PCR檢測(cè)常見問題與解決途徑

1、PCR檢測(cè)常見問題與解決途徑利用PCR方法檢測(cè)轉(zhuǎn)基因成分時(shí)， 經(jīng)常出現(xiàn)假陽性、假陰性、非特異性擴(kuò)增和涂抹帶。 尤其是假陽性和假陰性可使檢測(cè)結(jié)果得出錯(cuò)誤結(jié)論，有時(shí)可造成嚴(yán)重后果。 為了提高轉(zhuǎn)基因檢測(cè)的準(zhǔn)確性和可靠性，PCR檢測(cè)應(yīng)盡量減少假陽性、假陰性、非特異性擴(kuò)增和涂抹帶現(xiàn)象的發(fā)生。一個(gè)好的 PCR方法不但要求特異性好、靈敏度高、還要求具有高的可重復(fù)性、 重現(xiàn)性、魯棒性，盡量減少假陽性、假陰性和非特異性擴(kuò)增。本文對(duì)PCR檢測(cè)中出現(xiàn)的假陽性、假陰性、非特異性擴(kuò)增和涂抹帶的原因及其解決方 法予以綜述。一、假陽性：（一）假陽性現(xiàn)象假陽性是指檢測(cè)陰性材料得到陽性結(jié)果。如果一次實(shí)驗(yàn)中的幾個(gè)陰性對(duì)照中出現(xiàn)一

2、個(gè)或幾個(gè)陽性結(jié)果，提示本次實(shí)驗(yàn)中其它標(biāo)本的檢測(cè)結(jié)果可能有假陽性。實(shí)驗(yàn)中設(shè)立的陰性對(duì)照可提示有無假陽性結(jié)果出現(xiàn)。（二）造成假陽性的原因1 .樣品間交叉污染：樣本污染主要有收集樣本的容器被污染，或樣本放置時(shí)，由于密 封不嚴(yán)溢于容器外，或容器外粘有樣本而造成相互間交叉污染；樣本核酸模板在提取過程中,由于吸樣槍污染導(dǎo)致標(biāo)本間污染；2 . PCR試劑的污染：主要是由于在 PCR試劑配制過程中，由于加樣槍、容器、雙蒸 水及其它溶液被PCR核酸模板污染。3 . PCR擴(kuò)增產(chǎn)物污染：這是PCR反應(yīng)中最主要最常見的污染問題。 因?yàn)镻CR產(chǎn)物拷 貝量大（一般為1013拷貝/ml）,遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于PCR檢測(cè)數(shù)個(gè)拷貝的極限

3、， 所以極微量的PCR產(chǎn) 物污染，就可形成假陽性。4 .氣溶膠污染：在空氣與液體面摩擦?xí)r就可形成氣溶膠，在操作時(shí)比較劇烈地?fù)u動(dòng)反應(yīng)管，開蓋時(shí)、吸樣時(shí)及污染進(jìn)樣槍的反復(fù)吸樣都可形成氣溶膠而污染。據(jù)計(jì)算一個(gè)氣溶膠顆?？珊?8000拷貝，因而由其造成的污染是一個(gè)值得特別重視的問題。5 .實(shí)驗(yàn)室中克隆質(zhì)粒的污染：由于克隆質(zhì)粒在單位容積內(nèi)含量相當(dāng)高，另外在純化過程中需用較多的用具及試劑，而且在活細(xì)胞內(nèi)的質(zhì)粒，由于活細(xì)胞的生長繁殖的簡便性及具有很強(qiáng)的生命力，其污染可能性也很大。在分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室及某些用克隆質(zhì)粒做陽性對(duì)照 的檢驗(yàn)室，這個(gè)問題比較常見。（三）假陽性問題的試驗(yàn)控制在每次PCR檢測(cè)時(shí)，一定設(shè)立陰

