高靈敏度化學(xué)發(fā)光磁酶免疫法檢測(cè)人絨毛膜促性腺激素

1、高靈敏度化學(xué)發(fā)光磁酶免疫法檢測(cè)人絨毛膜促性腺激素    A useful trade is a mine of gold.                        作者：劉軍濤 劉儒平 王蜜霞 劉春秀 羅金平 蔡新霞 One ploughs, anoth

2、er sow; who will reap  【摘要】  將磁性微粒與抗體的偶聯(lián)，通過(guò)優(yōu)化偶聯(lián)條件提高了偶聯(lián)效率，制備了高靈敏度的磁微粒生物探針；采用3(2螺旋金剛烷)4甲氧基4(3鄰氧酰苯基)1，2二氧雜環(huán)丁烷(AMPPD)堿性磷酸酶(ALP)化學(xué)發(fā)光體系，建立了化學(xué)發(fā)光磁酶免疫檢測(cè)方法；對(duì)檢測(cè)方法進(jìn)行了優(yōu)化和改進(jìn)，提高了系統(tǒng)的靈敏度和檢測(cè)速度，并對(duì)HCG樣品進(jìn)行相關(guān)檢測(cè)。結(jié)果表明，HCG濃度在0.15150 IU/L范圍內(nèi)，光強(qiáng)隨HCG濃度增大而增加，兩者之間線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)r為0.960；檢出限可達(dá)0.15 IU/L; 相

3、對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)小于5; 檢測(cè)總時(shí)間少于1 h。本方法可以應(yīng)用于其它免疫分子的檢測(cè)，在臨床免疫檢測(cè)方面具有廣闊的應(yīng)用前景。   【關(guān)鍵詞】  化學(xué)發(fā)光，磁性微球免疫分析，人絨毛膜促性腺激素Abstract  A highly sensitive magnetic enzymelinked chemiluminescent immunoassay method was developed for the&

4、#160;detection of human chorionic gonadotropin(HCG). The monoclonal antibody was covalently coupled on the surface of carboxylated magnetic beads to generate magneticbiotargeting; Alkaline p

5、hosphatase(ALP) was utilized as a labeled reagent of another monoclonal antibody, whereas 3(2spimadamantane) 4methoxy4(3phosphoryloxy)phenyl1,2dioxetane(AMPPD) was utilized as the chemiluminescent substrat

6、e. Based on this concept, a highly sensitive chemiluminescent immunoassay method was established to test HCG. Then, several modifications were made to optimize the method, and

7、 the detection sensitivity and procedure were improved accordingly. The detection of the assay could be fulfilled within 60 min and the test result of HCG concentration&#

8、160;was linear over the range of 0.15 150 IU/L with good relativity(r=0.960). The relative standard deviation(RSD) were below 5% and the sensitivity of this method was 0.

9、15 IU/L. The proposed method with wide linear range, simple operation and fast detection showed good prospect in practical application onsite.Keywords  Chemiluminescence, magnetic 

10、immunoassay, human chorionic gonadotropin    1  引 言    人絨毛膜促性腺激素(HCG)是由滋養(yǎng)葉層的合體滋養(yǎng)細(xì)胞分泌的一種糖蛋白激素，存在于孕婦的血液、尿、初乳、羊水和胎兒體內(nèi)，對(duì)維持正常妊娠有重要意義1,2()。婦女懷孕后，HCG濃度會(huì)按一定規(guī)律變化。醫(yī)生可根據(jù)異常情況判斷是否先兆流產(chǎn)、異位妊娠、葡萄胎等。某些婦產(chǎn)科疾病、術(shù)后治療過(guò)程等都需要跟蹤HCG指標(biāo)變化3。目前，臨床診斷中HCG檢測(cè)方法有放射免疫分析4、電

