頭室內(nèi)預(yù)冷。6 離心過程中不得隨意離開，應(yīng)隨時(shí)觀察李新機(jī)上儀表是否正常工作，并注意聲音有無異常，以便及時(shí)排除故障。7 離心力通常用重力常數(shù)g的倍數(shù)（數(shù)字×g）或用rpm表示各種離心機(jī)的轉(zhuǎn)頭大小不同，在使用離心機(jī)時(shí)，可根據(jù)所選用的轉(zhuǎn)頭半徑來相互換算。每個(gè)轉(zhuǎn)頭各有其最高允許速度，使用時(shí)注意不能過速使用。實(shí)驗(yàn)四 固定化生物催化劑的制備一、 目的要求1 學(xué)會(huì)卡拉膠固

9、定大腸桿菌的操作方法2 了解工業(yè)化固定生物催化劑的工藝過程二、 原理酶和細(xì)胞固定化方法主要有吸附法、包埋法、共價(jià)鍵結(jié)合法和交聯(lián)法等。本實(shí)驗(yàn)通過卡拉膠包埋法固定大腸桿菌細(xì)胞，掌握包埋法固定細(xì)胞的操作方法?？ɡz是由角叉菜提取的一種多糖，它含有許多硫酸根多糖，在K+存在下，它能立即發(fā)生凝膠作用，由此形成的固定化顆粒能在磷酸緩沖液和其他電解質(zhì)溶液中使用，其穩(wěn)定性不受影響?？ɡz包埋法即溫和又簡(jiǎn)單，可供多種酶和細(xì)胞固定化使用。三、 試劑及器材1 菌種：大腸桿菌細(xì)胞2 試劑：卡拉膠、KCl3 器材：電爐、天平、恒溫水裕鍋、量筒、小刀、燒杯四、 操作方法1 配制6%卡拉膠水溶液（A），并冷卻至5560。2

10、 配制菌懸液（B），按濕細(xì)胞重與蒸餾水為1：1（g/mL）配制，并預(yù)熱至5560。3 將A與B按4：1（mL/mL）混勻，冷至10使凝膠強(qiáng)化，把所形成的凝膠浸在0.3MKCl溶液中。4 取出凝膠切成5×5mm大小的小塊，印成固定化大腸桿菌細(xì)胞。5 測(cè)定固定化細(xì)胞顆粒的密度、床層空隙率、計(jì)算單位體積或重量固定化顆粒中細(xì)胞包埋量。五、 思考與討論影響卡拉膠固定化細(xì)胞顆粒機(jī)械強(qiáng)度的因素有哪些？實(shí)驗(yàn)五 游離細(xì)胞與固定化細(xì)胞酶活比較一、 目的要求掌握酶活測(cè)定和計(jì)算方法二、 原理 天門冬氨酸酶是催化富馬酸和氨轉(zhuǎn)化形成L-Asp的酶：富馬酸 + 氨水 L天冬氨酸測(cè)定發(fā)酵過程中游離細(xì)胞酶活和固定化E

11、.coli細(xì)胞酶是評(píng)價(jià)發(fā)酵培養(yǎng)條件和固定化方法對(duì)大腸桿菌生產(chǎn)L-Asp能力影響的重要指標(biāo)之一。三、試劑與器材1 試劑：富馬酸、氨水2 器材：752分光光度計(jì)、離心機(jī)、電爐、三角瓶、燒杯四、 操作方法1 富馬酸標(biāo)準(zhǔn)曲線制作（測(cè)定范圍525g/mL）精確稱取0.5000g富馬酸，配制成0.5mg/mL母液，分別吸取母液0.1，0.2，0.3，0.4和0.5mL母液，定容至10mL，即成5，10，15，20，25g/mL富馬酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，測(cè)定各標(biāo)準(zhǔn)液OD240值，繪制成標(biāo)準(zhǔn)曲線。21M富馬酸銨底物配制：內(nèi)含1mMMgCl2, pH為3游離細(xì)胞酶活力測(cè)定稱濕細(xì)胞，加入30底物溶液，于37下振蕩反應(yīng)1h，