4、性對(duì)照樣品和陽性對(duì)照樣品。陰性對(duì)照樣品檢測(cè)為陰性時(shí)，表明試驗(yàn)全部過程的試劑沒有受到污染；陽性對(duì)照樣品檢測(cè)為陽性時(shí)，表明DNA提?。≧NA提取、RNA反轉(zhuǎn)錄）、DNA擴(kuò)增和電泳鑒定工作體系正常。在陰性對(duì)照樣品和 陽性對(duì)照樣品檢測(cè)結(jié)果成立的前提下，才能對(duì)檢測(cè)樣品進(jìn)行判定。 只有設(shè)立試驗(yàn)全程的對(duì)照，才能證明試驗(yàn)結(jié)果成立。造成假陰性的原因可以通過設(shè)置試驗(yàn)對(duì)照來查找。試驗(yàn)對(duì)照包括:1、DNA陽性對(duì)照：以含有目的片段的 DNA（或質(zhì)粒）作為模板進(jìn)行擴(kuò)增，證明 PCR 試劑是否有效、擴(kuò)增過程是否正確及待測(cè)樣品中是否含有目的片段。（注意：陽性樣品擴(kuò)增效率高，應(yīng)嚴(yán)格控制，避免其成為潛在的污染源）。2、DNA陰性

5、對(duì)照：以不含有目的片段的陰性樣品作為模板進(jìn)行擴(kuò)增，用于證明擴(kuò)增 過程中無假陽性現(xiàn)象。3、空白對(duì)照：以純水作為模板進(jìn)行擴(kuò)增，用于證明擴(kuò)增過程中無假陽性現(xiàn)象。4、PCR抑制物對(duì)照：在與陽性對(duì)照相同的反應(yīng)體系中，加入相同數(shù)量的待測(cè)樣品 DNA,如果未擴(kuò)增出目的片段，證明此待測(cè)樣品DNA中存在PCR抑制物。5、空白提取對(duì)照：空白提取對(duì)照擴(kuò)增結(jié)果為陽性，說明DNA提取試劑可能受到污染。6、陽性提取對(duì)照：陽性提取對(duì)照擴(kuò)增結(jié)果為陰性，說明提取過程可能有誤。如果DNA陽性對(duì)照擴(kuò)增結(jié)果為陰性， 或者DNA陰性對(duì)照和空白對(duì)照擴(kuò)增結(jié)果為陽性， 則說明PCR試劑或擴(kuò)增過程存在問題。（四）假陽性解決途徑由于PCR的敏感

6、性和效率特別高，所以少量的擴(kuò)增產(chǎn)物污染標(biāo)本或反應(yīng)管即可出現(xiàn) 假陽性。尤其是PCR擴(kuò)增產(chǎn)物和質(zhì)粒分子很容易造成實(shí)驗(yàn)室的污染，導(dǎo)致假陽性現(xiàn)象發(fā)生。1、規(guī)范實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)室設(shè)置上分配液區(qū)、 DNA提取區(qū)、擴(kuò)增區(qū)、電泳區(qū)。物流應(yīng)按分配液區(qū)、模板提 取區(qū)、擴(kuò)增區(qū)、電泳區(qū)順序，嚴(yán)禁倒流。在連續(xù)而獨(dú)立的空間中完成不同實(shí)驗(yàn)步驟。不同工 作區(qū)域相互隔離，通過傳遞倉傳遞。PCR前處理區(qū)（樣品制備室、DNA提取室）和PCR準(zhǔn)備室設(shè)置正壓通風(fēng)系統(tǒng)，并設(shè)置通風(fēng)柜或生物反應(yīng)柜造成局部負(fù)壓；后PCR室（PCR室及電泳室為高度污染區(qū)） 設(shè)置負(fù)壓通風(fēng)系統(tǒng)，防止大量游離分子及氣溶膠，對(duì)其它區(qū)域造成環(huán)境污染。配制PCR反應(yīng)體系（配

7、備冰箱及生物安全小I,此實(shí)驗(yàn)室要求無模板DNA存在）和向PCR反應(yīng)體系中加入模板 DNA （配備生物安全柜及冰箱）要求在不同區(qū)域進(jìn)行。2、規(guī)范試劑耗材管理1）驗(yàn)證：新購買的試劑需進(jìn)行實(shí)驗(yàn)前驗(yàn)證；2）分裝：雙蒸水、引物和 dNTP均應(yīng)分裝儲(chǔ)存，并標(biāo)明日期，以防污染；試劑的分裝 應(yīng)在裝有紫外燈的超凈工作臺(tái)上進(jìn)行；試劑分裝成小份一次使用后棄去。3）消毒：除酶及不能耐高溫的物質(zhì)外，所有試劑或器材均應(yīng)高壓消毒。必要時(shí)，在加 樣本前，反應(yīng)管和試劑用紫外線照射，以破壞存在的核酸。3、規(guī)范實(shí)驗(yàn)室操作1）控制污染源：PCR產(chǎn)物和質(zhì)粒操作空間是最大的污染源，應(yīng)嚴(yán)格防止將這個(gè)空間 的物品帶出；2） 一次性用具：使用