11、化學(xué)免疫分析5 、熒光免疫分析和化學(xué)發(fā)光免疫分析等6,7。其中化學(xué)發(fā)光磁酶免疫分析法將磁性分離技術(shù)、化學(xué)發(fā)光檢測(cè)技術(shù)與免疫學(xué)方法三者相結(jié)合，綜合了化學(xué)發(fā)光法靈敏度高、線性范圍廣、測(cè)定速度快以及免疫法的特異性高、準(zhǔn)確性好等優(yōu)點(diǎn)，還利用了磁性微粒在磁場(chǎng)可控運(yùn)動(dòng)的特點(diǎn)，可實(shí)現(xiàn)待測(cè)物的快速富集，具有更快的檢測(cè)速度8,9。國(guó)外已經(jīng)相繼開(kāi)發(fā)出了基于化學(xué)發(fā)光磁酶免疫分析法的試劑盒，成功地應(yīng)用于多種免疫分子的臨床檢測(cè)，但試劑價(jià)格昂貴，其配套裝置也多為大型檢測(cè)儀。    本研究將磁酶免疫與化學(xué)發(fā)光的高靈敏度優(yōu)勢(shì)相結(jié)合，利用3(2螺旋金剛烷)4甲氧基4(3鄰氧酰苯

12、基)1，2二氧雜環(huán)丁烷(AMPPD)堿性磷酸酶(ALP)化學(xué)發(fā)光體系，建立了HCG化學(xué)發(fā)光磁酶免疫檢測(cè)方法(醫(yī)藥學(xué)/臨床醫(yī)學(xué)論文 )。其中發(fā)光底物AMPPD是一種新型二氧雜環(huán)丁烷類化學(xué)發(fā)光試劑，可在堿性磷酸酶（ALP）的催化下發(fā)光。與傳統(tǒng)的化學(xué)發(fā)光試劑相比，性能穩(wěn)定，幾乎無(wú)背景干擾，試劑存放時(shí)間較長(zhǎng)，具有極高的檢測(cè)靈敏度10。磁性納米材料經(jīng)過(guò)相應(yīng)的化學(xué)修飾后，將一種抗體結(jié)合到固相載體磁性微粒上作為捕獲抗體，將另外一種抗體用堿性磷酸酶（ALP）進(jìn)行標(biāo)記，加入待測(cè)物后，發(fā)生免疫反應(yīng)，形成雙抗體夾心物。利用磁分離技術(shù)，經(jīng)過(guò)清洗去除多余抗體后，加入底物AMPPD，根據(jù)發(fā)光強(qiáng)度檢測(cè)待測(cè)物的量。本研究?jī)?yōu)化

13、和改進(jìn)了磁性微粒與抗體的偶聯(lián)和免疫分析條件，可以采用本實(shí)驗(yàn)室自制的小型微弱光檢測(cè)儀1進(jìn)行檢測(cè)，成功實(shí)現(xiàn)了對(duì)HCG的快速、靈敏檢測(cè)。    本方法也可應(yīng)用于其它免疫分子的檢測(cè)，在臨床檢測(cè)方面具有良好的應(yīng)用前景。   實(shí)驗(yàn)部分2.1 儀器與試劑    F4500熒光分光光度計(jì)（日本Hitachi公司）； 尼康TE2000U熒光顯微鏡（日本Nikon公司）；磁分離架（天津倍爾樂(lè)生物公司）；JQ1型免疫反應(yīng)振蕩器（上海強(qiáng)運(yùn)科技有限公司）。    

14、;HCG抗原（青島康原藥業(yè)）；抗HCG抗體（杭州隆基生物有限公司）；堿性磷酸酶標(biāo)記抗HCG抗體（ALPHCG）； AMPPD（福建波生生物有限公司）；羧基末端磁性微球（粒徑3 m，陜西北美基因股份有限公司）；碳二亞胺（EDC）、甘氨酸（上海共價(jià)科技有限公司）；牛血清蛋白（BSA）、乙磺酸（MES）和土溫20（Tween20）均購(gòu)自北京欣京科生物技術(shù)有限公司；0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液（PBS，pH=7.4），0.1 mol/L乙磺酸緩沖液（MES, pH=6.0），清洗液PBST（0.1 mol/L PBS, 