12、取出沸水滅活，終止反應(yīng)，離心，取上清液，進(jìn)行適當(dāng)稀釋，測(cè)OD240。4 固定化細(xì)胞顆粒酶活力測(cè)定稱相當(dāng)于1g濕細(xì)胞的固定化細(xì)胞顆粒，加30ML底物，于37振蕩反應(yīng)1h，取樣離心，適當(dāng)稀釋，測(cè)OD240。5 酶活定義：與上述反應(yīng)條件下，每小時(shí)消耗1g分子底物的酶量定義為一個(gè)酶活單位。五、 思考與討論計(jì)算游離細(xì)胞和固定化細(xì)胞酶活力，并進(jìn)行比較，討論影響固定化細(xì)胞的酶活力的因素。實(shí)驗(yàn)六 固定化生物催化劑的連續(xù)生產(chǎn)一、 目的要求了解固定化生物反應(yīng)器的性能與反應(yīng)器操作之間的關(guān)系二、 原理添裝于固定床反應(yīng)器中的具有天門冬氨酸酶活性的固定化大腸桿菌顆粒能連續(xù)的利用富馬酸和氨作為底物，使之轉(zhuǎn)變?yōu)長(zhǎng)-Asp，其

13、實(shí)驗(yàn)流程如下：底物貯槽恒流泵恒溫固定床反應(yīng)器產(chǎn)品液貯槽在其它反應(yīng)條件不變的情況下，反應(yīng)器的性能隨反應(yīng)器的操作流量（即原料液在反應(yīng)器中的停留時(shí)間）而變化。三、 試劑及器材 試劑：M富馬酸銨底物（內(nèi)含1m MgCl2） 器材：固定床反應(yīng)器、恒流泵、超級(jí)恒溫水浴鍋、752分光光度計(jì)、燒杯、乳膠管。四、 操作方法 將具有天冬氨酸酶活性的固定化大腸桿菌顆粒裝入固定床反應(yīng)器中。連續(xù)底物貯槽、循環(huán)水等，控制恒溫372.調(diào)節(jié)恒流泵至一流量，待反應(yīng)器流動(dòng)穩(wěn)定后側(cè)體積流量，并取洋測(cè)OD240值。 將恒流泵調(diào)至另一流量（與上述流量有明顯差別）重復(fù)2 計(jì)算最佳流量，并將恒流泵調(diào)節(jié)至最佳流量，連續(xù)轉(zhuǎn)化生產(chǎn)L-Asp，每

14、間隔h測(cè)OD240，計(jì)算富馬酸轉(zhuǎn)化率。五、 思考與討論 討論兩種流量下富馬酸轉(zhuǎn)化率之差異 測(cè)定轉(zhuǎn)化過程中富馬酸轉(zhuǎn)化曲線，并用文字說明。 如何提高反應(yīng)器的轉(zhuǎn)化率？實(shí)驗(yàn)七Asp的分離一、 目的要求 掌握發(fā)酵液（轉(zhuǎn)化液）預(yù)處理方法 掌握等電點(diǎn)沉淀法分離氨基酸的方法二、 原理）使-Asp所帶的靜電荷為零，可大大降低L-Asp溶解度，使L-Asp沉淀出來。所得L-Asp結(jié)晶用水洗滌，不需進(jìn)行重結(jié)晶，即可制得純品。三、 試劑及器材 試劑：60% H2SO4、活性炭 器材：布氏漏斗、電爐、烘箱、燒杯四、 操作方法 轉(zhuǎn)化液預(yù)處理：過濾轉(zhuǎn)化液，除去其中顆粒狀雜質(zhì)，加入活性炭脫色，然后過濾，收集溶液、測(cè)定其體積。