8、實(shí)驗(yàn)服和一次性手套，使用帶有濾膜的移液器槍頭，一次性反應(yīng) 管和離心管；3）定期消毒：定期對(duì)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行紫外照射，用10%漂白劑、3%雙氧水或?qū)Ｓ蒙虡I(yè)產(chǎn)品清理實(shí)驗(yàn)室臺(tái)面及死角。4）定期通風(fēng)：對(duì)實(shí)驗(yàn)室定期進(jìn)行正壓、負(fù)壓通風(fēng)處理；5）小心操作：操作時(shí)應(yīng)小心輕柔，防止將靶序列吸入加樣槍內(nèi)或?yàn)R出離心管外；加樣 時(shí)，最后加陽性對(duì)照。4、技術(shù)處理1）在DNA模板和多聚酶加入前，紫外線照射反應(yīng)管內(nèi)容物以破壞污染的PCR產(chǎn)物。一般選用波長 254nm 照射 30min （ Nature ,1990 , 34:27 ）;2）PCR實(shí)驗(yàn)中使用 dUTP ，而不用 dTTP。在擴(kuò)增前使用 Uracil N - glyc

9、osylase （尿喀咤糖基化酶）處理可降解交叉污染的PCR產(chǎn)物，而不降解基困組DNA模板，然后熱滅活此酶，再進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)（ Gene , 1990 , 93: 125）。美國PE公司提供此類試 劑盒；3）在PCR反應(yīng)前加入一種光化學(xué)試劑，反應(yīng)完成后激活該試劑，光化學(xué)試劑可交聯(lián)DNA 鏈，使之不能再擴(kuò)增（ Nucleic Acids Res , 1991 , 19 : 99）。二、假陰性（一）假陰性現(xiàn)象與判斷方法如果實(shí)驗(yàn)中設(shè)置的陽性對(duì)照未能擴(kuò)增成陽性結(jié)果，提示本次實(shí)驗(yàn)中可能有假陰性結(jié)果。但這里應(yīng)注意，許多國產(chǎn)PCR試劑盒中陽性對(duì)照采用質(zhì)粒DNA,和標(biāo)本相比來說，不需純化提取核酸的步驟，因此，如

10、果在標(biāo)本核酸純化提取步驟有問題，即使陽性對(duì)照均呈陽性， 標(biāo)本檢測(cè)中還可能有假陰性。設(shè)置內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因?qū)φ帐桥袛嗉訇幮暂^好的指示系統(tǒng)。在每一反應(yīng)管中同時(shí)對(duì)內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基 因?qū)φ者M(jìn)行擴(kuò)增，若內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因?qū)φ瘴茨軘U(kuò)增出來，說明該反應(yīng)管的結(jié)果可能有問題。（二）造成假陰性的原因1 .儀器因素PCR實(shí)驗(yàn)對(duì)儀器的依賴性是很高的，離心機(jī)、擴(kuò)增儀都是造成PCR假陰性的因素。擴(kuò)增儀的主要問題是孔間差，引起擴(kuò)增失敗或擴(kuò)增效率降低。而離心機(jī)的影響則更容易被忽 視。國內(nèi)使用離心機(jī)很少使用離心加速度（ XXXg ）作為參數(shù)指標(biāo)，而常使用轉(zhuǎn)數(shù)作為參數(shù) 指標(biāo)，這里就存在著一個(gè)問題，由于離心機(jī)的大小不同，有效跳心半徑也不相同，因此同樣的轉(zhuǎn)

