試述高效液相色譜——二極管陣列檢測(cè)法測(cè)定芫花藥材指紋圖譜

1、試述高效液相色譜二極管陣列檢測(cè)法測(cè)定芫花藥材指紋圖譜    【摘要】 目的建立芫花藥材的高效液相指紋圖譜分析方法。方法采用Diamond?kC18色譜柱（4.6 mm × 250 mm, 5 m），甲醇?菜?梯度洗脫，體積流量為1 ml/min，柱溫35 ，檢測(cè)波長(zhǎng)332 nm，記錄時(shí)間50 min。以芫花素為參照物，對(duì)17批樣品進(jìn)行測(cè)定并計(jì)算相似度。結(jié)果初步建立芫花藥材的指紋圖譜，標(biāo)定7個(gè)共有峰，各產(chǎn)地藥材之間的相似性良好。結(jié)論該方法穩(wěn)定可靠，簡(jiǎn)單可行，能夠提高芫花藥材的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)。 論文百事通 【關(guān)鍵詞】 芫花藥材 反相高效液相 指紋圖譜

2、 相似度 Abstract：ObjectiveTo establish the analytical method for the fingerprint of Flos Genkwa by HPLC?DAD. Methods HPLC condition: column Diamond?k C18 (4.6 mm × 250 mm, 5 m), the mobile phase was mixtures of methanol and water in gradient elution mode, the flow was 1 ml/min, the column temperat

3、ure was 35 , the detection wavelength was set at 332 nm, and record time was 50 min. Genkwanin was used as the reference compound and 17 batches of Flos Genkwa were determined. Results7 co?possessing peaks were selected as the common peaks, and the similarity of the fingerprint was close in differen

4、t growing region. ConclusionThis method is simple, accurate and can provide scientific reference for further quality control of Daphne genkwa Sieb. et Zucc. Key words：Flos Genkwa; HPLC-DAD; Fingerprint; Similarity 芫花為瑞香科植物芫花Daphne genkwa Sieb. et Zucc.的干燥花蕾，為傳統(tǒng)的瀉下逐水藥，有毒，具有瀉水逐飲、解毒殺蟲(chóng)的功效，內(nèi)服用于治療水腫脹滿，胸腹積

5、水，痰飲積聚，氣逆咳喘，二便不利，外用治療疥癬禿瘡，凍瘡1。現(xiàn)代研究表明芫花還具有治療慢性支氣管炎、肝炎、妊娠中期引產(chǎn)、抗白血病等作用2。 芫花中的黃酮類(lèi)成分（芫花素等）為其鎮(zhèn)咳祛痰、殺蟲(chóng)的有效成分；二萜原酸酯類(lèi)成分（芫花酯甲等）是利水、殺蟲(chóng)的有效成分，也是毒性成分2。兩種成分含量測(cè)定方法及含量限度要求已另文發(fā)表3，4。作為多組分的中藥材，僅有某個(gè)有效成分或毒性成分的定性定量研究不足以全面反映芫花藥材質(zhì)量。指紋圖譜在控制多組分成分方面具有整體性和特征性的優(yōu)點(diǎn)。目前尚未見(jiàn)到芫花藥材指紋圖譜研究的文獻(xiàn)報(bào)道。因此本實(shí)驗(yàn)采用HPLC?DAD法對(duì)其進(jìn)行研究，以芫花素為參照物，測(cè)定17批樣品并計(jì)算相似度，

6、標(biāo)定了7個(gè)共有峰，初步確定了芫花藥材的指紋圖譜，以期為提高該藥材的全面質(zhì)量控制建立一種快速、簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確有效的方法。 1 儀器與試藥 Waters 高效液相色譜儀（600 Pump; Waters 600 Controller; Waters 996 PDA Detector）Millennium32色譜管理軟件（美國(guó)Waters公司）。 芫花素對(duì)照品為自制，經(jīng)UV，1H NMR，13C NMR鑒定結(jié)構(gòu)，經(jīng)HPLC檢測(cè)，面積歸一化法計(jì)算純度大于98 %，符合含量測(cè)定的要求。甲醇為色譜純，水為自制高純水，其余試劑均為分析純。 芫花藥材共17批，其中市售品15批，分別購(gòu)自河北安國(guó)（3批）、安徽亳州（

7、2批）、廣西（4批）、河南鄭州（2批），河南登封（3批）、廣州清平（1批）；采集品2批，采自河南信陽(yáng)；經(jīng)原思通研究員鑒定均來(lái)源于瑞香科植物芫花Daphne genkwa Sieb. et Zucc.的干燥花蕾或花。 2 方法與結(jié)果 2.1 色譜條件色譜柱為Diamonsil?k C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 m）。流動(dòng)相為甲醇、水，兩相梯度洗脫，0 min，45 甲醇；10 min，55 甲醇；20 min，65 甲醇；40 min，80甲醇；50 min，100 甲醇沖柱30 min，然后用45 甲醇平衡柱子30 min。體積流量為 1 ml/min。柱溫為35 。

8、檢測(cè)波長(zhǎng)332 nm。記錄50 min的色譜圖。 2.2 對(duì)照品溶液的制備取芫花素對(duì)照品約0.5 mg，精密稱(chēng)定，置25 ml量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，每毫升中含芫花素0.021 6 g/l。 2.3 供試品溶液的制備 取各地樣品0.5 g，精密稱(chēng)重，準(zhǔn)確加入甲醇25 ml，稱(chēng)重，超聲10 min，待其冷卻至室溫，稱(chēng)重，用甲醇補(bǔ)足減失重量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液過(guò)微孔濾膜（0.45 m），即得。 2.4 樣品測(cè)定 精密吸取各樣品的供試品溶液10 l和對(duì)照品溶液5 l，注入液相色譜儀，記錄液相色譜圖。 百事通 2.5 方法學(xué)考察 2.5.1 精密度實(shí)驗(yàn)取供試品溶液（第6號(hào)樣品），連續(xù)進(jìn)樣5次，測(cè)

