細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)(共4頁(yè))

1、精選優(yōu)質(zhì)文檔-傾情為你奉上細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)當(dāng)單個(gè)細(xì)胞在體外增殖6代以上，其后代所組成的細(xì)胞群體，成為集落或克隆。每個(gè)克隆含有50以上的細(xì)胞，大小在0.3-1.0mm之間。集落形成率表示細(xì)胞的獨(dú)立生存能力。各種理化因素可能導(dǎo)致細(xì)胞的克隆形成能力發(fā)生改變。通過(guò)一定的實(shí)驗(yàn)方法可以對(duì)細(xì)胞的克隆形成能力進(jìn)行檢測(cè)。細(xì)胞接種存活率只表示接種細(xì)胞后貼壁的細(xì)胞數(shù)，但貼壁后的細(xì)胞不一定每個(gè)都能增殖和形成克隆。而形成克隆的細(xì)胞必為貼壁和有增殖活力的細(xì)胞。克隆形成率反映細(xì)胞群體依賴(lài)性和增殖能力兩個(gè)重要性狀。由于細(xì)胞生物學(xué)性狀不同，細(xì)胞克隆形成率差別也很大：一般初代培養(yǎng)細(xì)胞克隆形成率弱，傳代細(xì)胞系強(qiáng)；二倍體細(xì)胞克隆形成

2、率弱，轉(zhuǎn)化細(xì)胞系強(qiáng)；正常細(xì)胞克隆形成率弱，腫瘤細(xì)胞強(qiáng)。實(shí)驗(yàn)方法：平板集落形成實(shí)驗(yàn)、軟瓊脂集落形成實(shí)驗(yàn) (a) 平板集落形成實(shí)驗(yàn)：本法適用于貼壁生長(zhǎng)的細(xì)胞和正常培養(yǎng)的細(xì)胞 (b) 軟瓊脂集落形成實(shí)驗(yàn)：本法適用于非錨著依賴(lài)性生長(zhǎng)的細(xì)胞，如骨髓造血干細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞株、轉(zhuǎn)化細(xì)胞系。平板克隆形成實(shí)驗(yàn)基本步驟：1、取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的各組細(xì)胞，分別用0.25%胰蛋白酶消化并吹打成單個(gè)細(xì)胞，并把細(xì)胞懸浮在10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中備用。2、將細(xì)胞懸液作梯度倍數(shù)稀釋?zhuān)拷M細(xì)胞分別以每皿50、100、200個(gè)細(xì)胞的梯度密度分別接種含10mL 37預(yù)溫培養(yǎng)液的皿中，并輕輕轉(zhuǎn)

3、動(dòng)，使細(xì)胞分散均勻。置37 5% CO2及飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)23周。3、經(jīng)常觀(guān)察，當(dāng)培養(yǎng)皿中出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)的克隆時(shí)，終止培養(yǎng)。棄去上清液，用PBS小心浸洗2次。加4%多聚甲醛固定細(xì)胞5mL固定15分鐘。然后去固定液，加適量GIMSA應(yīng)用染色液染1030分鐘，然后用流水緩慢洗去染色液，空氣干燥。4、將平皿倒置并疊加一張帶網(wǎng)格的透明膠片，用肉眼直接計(jì)數(shù)克隆，或在顯微鏡（低倍鏡）計(jì)數(shù)大于10個(gè)細(xì)胞的克隆數(shù)。最后計(jì)算克隆形成率?？寺⌒纬陕?=（克隆數(shù)/接種細(xì)胞數(shù)）×100%平板克隆形成試驗(yàn)方法簡(jiǎn)單，適用于貼壁生長(zhǎng)的細(xì)胞。適宜底物為玻璃的、塑料瓶皿。試驗(yàn)成功的關(guān)鍵是細(xì)胞懸液的制備和接種密