11、速所產(chǎn)生的離心力相差很大 （有的在數(shù)倍以上），所以在相同的離心時(shí)間下，有可能模板 并沒有離心下來，造成 PCR假陰性。這個(gè)問題在其他實(shí)驗(yàn)也有，但因其他實(shí)驗(yàn)都是測(cè)定大 分子蛋白沉淀，對(duì)離心的速度要求較低所以不太明顯。建議使用小型臺(tái)式離心機(jī)的實(shí)驗(yàn)要注意一下這個(gè)問題。2 .試劑質(zhì)量問題PCR實(shí)驗(yàn)的成功與否試劑的質(zhì)量至關(guān)重要，試劑的質(zhì)量問題涉及多個(gè)方面：細(xì)胞的裂 解；模板的抽提；引物位點(diǎn)的選擇；Taq酶的活性等等。其中任一環(huán)節(jié)出了問題都會(huì)引起結(jié)果的假陰性。這些都是試劑質(zhì)量的問題，因此選用高質(zhì)量的PCR試劑非常重要。酶失活：需更換新酶，或新舊兩種酶同時(shí)使用，以分析是否因酶的活性喪失或不夠而 導(dǎo)致假陰性。

12、需注意的是有時(shí)忘加Taq酶或澳乙錠。引物：引物質(zhì)量、引物的濃度、兩條引物的濃度是否對(duì)稱，是 PCR失敗或擴(kuò)增條 帶不理想、容易彌散的常見原因。有些批號(hào)的引物合成質(zhì)量有問題，兩條引物一條濃度高， 一條濃度低，造成低效率的不對(duì)稱擴(kuò)增，對(duì)策為：選定一個(gè)好的引物合成單位。引物的濃度不僅要看 OD值，更要注重引物原液做瓊脂糖凝膠電泳，一定要有引物條帶出現(xiàn)， 而且兩引物帶的亮度應(yīng)大體一致，如一條引物有條帶，一條引物無條帶，此時(shí)做PCR有可能失敗，應(yīng)和引物合成單位協(xié)商解決。如一條引物亮度高， 一條亮度低，在稀釋引物時(shí)要平衡其濃度。 引物應(yīng)高濃度小量分裝保存，防止多次凍融或長期放冰箱冷藏部分，導(dǎo)致引物變質(zhì)降解

13、失效。3 .核酸模板問題1）模板中含有雜蛋白質(zhì)；2）模板中含有 Taq酶抑制劑；3）模板中蛋白質(zhì)沒有消化除凈，特別是染色體中的組蛋白；4）在提取制備模板時(shí)丟失過多，或吸入酚；5）模板核酸變性不徹底。在酶和引物質(zhì)量好時(shí)，不出現(xiàn)擴(kuò)增帶，極有可能是標(biāo)本的消化處理，模板核酸提取過 程出了毛病，因而要配制有效而穩(wěn)定的消化處理液，其程序亦應(yīng)固定不宜隨意更改。4、物理原因：PCR儀控溫不準(zhǔn)，也是 PCR失敗的原因之一。有時(shí)還有必要用標(biāo) 準(zhǔn)的溫度計(jì)，檢測(cè)一下擴(kuò)增儀內(nèi)的變性、退火和延伸溫度。5、靶序列變異：如靶序列發(fā)生突變或缺失，影響引物與模板特異性結(jié)合，或因靶序列 某段缺失使引物與模板失去互補(bǔ)序列，其PCR擴(kuò)

14、增是不會(huì)成功的。6.操作人員素質(zhì)問題PCR實(shí)驗(yàn)的環(huán)節(jié)很多，而且對(duì)每一環(huán)節(jié)的質(zhì)量要求都很高，例如少加、漏加試劑、離 心不充分、循環(huán)參數(shù)設(shè)計(jì)錯(cuò)誤等等都能造成結(jié)果的假陰性。（三）假陰性問題的試驗(yàn)控制在每次PCR檢測(cè)時(shí)，一定設(shè)立陰性對(duì)照樣品和陽性對(duì)照樣品。陰性對(duì)照樣品檢測(cè)為陰性時(shí)，表明試驗(yàn)全部過程的試劑沒有受到污染；陽性對(duì)照樣品檢測(cè)為陽性時(shí)，表明DNA提取（RNA提取、RNA反轉(zhuǎn)錄）、DNA擴(kuò)增和電泳鑒定工作體系正常。在陰性對(duì)照樣品和 陽性對(duì)照樣品檢測(cè)結(jié)果成立的前提下，才能對(duì)檢測(cè)樣品進(jìn)行判定。造成假陰性的原因可以通過設(shè)置試驗(yàn)對(duì)照來查找。試驗(yàn)對(duì)照包括：1、DNA陽性對(duì)照：以含有目的片段的 DNA（或質(zhì)粒