9、定，計(jì)算各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD均小于3 ，表明儀器性能良好。 2.5.2 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)取第6號(hào)樣品5份，制備供試品溶液，分別進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算得各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD均小于3 ，表明樣品的制備方法穩(wěn)定。 2.5.3 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)取第6號(hào)樣品5份，分別在0，2，4，6，8，12 h進(jìn)樣，測(cè)定，計(jì)算得各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD均小于3 ，表明樣品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定性較好。 2.6 指紋圖譜及技術(shù)參數(shù)5在上述條件下測(cè)定17批樣品，選擇各樣品中共有的7個(gè)色譜峰作為共有峰。以芫花素色譜峰（7，S）為參照峰，其保留時(shí)間和峰面積為1，分別求出其他各組份的相對(duì)

10、保留時(shí)間和相對(duì)峰面積，結(jié)果見(jiàn)表12。 表1 17批芫花藥材指紋圖譜中共有峰的相對(duì)保留時(shí)間表2 17批芫花藥材各批樣品中各共有峰的相對(duì)面積 2.7 相似度評(píng)價(jià)及對(duì)照指紋圖譜的建立 采用中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2000A版）對(duì)各樣品色譜圖的原始數(shù)據(jù)文件（輸出格式為aia）進(jìn)行分析，自動(dòng)匹配，并以17批樣品生成的對(duì)照譜圖（中位數(shù)法）作為對(duì)照模板，得到芫花對(duì)照藥材的對(duì)照指紋圖譜(見(jiàn)圖1)；計(jì)算各色譜圖的整體相似度均在0.9以上，見(jiàn)表3。 3 討論 3.1 流動(dòng)相的確定為獲取足以代表芫花特征的指紋圖譜，在選擇HPLC色譜條件的過(guò)程中，曾以甲醇?菜?系統(tǒng)和乙腈?菜?系統(tǒng)為流動(dòng)相，分別進(jìn)行考察，結(jié)果

11、顯示甲醇?菜?系統(tǒng)所得色譜圖基線平穩(wěn)，主要色譜峰均基本達(dá)到基線分離，因此確定以甲醇?菜?系統(tǒng)為流動(dòng)相。 3.2 檢測(cè)波長(zhǎng)和采集時(shí)間的選擇 為了獲得更多的樣品信息，采用光電二極管陣列檢測(cè)器（DAD）全波長(zhǎng)掃描的方法，采集不同波長(zhǎng)下的色譜圖，以332 nm下基線平穩(wěn)，且色譜峰數(shù)目較多，各峰的分離度較好，峰高合適，因此確定332 nm為檢測(cè)波長(zhǎng)。實(shí)驗(yàn)中記錄了110 min的色譜圖，發(fā)現(xiàn)50 min以后無(wú)色譜峰出現(xiàn)，故確定采集時(shí)間為50 min。表3 17批芫花藥材指紋圖譜相似度結(jié)果 3.3 提取溶劑的選擇采用多種提取溶劑，如三氯甲烷、乙醇、甲醇作為溶劑進(jìn)行提取，研究中發(fā)現(xiàn)，而三氯甲烷和乙醇中色譜峰數(shù)

12、目較少，且芫花素峰面積較小，說(shuō)明這兩種試劑對(duì)該藥材中成分的提取效果較差；而甲醇提取液中色譜峰較多，且分離度較好，因此選擇甲醇為提取溶劑。 3.4 小結(jié)本實(shí)驗(yàn)以HPLC?DAD法測(cè)定芫花藥材的指紋圖譜，方法簡(jiǎn)便，可操作性強(qiáng)，對(duì)于提高該藥材的質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)提供了實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。所建立的芫花藥材HPLC對(duì)照指紋圖譜可以作為芫花藥材真?zhèn)舞b別的參考依據(jù)。如果能夠獲得更多代表性的樣品，按照不同產(chǎn)地、不同采收期分別進(jìn)行測(cè)定，比較異同點(diǎn)；或者在樣品制備過(guò)程中采用現(xiàn)代方法（如大孔樹(shù)脂法等），獲得更多成分的信息，將會(huì)獲得更全面的科學(xué)依據(jù)。芫花藥材主要包括黃酮類(lèi)成分和二萜原酸酯類(lèi)成分，兩類(lèi)成分極性和含量差異較為懸殊，很難在同一色譜圖上顯現(xiàn)各自的成分群。本實(shí)驗(yàn)方法主要對(duì)芫花藥材中的黃酮類(lèi)成分進(jìn)行測(cè)定，對(duì)二萜原酸酯類(lèi)成分群的指紋圖譜研究將需做進(jìn)一步的研究，使芫花藥材的質(zhì)量評(píng)價(jià)體系更為完善。 【參考文獻(xiàn)】 1 國(guó)家藥典委員會(huì). 中國(guó)藥典, 部S. 北京: 化學(xué)工業(yè)出版社, 2005: 109.2 張保獻(xiàn), 原思通, 張靜修, 等. 芫花的現(xiàn)代研究概況J. 中國(guó)中醫(yī)藥信息雜志, 1995,