15、0.1% Tween20, pH=6.5），保存液（0.1 mol/L PBS, 1% BSA, pH=7.4）均由實(shí)驗(yàn)室配制；實(shí)驗(yàn)用水均為去離子水；其它試劑均為分析純。2.2 實(shí)驗(yàn)方法2.2.1 羧基末端磁性微球與抗體的偶聯(lián) Joy put heart into a man.  取羧基末端磁性微球1 mg，置于磁分離架上2 min，棄去上清液；加入PBS緩沖液 400 L，吹打均勻，置于磁分離架上分離，棄去上清液，如此清洗2次。清洗完畢后，加入

16、6 g/L EDC溶液(pH 6.0) 400 L進(jìn)行磁性微球活化，吹打均勻后，置于振蕩器上，反應(yīng)30 min。然后加入抗體進(jìn)行偶聯(lián)，向活化后的磁微粒中加入1 g/L抗體溶液400 L，置于振蕩器上反應(yīng)6 h；偶聯(lián)完成后，加入1 mol/L 甘氨酸400 L封閉磁性微球表面的活性基團(tuán)，混勻后，置于振蕩器上反應(yīng)30 min；加入PBST緩沖液 400 L，吹打均勻，置于磁分離架上分離，棄去上清液，如此清洗2次；最后加入1 mL保存液，混勻

17、后置于4 備用。  2.2.2 偶聯(lián)效率的檢測(cè) 為了考察偶聯(lián)條件對(duì)偶聯(lián)效果的影響，本研究采用熒光素標(biāo)記的抗體作為捕獲抗體與磁性微球進(jìn)行偶聯(lián)。首先利用F4500對(duì)偶聯(lián)抗體的激發(fā)光與發(fā)射光進(jìn)行分析，獲得光譜特性。然后將配置不同濃度的偶聯(lián)抗體，利用F4500進(jìn)行熒光光強(qiáng)檢測(cè)，求得抗體濃度與光強(qiáng)的線性關(guān)系。依照上述偶聯(lián)方法進(jìn)行抗體偶聯(lián)，抗體偶聯(lián)完畢后，取上清液檢測(cè)其熒光光強(qiáng)；將光強(qiáng)值代入求得的線性方程中，可求得上清液的抗體濃度。由于偶聯(lián)時(shí)加入的抗體濃度已知，據(jù)此可以求得偶聯(lián)到磁性微球上的抗體的量,計(jì)算抗體的偶聯(lián)效率。2.2.3 化學(xué)發(fā)光光強(qiáng)的檢測(cè)

18、60;  采用了實(shí)驗(yàn)室自制的微弱光檢測(cè)儀1進(jìn)行檢測(cè)，將發(fā)光底物與酶混合后加入微量光學(xué)反應(yīng)池中，光強(qiáng)信號(hào)通過(guò)弱光采集模塊被放大并轉(zhuǎn)化為電信號(hào)輸出。電信號(hào)與光強(qiáng)信號(hào)成正比，可以作為光強(qiáng)輸出值進(jìn)行分析。A man cannot whistle and drink at he same time.  2.3.4  HCG樣品的檢測(cè) One cannot be in two place at once.  取50 L羧基末端磁性微球抗體復(fù)合物加入150 L HCG溶液，再加入70 L堿磷酶標(biāo)記的抗體，37

19、 反應(yīng)20 min；將反應(yīng)產(chǎn)物置于磁分離架2 min，棄去上清液；然后加入去離子水250 L，吹打均勻，置于磁分離架2 min，棄去上清液，如此清洗2次；加入100 L 0.01 mol/L Na2CO3溶液，再加入50 L AMPPD，混勻后置于微弱光檢測(cè)儀中檢測(cè)光強(qiáng)。 論文教育信息網(wǎng)   結(jié)果與討論 羧基末端磁性微球與抗體偶聯(lián)    偶聯(lián)體系pH的選擇  本研究采用羧基末端磁性微球作