15、 加熱濾液至90，用60%H2SO4調(diào)pH至2.8，然后在下保溫hs, 即有L-Asp結(jié)晶析出。 過濾收集L-Asp晶體，用蒸餾水淋洗，過濾得L-Asp純晶體。 于烘箱中烘干至恒重，稱重。五、 思考與討論 計(jì)算L-Asp理論得率和實(shí)際收率，并對(duì)結(jié)果進(jìn)行討論。 計(jì)算固定化反應(yīng)器生產(chǎn)L-Asp能力并討論之單位時(shí)間反應(yīng)器生產(chǎn)LASP量固定化反應(yīng)器中生產(chǎn)能力反應(yīng)器中顆粒床層總體積實(shí)驗(yàn)八離子交換樹脂的預(yù)處理及交換容量的測(cè)定一、 目的要求 通過實(shí)驗(yàn)加深對(duì)離子交換樹脂的重要性能之一總交換容量的認(rèn)識(shí)。 掌握離子交換樹脂的作用原理。 學(xué)會(huì)離子交換樹脂的預(yù)處理方法。 熟悉靜態(tài)法、動(dòng)態(tài)法測(cè)定離子交換樹脂總交換容量的

16、操作方法。二、 原理交換容量是離子交換樹脂質(zhì)量的重要標(biāo)志，本實(shí)驗(yàn)測(cè)定的是離子交換樹脂的總交換量也叫最大或極限交換量，它是指樹脂經(jīng)過100/105干燥至恒重后，每克或水中每樹脂的具有的可交換離子的總數(shù)，單位為毫克當(dāng)量克（干樹脂）或（溫樹脂）即（meq/g或mL）離子交換樹脂交換量最簡(jiǎn)單的測(cè)定方法是酸堿滴定法。氫型陽離子交換樹脂與堿作用時(shí)生成水，為一不可逆反應(yīng)、故可用于靜態(tài)法測(cè)定交換容量。陰離子交換樹脂不能采用類似的方法測(cè)定，應(yīng)用氯型樹脂，當(dāng)它與作用時(shí)，生成，這一反應(yīng)為可逆反應(yīng)，故宜采用動(dòng)態(tài)法測(cè)定樹脂交換容量。（）=（）滴定流出液中含量來測(cè)定其總交換容量。三、 試劑與器材 試劑：、0.1標(biāo)準(zhǔn)溶液、

17、標(biāo)準(zhǔn)溶液、溶液、甲基橙指示劑、3標(biāo)準(zhǔn)溶液 器材：恒流泵、層析柱、滴定管、精密天平、烘箱、容量瓶、三角瓶四、 操作方法 離子交換樹脂預(yù)處理分別稱取，樹脂，加水倒入交換柱中，流加mLNaOH溶液，流速滴秒，結(jié)束后滴加mL去離子水，流速可大一些，結(jié)束后再流加mL溶液，流速滴秒，最后流加去離子水，如此重復(fù)三次。靜態(tài)法測(cè)定離交樹脂交換量（）精確稱取處理好并抽干的氫型陽離子樹脂克，下烘干至恒重，按下式計(jì)算含水量其中：W1-烘干前樹脂量W2-烘干后樹脂量（）另取處理好的樹脂克放入三角瓶中，吸取mL0.1標(biāo)準(zhǔn)溶液加入樹脂中，放置、要求樹脂全部浸入溶液中，然后用吸管分別取出10mL放入三只三角瓶中，以甲基橙作指示劑，用0.1標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定溶液由無色變?yōu)榧t色為滴定終點(diǎn)，取三次滴定的平均值，按下式計(jì)算樹脂交換總量?？偨粨Q容量（meq/克干樹脂）其中：G濕樹脂總量（克）W樹脂含水量N10.1N NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液的當(dāng)量濃度 N20.1N HCl標(biāo)準(zhǔn)溶液的當(dāng)量濃度 V20.1N HCl標(biāo)準(zhǔn)溶液的用量（mL）（）精確稱取處理好的并抽干的氯型陽離子樹脂克，下烘干至恒重，按下式計(jì)算含水量（W）（）另取克樹脂，