胃淋巴增生性疾病IgH基因重排的檢測及意義

1、    胃淋巴增生性疾病IgH基因重排的 檢測及意義        【摘要】目的探討免疫球蛋白重鏈(IgH)基因單克隆性重排的檢測對胃MALT淋巴瘤的診斷及鑒別診斷價值。方法應(yīng)用半巢式聚合酶鏈反應(yīng)(semi?nestedPCR)技術(shù)檢測石蠟包埋的31例胃MALT淋巴瘤、26例淋巴細(xì)胞性胃炎及11例對照標(biāo)本免疫球蛋白重鏈(IgH)基因重排的克隆性。引物選用互補(bǔ)于IgH基因V區(qū)及J區(qū)保守序列的Fr2,Fr3。結(jié)果(1)用Fr3為引物擴(kuò)增，74.2的胃MALT淋巴瘤獲得單

2、克隆性重排條帶；聯(lián)合Fr2擴(kuò)增，可使其檢出率提高到87.1。(2)對手術(shù)及胃鏡活檢的石蠟包埋標(biāo)本，該技術(shù)具有相同的敏感性；(3)26.9的淋巴細(xì)胞性胃炎中出乎預(yù)料地發(fā)現(xiàn)有IgH基因單克隆重排條帶。結(jié)論用IgH基因引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增是臨床上診斷和鑒別診斷胃MALT淋巴瘤的有效手段。有B細(xì)胞單克隆形成的淋巴細(xì)胞性胃炎可能系淋巴瘤的前期病變，對其進(jìn)行監(jiān)測和隨訪是十分重要的?！娟P(guān)鍵詞】胃MALT淋巴瘤；聚合酶鏈反應(yīng)；免疫球蛋白重鏈(IgH)基因重排 Immunoglobulin heavy chain gene rearrangement in gastric lymphoproliferative

3、disorders : assays and implicationsGAN Huatian,OUYANG Qin,LI Gandi et al（Department of internal Medicine,The First University Hospital,West China University of Medical Sciences,Chengdu,China 610041.）【 Abstract】 Objective Semi nested PCR method was attempted to detect monoclonal immunoglobulin heavy

4、chain ( IgH ) rearrangement in B cell neoplasms . Methods Paraffin embedded tissues from patients with mucosa associated lymphoid tissue ( MALT ) lymphoma ( n=31 ) , with lymphocytic gastritis ( n=26 ) and from controls ( n=11 ) were investigated using frame work ( FR ) 2 and 3 as primers. Results W

5、ith Fr3 , B cell monoclonality was positive in 74.2 ( 23/31 ) of cases with MALT lymphoma , which increased to 87.1 ( 27/31 ) with Fr3 Fr2 primers. No difference was found in sensitivity between endoscopic and surgical specimens. B cell monoclonality was unexpectedly detect in 26.3 of cases with lym

6、phocytic gastritis.Conclusion PCR amplified IgH gene method appeared effective to diagnosis or differentiate gastric MALT lymphoma and to monitor probable alterations of lymphocytic gastritis with B cell monoclonality , a possible precusor, to lymphoma .【 Key words】Gastric MALT lymphoma ; Polymerase

7、 chain reaction ; Immnoglobulin heavy chaingene rearrangement胃粘膜相關(guān)淋巴組織(MALT)淋巴瘤是較常見的結(jié)外淋巴瘤。由于其在組織學(xué)上常有淋巴濾泡和漿細(xì)胞出現(xiàn)，而淋巴細(xì)胞性胃炎亦存在類似組織學(xué)表現(xiàn)，因此常規(guī)組織學(xué)方法對其診斷和鑒別診斷十分困難。免疫組化技術(shù)對其診斷起了較大的推動作用，但仍不盡人意。近來發(fā)展的聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)技術(shù)檢測免疫球蛋白重鏈(lgH)基因重排為淋巴瘤的診斷和鑒別診斷提供了一種新的手段。本文采用該技術(shù)以檢測胃MALT淋巴瘤以及淋巴細(xì)胞性胃炎中l(wèi)gH基因重排的克隆性，旨在探討該技術(shù)對MALT淋巴瘤的診斷和鑒別診

8、斷價值。材料與方法一、材料：收集華西醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院病理科1986至1996年檔案保存的手術(shù)及胃鏡活檢石蠟包埋標(biāo)本68例。其中胃MALT淋巴瘤31例(胃鏡活檢標(biāo)本13例、手術(shù)標(biāo)本18例，符合Dawson診斷標(biāo)準(zhǔn)1，且免疫組化證實為MALT來源)；淋巴細(xì)胞性胃炎26例(均為胃鏡活檢標(biāo)本，符合Dixon診斷標(biāo)準(zhǔn)2)，7例胃息肉及4例胃平滑肌瘤(均為胃鏡標(biāo)本)為對照。二、方法：(1)組織學(xué)及免疫組化：復(fù)習(xí)所有病理診斷，重新切片作HE染色。觀察淋巴細(xì)胞浸潤或淋巴濾泡形成。L26(1：100)胃MALT淋巴瘤組織學(xué)改變重新按照Isaccson等1988年關(guān)于胃腸惡性淋巴瘤的新分類方案分類3。免疫組化采用