4、度。細(xì)胞一定要分散得好，不能有細(xì)胞團(tuán)，接種密度不能過(guò)大。平板克隆形成試驗(yàn)方法簡(jiǎn)單，適用于貼壁生長(zhǎng)的細(xì)胞。適宜底物為玻璃的、塑料瓶皿。試驗(yàn)成功的關(guān)鍵是細(xì)胞懸液的制備和接種密度。細(xì)胞一定要分散得好，不能有細(xì)胞團(tuán)，接種密度不能過(guò)大。軟瓊脂培養(yǎng)克隆形成試驗(yàn)基本步驟： (1)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，用0.25%胰蛋白酶消化并輕輕吹打，使之成為單細(xì)胞，作活細(xì)胞計(jì)數(shù)，用含20%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞密度至1×106細(xì)胞/L。然后根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求作梯度倍數(shù)稀釋。 (2)用蒸餾水分別制備出1.2%和0.7%兩個(gè)濃度的低溶點(diǎn)瓊脂糖液，高壓滅菌后，維持在40中不會(huì)凝固。 (3

5、)按1:1比例使1.2%的瓊脂糖和2×DMEM培養(yǎng)基(含有2×抗生素和20%的小牛血清)混合后，取3mL混合液注入直徑6cm平皿中(10cm平皿加710mL)，冷卻凝固，可作底層瓊脂置CO2溫箱中備用。 (4)按1:1比例讓0.7%的瓊脂糖和2×DMEM培養(yǎng)基在無(wú)菌試管中相混以后，再向管中加入0.2mL的細(xì)胞懸液，充分混勻，注入鋪有1.2%瓊脂糖底層平皿中，逐形成雙瓊脂層。待上層瓊脂凝固后，置入37 5%CO2溫箱中培養(yǎng)1014天。 (5)把平皿放置在倒置顯微鏡下，觀(guān)察細(xì)胞克隆數(shù)。計(jì)算形成率。 軟瓊脂培養(yǎng)法常用檢測(cè)腫瘤細(xì)胞和轉(zhuǎn)化細(xì)胞系。試驗(yàn)中瓊

6、脂與細(xì)胞相混時(shí)，瓊脂溫度不宜超過(guò)40。接種細(xì)胞的密度每平方厘米不超過(guò)35個(gè)，一般6cm的平皿接種1000個(gè)細(xì)胞。正常細(xì)胞在懸浮狀態(tài)下不能增殖，不適用于軟瓊脂克隆形成試驗(yàn)。 軟瓊脂集落形成率實(shí)驗(yàn)(軟瓊脂克隆)   將1.2低熔點(diǎn)瓊脂糖與2×細(xì)胞培養(yǎng)基以1:1 的體積比混合制備0.6的底層瓊脂，6 孔板中每個(gè)孔1.4ml 溫室凝固，取對(duì)數(shù)期細(xì)胞，胰酶消化后吹散成單個(gè)細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)，并調(diào)細(xì)胞濃度為10000 個(gè)/ml，將0.6低熔點(diǎn)瓊脂糖與2×細(xì)胞培養(yǎng)基以1:1 的體積比混合，制備0.3的上層瓊脂，每孔加1ml 上層瓊脂和100ul 單細(xì)胞懸液（約1

7、000cell/well)，混勻，室溫凝固。置于37，5CO2 的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)23 周，計(jì)數(shù)含50 個(gè)細(xì)胞以上得克隆，計(jì)算細(xì)胞集落形成率，SpotII 采集圖像。注意事項(xiàng)1.接種時(shí)細(xì)胞密度適度，不可過(guò)高。2.軟瓊脂與細(xì)胞混合時(shí)溫度不能超過(guò)40，否則將會(huì)燙傷/死細(xì)胞；3.瓊脂對(duì)熱和酸不穩(wěn)定，若反復(fù)加熱，容易降解而產(chǎn)生毒性，且硬度下降。因此高壓滅菌后應(yīng)進(jìn)行分裝；4.細(xì)胞在進(jìn)行克隆形成實(shí)驗(yàn)時(shí)要求有95%以上的分散度，否則結(jié)果的準(zhǔn)確度會(huì)受到很大影響；5.細(xì)胞在低密度、非貼壁狀態(tài)條件下培養(yǎng)，生存率明顯下降，永生細(xì)胞系/株克隆形成率可達(dá)到10%以上，但初代培養(yǎng)細(xì)胞和有限傳代細(xì)胞系克隆形成率僅為0.5%-5%，甚至無(wú)法形成單個(gè)克隆。因此，為了提高克隆形成率，有時(shí)需要在培養(yǎng)基中添加胰島素、地塞米松等促克隆形成物質(zhì)