20、為捕獲抗體的固相載體，以碳二亞胺EDC為縮合偶聯(lián)劑，使磁性微球表面的羧基與蛋白質(zhì)的氨基脫水形成酰胺鍵，從而實(shí)現(xiàn)抗體與磁性微球的偶聯(lián)。EDC是一種化學(xué)性質(zhì)非?；顫姷碾p功能試劑，受反應(yīng)體系的pH值影響較大。Great winds blow upon high hills.  實(shí)驗(yàn)采用MES緩沖液，加入不同濃度的K2CO3或HCl調(diào)節(jié)偶聯(lián)反應(yīng)體系的pH，研究體系pH對(duì)偶聯(lián)效率的影響，結(jié)果如圖1曲線a所示。結(jié)果表明，偶聯(lián)體系在pH=4時(shí)，偶聯(lián)效率<50%,較低；隨著pH提高，偶聯(lián)效率提高。當(dāng)pH6時(shí)，偶聯(lián)效率達(dá)到70%，磁性微球偶聯(lián)效果最佳；當(dāng)pH>6 時(shí)，偶聯(lián)效率開(kāi)始

21、降低。因此，本實(shí)驗(yàn)中反應(yīng)體系的pH值為6。  偶聯(lián)時(shí)間的影響 在其它條件不變的情況下，進(jìn)行磁性微球與抗體偶聯(lián)，然后在不同時(shí)間終止反應(yīng)，研究反應(yīng)時(shí)間對(duì)偶聯(lián)效率的影響，結(jié)果如圖1曲線b所示。結(jié)果表明：隨著時(shí)間的增加，偶聯(lián)效率不斷增加，在02 h內(nèi)，偶聯(lián)效率從0迅速增長(zhǎng)到50%；26 h時(shí)偶聯(lián)效率從50%迅速增長(zhǎng)到70%，增速變緩；反應(yīng)6 h后，反應(yīng)趨于平衡，偶聯(lián)效率基本保持不變。因此偶聯(lián)時(shí)間選擇6 h，這樣既保證偶聯(lián)效率較高，又避免了反應(yīng)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)造成抗體失活。 HCG檢測(cè)實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化 化學(xué)發(fā)光檢測(cè)時(shí)間的選擇

22、   Nightingales will not sing in a cage.  取0.1 mol/L AMPPD 50 L，加入100 L 3 mg/L ALPHCG(pH=9.5),于檢測(cè)皿中進(jìn)行發(fā)光強(qiáng)度時(shí)間掃描(圖2)。結(jié)果表明，光強(qiáng)隨反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸升高，030 min內(nèi)化學(xué)發(fā)光光強(qiáng)隨時(shí)間的延遲而不斷增長(zhǎng)，這是因?yàn)锳LP催化AMPPD發(fā)光過(guò)程分為兩個(gè)階段：首先，AMPPD在ALP的催化裂解下脫去1個(gè)磷酸基，得到1個(gè)陰離子AMPD，然后AMPD經(jīng)分子內(nèi)電子

23、轉(zhuǎn)移裂解為一分子的金剛烷酮和一分子處于激發(fā)態(tài)的間氧苯甲酸甲酯陰離子，當(dāng)其回到基態(tài)時(shí)會(huì)產(chǎn)生光子，而AMPD在一定環(huán)境下有230 min的半衰期；當(dāng)反應(yīng)30 min時(shí)光強(qiáng)基本穩(wěn)定，繼續(xù)延長(zhǎng)時(shí)間，光強(qiáng)基本保持不變。因此，為了提高檢測(cè)速度，檢測(cè)時(shí)間選擇30 min較理想。Great winds blow upon high hills.   羧基末端磁性微球量的選擇 取50 L ALPHCG，150 L 150 IU/L HCG溶液，然后加入不同量的羧基末端磁性微球抗體復(fù)合物進(jìn)行孵育