9、的第一抗體為KiB5(1100)，L26(1100)，UCHL-1(1100)，anti-K(13000)anti-(13000)，除KiB5來自德國Kiel大學(xué)外，其余均為Dako公司產(chǎn)品。染色方法為LSAB法和PAP法。(2)IgH基因重排檢測：(a)DNA的提取參照sukpanichnant等的方法進(jìn)行4。(b)PCR擴(kuò)增：引物選用互補(bǔ)于IgH基因V區(qū)及J區(qū)保守序列的Fr2、Fr3、LJH、VLJH作半巢式(semi-nested)PCR。引物由德國德累斯頓大學(xué)醫(yī)院贈送，其序列如下：Fr2:5'-TGGAGTCCGCACAGGCCTCTCCNGG-3;Fr3:5'-ACA

10、CGGCCTGCTGTATTACTGT-3'LJH:5'-TGAGGAGACGGTGACC-3'VLJH:5-GTGACCAGGGTNCCTTGGCCCCAG-3'。參照Diss等的方法進(jìn)行5。首先用Fr3和LJH作第一次擴(kuò)增，共30個循環(huán)。擴(kuò)增產(chǎn)物以雙蒸水11000稀釋后取10l用Fr3和VLJH作第二次擴(kuò)增，共20個循環(huán)。Fr3-PCR擴(kuò)增為陰性者，用Fr2-PCR再次進(jìn)行擴(kuò)增。第一步用Fr2和LJH擴(kuò)增；第二步用Fr2和VLJH擴(kuò)增。每次擴(kuò)增均設(shè)無模板DNA的陰性對照和Raji細(xì)胞株DNA(德國德累斯頓大學(xué)醫(yī)院Thiede博士贈送)的陽性對照。PCR擴(kuò)增產(chǎn)

11、物經(jīng)8聚丙烯酰胺凝膠電泳，溴化乙錠染色后，紫外線下觀察結(jié)果。統(tǒng)計學(xué)處理：2檢驗，P<0.05為差異顯著。結(jié)果一、組織學(xué)及免疫組化結(jié)果：31例皆為B細(xì)胞胃惡性淋巴瘤，無T細(xì)胞胃惡性淋巴瘤，且均屬M(fèi)ALT來源；有22例伴淋巴濾泡形成。26例淋巴細(xì)胞性胃炎均可見淋巴細(xì)胞浸潤或淋巴濾泡形成；免疫組化染色表明它們均為多克隆性增生。二、IgH基因重排的檢測結(jié)果：從表1可見，僅用一種引物Fr3擴(kuò)增，31例胃MALT淋巴瘤，23例檢出了單克隆性重排條帶(74.2)；即在240-280bp(Fr2)或80-120bp(Fr3)處出現(xiàn)1條或2條狹窄而明顯的特異性條帶，26例淋巴細(xì)胞性胃炎，5例出現(xiàn)了單克隆特

12、異性條帶(19.2)。但聯(lián)合應(yīng)用Fr2，則前者IgH基因單克隆性重排檢出率可提高到87.1，后者可達(dá)26.9。4例胃MALT淋巴瘤，19例淋巴細(xì)胞性胃炎以及11例對照病例均呈現(xiàn)多克隆性的淺淡均勻彌漫帶(smear)或無擴(kuò)增產(chǎn)物。陰性對照未見DNA擴(kuò)增產(chǎn)物，Raji細(xì)胞株擴(kuò)增出了單克隆性重排條帶。表1PCR檢測lgH基因單克隆性重排結(jié)果組 別例 數(shù)Fr3()Fr23() 胃MALT淋巴瘤3123(74.2)27(87.1) 淋巴細(xì)胞性胃炎265(19.2)7(26.9) 對照組110(0)0(0)三、胃MALT淋巴瘤胃鏡和手術(shù)標(biāo)本PCR檢測結(jié)果比較：13例胃鏡標(biāo)本中IgH基因單克隆性重排檢出率為

13、84.8(11/13)與18例手術(shù)標(biāo)本的檢出率88.9(16/18)比較無差異(P>0.05)。討論B淋巴細(xì)胞在分化早期，位于14號染色體上的免疫球蛋白重鏈基因的可變區(qū)(V)、多樣區(qū)(D)和連接區(qū)(J)要發(fā)生隨機(jī)重排。由于重排的隨機(jī)性以及重排片段連結(jié)區(qū)核苷酸的隨機(jī)刪除或插入等使得每一克隆B淋巴細(xì)胞均有其獨(dú)特的重排方式，這是人體能編碼上萬種不同免疫球蛋白的分子遺傳學(xué)基礎(chǔ)。這一情況見于正常淋巴組織及反應(yīng)性增生。惡性淋巴瘤系單克隆性增殖疾病，所有的克隆表現(xiàn)為一種IgH基因重排。因此，IgH基因的重排方式可作為確定克隆性的標(biāo)志6。檢測IgH基因重排的經(jīng)典方法是Southern雜交技術(shù)，由于該技術(shù)

