非清髓性骨髓移植誘導(dǎo)同種異基因心臟移植長期免疫耐受的實(shí)驗(yàn)研究

1、    【摘要】  目的比較多種不同的預(yù)處理方案，篩選一種具有低毒性、能誘導(dǎo)出長期穩(wěn)定的同種異基因移植免疫耐受的非清髓性預(yù)處理方案。方法受體BALB/C(H2d)小白鼠，供體C57BL/6（H2b）黑小鼠，建立小鼠耳后心臟移植模型。在心臟移植(HT)前，給予受體腹膜腔內(nèi)注射抗胸腺細(xì)胞血清（ATS）5次、亞致死劑量全身X線照射（TBI）1次、骨髓移植（BMT）等7個(gè)不同組合的預(yù)處理方案，術(shù)后觀察移植心臟跳動(dòng)情況，于骨髓移植后第28 d檢測外周血中嵌合體。結(jié)果一實(shí)驗(yàn)組(ATS+TBI450 cGy +BMT+HT)采用受體在心臟移植前接受

2、5次腹膜腔內(nèi)注射ATS、1次TBI（450 cGy）、靜注供者骨髓細(xì)胞5×107個(gè)等處理的非清髓性治療方案，移植心臟（9/10）存活>100 d；骨髓移植術(shù)后第28 d檢測外周血，均出現(xiàn)完全異體細(xì)胞嵌合狀態(tài)。結(jié)論早期應(yīng)用ATS與亞致死量TBI有著協(xié)同作用；非清髓性預(yù)處理方案（ATS+亞致死量TBI(450 cGy)+BMT）既獲得了持久、穩(wěn)定的供者造血干細(xì)胞嵌合體，也誘導(dǎo)出同種異基因移植長期特異性免疫耐受。 【關(guān)鍵詞】  骨髓移植 心臟移植 基因 移植 同種 合體 免疫耐受    誘導(dǎo)移植免疫耐受是近年來器官移植領(lǐng)域的焦點(diǎn)課題。國外實(shí)驗(yàn)證

3、明了造血干細(xì)胞嵌合體能夠誘導(dǎo)長期、穩(wěn)定的供者特異性免疫耐受，是目前最有可能應(yīng)用于臨床的免疫耐受誘導(dǎo)方法12。為探討一套能夠成功地指導(dǎo)臨床建立穩(wěn)定、持久移植耐受的治療方案，本研究選用成功率高、重復(fù)性好、指標(biāo)客觀、穩(wěn)定的小鼠耳后同種心臟移植模型，通過比較多種不同的預(yù)處理方案，旨在篩選出一種具有低毒性、切合臨床實(shí)際、能誘導(dǎo)出長期穩(wěn)定的供者特異性移植耐受等優(yōu)點(diǎn)的圍術(shù)期預(yù)處理方案，為臨床應(yīng)用提供一些理論與實(shí)驗(yàn)依據(jù)。    1動(dòng)物與方法    1.1動(dòng)物79周齡雄性BALB/C（H2d）小鼠作為骨髓移植受者，79周齡雄性C57BL/6（H2b）小鼠作為供者。供、受者

4、體質(zhì)量2030 g。出生24 h C57BL/6幼鼠作為心臟移植供者。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物由福建醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心提供動(dòng)物合格證號(hào)SCXK（滬）20030003。    1.2方法    1.2.1全身X線照射（TBI）按治療方案所定時(shí)間、劑量給受者BALB/C小鼠進(jìn)行單劑量TBI。X光機(jī)（Philips電器公司，Rahway, NJ）200 kV,10 mA，速率84 cGy/min，0.5 mm銅過濾器。    1.2.2抗胸腺細(xì)胞血清(ATS)注射ATS購自 Accurate Chemical  Scientific Co

5、rporation (NY,USA)。購回后即用BALB/C小鼠紅細(xì)胞進(jìn)行脫毒（去掉變應(yīng)原）處理，分裝后置-20 冷藏備用。每只小鼠1次劑量ATS 0.05 mL+生理鹽水0.5 mL，腹膜腔內(nèi)注射。    1.2.3骨髓細(xì)胞懸液制備無菌條件下，取供者雙側(cè)股骨與脛骨，給予2%胎牛血清PBS溶液沖洗骨髓腔，經(jīng)60目尼龍網(wǎng)過濾，制備單細(xì)胞懸液，調(diào)整濃度為1×108 mL-1備用。    1.2.4骨髓細(xì)胞移植（bone marrow transplantation,BMT）經(jīng)尾靜脈給予每只受者注射0.5 mL懸液（含有核骨髓細(xì)胞5×107

6、個(gè)）。    1.2.5小鼠耳后心臟移植將C57BL/6幼鼠置于冰中，23 min無菌切開胸骨，取出整個(gè)心臟，置于4 生理鹽水中，隨后將供心移植在受者耳廓皮下。術(shù)后第5 d起，在10倍放大鏡下觀察移植心臟跳動(dòng)情況。如術(shù)后1012 d仍未出現(xiàn)心臟跳動(dòng)，則為手術(shù)失敗，不列入實(shí)驗(yàn)結(jié)果。以心臟跳動(dòng)完全停止日定為排斥時(shí)間，并隔日進(jìn)行復(fù)查，連續(xù)3次結(jié)果一致，則確認(rèn)為排斥反應(yīng)，并取下移植心臟送病理檢查。    1.2.6嵌合體檢測主要試劑：抗小鼠單克隆抗體熒光標(biāo)志物為antiCD16/CD32(FcrIII/II)，antiH2KbFITC，antiH2KdFITC，