15、）作為模板進(jìn)行擴(kuò)增，證明 PCR 試劑是否有效、擴(kuò)增過程是否正確及待測(cè)樣品中是否含有目的片段。（注意：陽性樣品擴(kuò)增效率高，應(yīng)嚴(yán)格控制，避免其成為潛在的污染源）。2、DNA陰性對(duì)照：以不含有目的片段的陰性樣品作為模板進(jìn)行擴(kuò)增，用于證明擴(kuò)增 過程中無假陽性現(xiàn)象。3、空白對(duì)照：以純水作為模板進(jìn)行擴(kuò)增，用于證明擴(kuò)增過程中無假陽性現(xiàn)象。4、PCR抑制物對(duì)照：在與陽性對(duì)照相同的反應(yīng)體系中，加入相同數(shù)量的待測(cè)樣品 DNA,如果未擴(kuò)增出目的片段，證明此待測(cè)樣品DNA中存在PCR抑制物。5、空白提取對(duì)照：空白提取對(duì)照擴(kuò)增結(jié)果為陽性，說明DNA提取試劑可能受到污染。6、陽性提取對(duì)照：陽性提取對(duì)照擴(kuò)增結(jié)果為陰性，說

16、明提取過程可能有誤。如果DNA陽性對(duì)照擴(kuò)增結(jié)果為陰性， 或者DNA陰性對(duì)照和空白對(duì)照擴(kuò)增結(jié)果為陽性， 則說明PCR試劑或擴(kuò)增過程存在問題。（四）假陰性解決方案1 .反應(yīng)體系不靈敏：1）檢查PCR試劑是否失效；2）檢驗(yàn)引物是否降解：3）優(yōu)化 PCR擴(kuò)增體系與程序。2、PCR反應(yīng)存在抑制物：（1）稀釋*II板DNA,進(jìn)行擴(kuò)增分析；（2）純化模板DNA, 除去蛋白質(zhì)、多酚、多糖等抑制物；（3）檢測(cè)PCR體系中是否含有擴(kuò)增抑制物。3、DNA提取失?。?）選擇與優(yōu)化樣品 DNA提取方法；2）驗(yàn)證DNA提取試劑是否 失效。三.非特異擴(kuò)增（一）現(xiàn)象PCR擴(kuò)增后出現(xiàn)的條帶與預(yù)計(jì)的大小不一致，或大或小，或者同時(shí)

17、出現(xiàn)特異性擴(kuò)增帶與非特異性擴(kuò)增帶。非特異性條帶的出現(xiàn)，（二）原因：1 .引物設(shè)計(jì)與濃度問題引物設(shè)計(jì)：引物堿基的 G+C含量以40-60%為宜，G+C太少擴(kuò)增效果不佳，G+C過多易出現(xiàn)非特異條帶。ATGC最好隨機(jī)分布，避免 5個(gè)以上的喋吟或喀咤核甘酸的成串排列。避免引物內(nèi)部出現(xiàn)二級(jí)結(jié)構(gòu)，避免兩條引物間互補(bǔ)，特另是3'端的互補(bǔ)，否則會(huì)形成引物二聚體，產(chǎn)生非特異的擴(kuò)增條帶。 引物3'端的堿基，特別是最末及倒數(shù)第二個(gè)堿基，應(yīng)嚴(yán)格要求配對(duì)，以避免因末端堿基不配對(duì)而導(dǎo)致PCR失敗。引物應(yīng)與核酸序列數(shù)據(jù)庫的其它序列無明顯同源性。引物濃度：每條引物的濃度 0.11umol或10100Pmol

18、,以最低引物量產(chǎn)生所需要 的結(jié)果為好，引物濃度偏高會(huì)引起錯(cuò)配和非特異性擴(kuò)增，且可增加引物之間形成二聚體的機(jī)會(huì)。2 . Mg2+離子濃度過高：在一般的 PCR反應(yīng)中，各種 dNTP濃度為200umol/L時(shí)， Mg2+濃度為1.52.0mmol/L為宜。Mg2+濃度過高，反應(yīng)特異性降低，出現(xiàn)非特異擴(kuò)增， 濃度過低會(huì)降低Taq DNA聚合酶的活性，使反應(yīng)產(chǎn)物減少。3 .退火溫度過低：變性后溫度快速冷卻至40 c60 C,可使引物和模板發(fā)生結(jié)合。由于模板DNA比引物復(fù)雜得多，引物和模板之間的碰撞結(jié)合機(jī)會(huì)遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于模板互補(bǔ)鏈之間 的碰撞。退火溫度與時(shí)間，取決于引物的長度、堿基組成及其濃度，還有靶基序列的