14、手續(xù)繁雜，費(fèi)時，有放射性污染且需新鮮組織等弊端，故很難用于臨床常規(guī)檢測。PCR技術(shù)的問世及發(fā)展使得臨床常規(guī)檢測IgH基因重排成為可能。本研究成功地使用該技術(shù)對石蠟包埋組織中提取的低分子量DNA進(jìn)行了擴(kuò)增，發(fā)現(xiàn)用Fr3為引物，其對胃MALT淋巴瘤IgH基因單克隆重排的檢出率為74.2。遺憾地是Fr3為引物的PCR并不能檢測出所有單克隆性IgH基因重排，許多研究表明其檢測陽性率一般不超過80。因此有作者設(shè)計了針對Fr2框架區(qū)的引物Fr2作為補(bǔ)充，聯(lián)合二組引物可使陽性率達(dá)905，本研究結(jié)果證實了這一點(diǎn)，我們聯(lián)合Fr3和Fr2，使胃MALT淋巴瘤IgH基因單克隆性重排的檢出率達(dá)87.1。此外，我們還發(fā)

15、現(xiàn)，該技術(shù)對手術(shù)及胃鏡活檢的胃MALT淋巴瘤標(biāo)本IgH基因重排檢出率相似，提示該技術(shù)對胃鏡活檢標(biāo)本同樣敏感。因而更具臨床實用價值。胃MALT淋巴瘤是胃腸道淋巴瘤中最常見的類型。它具有獨(dú)特的臨床特點(diǎn)：生長緩慢、長期局限、預(yù)后良好。這類淋巴瘤起源于中心細(xì)胞樣細(xì)胞，其組織形態(tài)特點(diǎn)與一般淋巴瘤不一樣，常有反應(yīng)性增生的淋巴濾泡存在。因此在良惡鑒別診斷上十分困難，尤其是僅根據(jù)胃鏡活檢的小塊組織來診斷，就更易誤診或漏診。此時，輔以IgH基因重排檢測以確定其克隆性質(zhì)是鑒別的關(guān)鍵，PCR技術(shù)在檢測IgH基因重排方面不僅具有簡便、快速、較敏感和特異等優(yōu)點(diǎn)，而且適用于活檢的小塊組織。因此，可望成為鑒別診斷的有效手段

16、。本研究發(fā)現(xiàn)在組織學(xué)及免疫組化顯示良性的26例淋巴細(xì)胞性胃炎中，有26.9出現(xiàn)了lgH基因的單克隆性重排。這一結(jié)果與Sorrentino等的報道類似7。提示某些良性淋巴增生病例中存在病理組織學(xué)及免疫組化不能檢測到的單克隆性病變。盡管這些單克隆性重排并不一定就等于惡性淋巴瘤，其真實的生物學(xué)意義尚待確認(rèn)7，但至少這一重排方式的出現(xiàn)應(yīng)高度懷疑惡性疾病的可能。Sorrentino等認(rèn)為這種B細(xì)胞單克隆的形成可能是癌前病變的潛在標(biāo)志7。因此，對其進(jìn)行監(jiān)測和隨訪是十分重要的。PCR檢測IgH基因重排在傳統(tǒng)病理組織學(xué)和現(xiàn)代分子生物學(xué)之間架起了一座橋梁，該技術(shù)能在DNA水平更早更精確地反應(yīng)淋巴增殖性疾病的性質(zhì)

17、，因此為淋巴瘤的早期診斷，鑒別診斷及隨訪監(jiān)測提供了特異和較為敏感的手段。然而，由于一些良性淋巴增殖疾病中也可能存在單克隆性重排，該技術(shù)本身的假陰性等問題，因此在進(jìn)行基因重排分析時仍需結(jié)合病理形態(tài)觀察，免疫組化染色及病人臨床表現(xiàn)進(jìn)行綜合分析。以期最大限度地提高診斷的準(zhǔn)確性。作者單位：甘華田（610041成都，華西醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院內(nèi)科）歐陽欽（610041成都，華西醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院內(nèi)科）易智慧（610041成都，華西醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院內(nèi)科）馬洪升（610041成都，華西醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院內(nèi)科）李甘地（610041成都，華西醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院病理科）楊秀英（610041成都，華西醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院病理科）參

18、 考 文 獻(xiàn) 1，Dawson IMP.Primary malignant lymphoid tumors of the gastrointestinal tract.Br J Surg,1961,49:80-82. 2，Dixon MF,Genta RM,Yardley JH,et al.Classification and grading of gastritis.Am J Sur Pathol,1996,20:1161-1170. 3，Isaacson PG,Spencer J,Wright DH.Classifying primary gut lymphomas.Lancet,1989,ii:1149. 4，Sukpanichnant S,Vnencakjones CL,Mc Curley TL,et al.Determination of B-cell clonality in paraffin-embedded endoscopic biopsy specimens of abnormal lymphocytic infiltrates a