7、antiTCRPE，antiGr1PE，antiMac1PE，antiB220PE(美國Pharmingen公司)。    在骨髓移植后第28 d采受者眼球后全血，分別    進(jìn)行T細(xì)胞、粒細(xì)胞/巨噬細(xì)胞、B細(xì)胞單克隆抗體熒光染色。所有標(biāo)本均使用FAC Scan流式細(xì)胞儀（Becton Dickinson，MV，CA）檢測與分析。    1.2.7組織形態(tài)學(xué)隨機(jī)抽取部分被排斥的與長期存活（>100 d）的移植心臟標(biāo)本，做組織切片及HE 預(yù)處理治療方案組所有受者除了進(jìn)行如下各方案治療外，不用其他任何免疫抑制劑；所有供者均未作任何特

8、殊治療。一次性TBI照射，劑量800 cGy 或450 cGy；ATS 為隔天腹膜腔內(nèi)注射1次，共5次；每只骨髓移植（BMT）細(xì)胞數(shù)5×107/0.5 mL。分7個(gè)治療方案進(jìn)行研究：    (1)TBI（800）+BMT+HT    Day-1Day0Day28    TBI（800 cGy）BMT,HT檢測嵌合狀態(tài)    (2）TBI（450）+BMT+HT    Day-1Day0Day28    TBI（450 cGy）BMT,HT檢測嵌合狀態(tài)  &

9、#160; (3）ATS+TBI（450）+BMT+HT    Day -12,-10,-8,-6,-4Day -1Day0Day28    注射ATS（共5次）TBI（450 cGy）BMT,HT檢測嵌合狀態(tài)    (4）ATS+HT    Day -12,-10,-8,-6,-4Day 0    注射ATS（共5次）HT    (5）ATS+BMT+HT    Day -12,-10,-8,-6,-4 Day0Day28    注射

10、ATS（共5次）BMT,HT檢測嵌合狀態(tài)    (6）TBI（450）+HT    Day-1Day0    TBI（450 cGy）HT    (7）ATS+TBI（450）+HT    Day -12,-10,-8,-6,-4Day -1Day0    注射ATS（共5次）TBI（450 cGy）HT    1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以實(shí)際數(shù)據(jù)與x±s表    示。多組間比較采用方差分析，兩兩比較采用StudentNewma

11、nKeuls 檢驗(yàn)。    2結(jié)果    2.1移植心臟存活時(shí)間術(shù)前受體給AST（5次）+TBI（450 cGy）+BMT預(yù)處理的第3組和術(shù)前受體給致死劑量TBI（800 cGy）+BMT的第1組，移植心臟平均存活時(shí)間均>100 d，獲長期存活，2組之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。受體術(shù)前只給亞致死量TBI、沒有ATS（第2組），其移植心臟存活時(shí)間（22.1±9.4）d，明顯比第1，3組短（P100 d)未見明顯的排斥反應(yīng)之病理表現(xiàn)，心肌纖維細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，未見淋巴細(xì)胞浸潤，亦未見明顯纖維增生(圖3)。病理檢查結(jié)果與肉眼觀察結(jié)果一致

12、。 表1移植心臟存活時(shí)間表2骨髓移植后第28 d受者外周血中供者有核細(xì)胞的比例TBI：全身照射（劑量單位：cGy）；BMT:骨髓移植；HT:心臟移植；ATS：抗胸腺細(xì)胞血清.    1,2,3,5分別為實(shí)驗(yàn)1組TBI(800 cGy)+BMT+HT，實(shí)驗(yàn)2組TBI(450 cGy)+BMT+HT，實(shí)驗(yàn)3組ATS+TBI(450 cGy)+BMT+HT，實(shí)驗(yàn)5組（ATS+BMT+HT）；a:PhyEryTCR 染色 的T細(xì)胞；b：PhyEryGr1  Mac1染色的粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞；c：PhyEryB220染色的B細(xì)胞.    3討論&

13、#160;   1980 年代以來，隨著環(huán)孢菌素A（CsA）等強(qiáng)效免疫抑制劑的應(yīng)用，器官移植迅猛發(fā)展，移植成功率明顯提高。盡管如此，排斥反應(yīng)在大多數(shù)病人身上仍不可避免，尤其是慢性排斥反應(yīng)以及免疫抑制劑對(duì)自體器官與移植物的毒性損害愈顯突出，這也是目前同種異基因移植面臨的最大障礙。因此尋找一種既能使移植物長期、正常存活，又不損害宿主免疫系統(tǒng)功能的理想方法，即誘導(dǎo)對(duì)供受者雙重特異性免疫耐受，才是真正解決排斥、避免藥物毒副作用、提高移植物與受者長期存活率的根本途徑。    3.1嵌合體形成是誘導(dǎo)長期免疫耐受的重要條件許多學(xué)者從動(dòng)物實(shí)驗(yàn)上論證了造血干細(xì)胞嵌合體誘導(dǎo)供者特異性免疫耐受的重要性34。骨髓細(xì)胞中含有大量造血干細(xì)胞和未成熟樹突狀細(xì)胞，所以輸注供體骨髓細(xì)胞可以促進(jìn)嵌合體形成。本實(shí)驗(yàn)第1組給予致死劑量TBI(800 cGy),獲得了穩(wěn)定的嵌合狀態(tài)與移植物的長期免疫耐受。此方案在臨床上雖有用于治療一些重癥惡性白血病、淋巴瘤的成功報(bào)道，但其毒性大、早期感染發(fā)生率高，而且如果供者骨髓細(xì)胞輸入后未能植活，則將導(dǎo)致受體造血功能衰竭，所以危險(xiǎn)性極大，不適