24、后，清洗3次，然后加入發(fā)光底物檢測(cè)發(fā)光光強(qiáng)，研究羧基末端磁性微球濃度對(duì)發(fā)光強(qiáng)度的影響，結(jié)果如圖3所示。結(jié)果表明，磁微球量為20 g時(shí)，捕獲抗體濃度較低，免疫反應(yīng)效率低，最終產(chǎn)物發(fā)光強(qiáng)度較低。隨著磁性微球量的增加，發(fā)光強(qiáng)度迅速增加。當(dāng)磁微球的量達(dá)到50 g時(shí)，發(fā)光強(qiáng)度達(dá)到最大。磁微球懸濁液會(huì)吸收穿過(guò)溶液的光，濃度越高吸收得越多，磁微球的量超過(guò)50 g后，發(fā)光光強(qiáng)開(kāi)始減弱。因此，為保證檢測(cè)時(shí)的發(fā)光強(qiáng)度，實(shí)驗(yàn)中選擇磁性微球的量為50 g。The small courtesies sweeten life; the greater ennoble it.

25、0;   ALPHCG濃度的影響  取50 g羧基末端磁性微球抗體復(fù)合物，加入75 IU/L HCG溶液150 L，然后加入不同濃度的ALPHCG進(jìn)行孵育后，清洗3次，然后加入發(fā)光底物檢測(cè)發(fā)光光強(qiáng)，研究ALPHCG濃度對(duì)發(fā)光強(qiáng)度的影響，結(jié)果如圖4所示。結(jié)果表明，當(dāng)反應(yīng)體系中無(wú)ALPHCG時(shí)，發(fā)光強(qiáng)度為零，隨著ALPHCG濃度的增加，發(fā)光強(qiáng)度迅速增加。當(dāng)ALPHCG濃度高于7.5 mg/L，發(fā)光強(qiáng)度增加趨于平緩?？紤]到檢測(cè)試劑的成本，實(shí)驗(yàn)中選擇ALPHCG的濃度為7.5 mg/L。 HC

26、G檢測(cè)結(jié)果 HCG樣品檢測(cè)  用PBS溶液對(duì)HCG原液進(jìn)行梯度稀釋，形成不同濃度的HCG溶液；在最優(yōu)化的配比和檢測(cè)條件下，對(duì)0.15150 IU/L的HCG樣品進(jìn)行檢測(cè)得知，HCG濃度與檢測(cè)發(fā)光強(qiáng)度呈線性關(guān)系。線性回歸方程為：y=6.455x+122.36，相關(guān)系數(shù)r0.960。檢出限可達(dá)0.15 IU/L，每個(gè)樣品測(cè)定總時(shí)間少于1 h，可以滿足對(duì)微量HCG進(jìn)行快速靈敏檢測(cè)的需求。 重現(xiàn)性  對(duì)75 IU/L HCG溶液連續(xù)檢測(cè)6次，檢測(cè)結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為4.9%（見(jiàn)表1），說(shuō)明本方

27、法重現(xiàn)性良好。結(jié)果表明，本方法操作簡(jiǎn)便、靈敏度高，檢測(cè)速度快，適用于檢測(cè)血清中的HCG。表1  系統(tǒng)重現(xiàn)性測(cè)試結(jié)果（略）Answer a fool according to his folly.  【參考文獻(xiàn)】  1 Fang ZiLong(方子龍), Yang ZeYi(楊則宜). Bulletin of Biology(生物學(xué)通報(bào)), 1996, 31(9): 12142 Wang Shan(王 杉), 

28、;Yang ZeYi(楊則宜), Xie MinHao(謝敏豪), Deng Jing(鄧 靜), Fang ZiLong(方子龍), Wan Jin(萬(wàn) 勁), Zhang ChangJiu(張長(zhǎng)久). Chinese Journal of Sports Medicine(中國(guó)運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)雜志), 1997, 16(4): 2802823 Silva R A&

29、#160;G D, Sherman S A, Penni F, Bedows E, Keiderling T A. J. Am. Chem. Soc., 2000, 122: 862386304 Santandreu M, Alegret S, Fabregas E. Anal. Chim., 1999, 396: 1811885 Zhang B, Mao Q G, Zhang X, Jiang T L, Chen M, Yu F, Fu W L