19、長度。對(duì)于20個(gè)核甘酸，G+C含量約50%的引物，55 c為選擇最適退火溫度的起點(diǎn)較為理想。 引物的復(fù)性溫度可通過以下公式幫助選擇合適的溫度：Tm 值(解鏈溫度)=4(G+C) +2(A+T) 復(fù)性溫度=Tm值-(510 C)在Tm值允許范圍內(nèi)，選擇較高的復(fù)性溫度可大大減少引物和模板間的非特異性結(jié)合，提高PCR反應(yīng)的特異性。復(fù)性時(shí)間一般為3060sec ,足以使引物與模板之間完全結(jié) 合。4 . PCR循環(huán)次數(shù)過多：當(dāng)其它參數(shù)確定之后，循環(huán)次數(shù)主要取決于DNA濃度。一般而言25-30輪循環(huán)已經(jīng)足夠。循環(huán)次數(shù)過多，會(huì)使 PCR產(chǎn)物中非特異性產(chǎn)物大量增加。 通常經(jīng)25-30輪循環(huán)擴(kuò)增后，反應(yīng)中Taq

20、 DNA 聚合酶已經(jīng)不足，如果此時(shí)產(chǎn)物量仍不夠，需要進(jìn)一步擴(kuò)增，可將擴(kuò)增的 DNA樣品稀釋103-105倍作為模板，重新加入各種反應(yīng)底物 進(jìn)行擴(kuò)增，這樣經(jīng)60輪循環(huán)后，擴(kuò)增水平可達(dá)109-1010。擴(kuò)增產(chǎn)物的量還與擴(kuò)增效率有關(guān)， 擴(kuò)增產(chǎn)物的量可用下列公式表示 ：C = Co(1+P)n。其中：C為擴(kuò)增產(chǎn)物量，C0為起始DNA 量，P為增效率，n為循環(huán)次數(shù)。在擴(kuò)增后期，由于產(chǎn)物積累，使原來呈指數(shù)擴(kuò)增的反應(yīng)變 成平坦的曲線，產(chǎn)物不再隨循環(huán)數(shù)而明顯上升，這稱為平臺(tái)效應(yīng)。 平臺(tái)期會(huì)使原先由于錯(cuò)配而產(chǎn)生的低濃度非特異性產(chǎn)物繼續(xù)大量擴(kuò)增，達(dá)到較高水平。因此，應(yīng)適當(dāng)調(diào)節(jié)循環(huán)次數(shù)， 在平臺(tái)期前結(jié)束反應(yīng)，減少非

21、特異性產(chǎn)物。5.酶的質(zhì)和量，催化一典型的PCR反應(yīng)約需酶量 2.5U(指總反應(yīng)體積為100ul時(shí))，濃度過高可引起非特異性擴(kuò)增，濃度過低則合成產(chǎn)物量減少。往往一些來源的酶易出現(xiàn)非特異條帶而另一來源的酶則不出現(xiàn)，酶量過多有時(shí)也會(huì)出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增。四.PCR擴(kuò)增出現(xiàn)涂抹帶1、原因：往往由于酶量過多或酶的質(zhì)量差，dNTP濃度過高，Mg2+濃度過高，退火溫度過低，循環(huán)次數(shù)過多引起。2、對(duì)策：1)減少酶量，或調(diào)換另一來源的酶；2)減少dNTP的濃度；3)適當(dāng)降低Mg2+濃度；4)增加模板量，減少循環(huán)次數(shù)。五、標(biāo)準(zhǔn)問題轉(zhuǎn)基因成分檢測(cè)一般按照標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行， 引物和PCR反應(yīng)體系一般都經(jīng)過了嚴(yán)格的循 環(huán)驗(yàn)證。

22、有時(shí)標(biāo)準(zhǔn)方法可能存在問題， 導(dǎo)致假陽性、假陰性、非特異性擴(kuò)增和涂抹帶的產(chǎn)生。 標(biāo)準(zhǔn)方法可能存在的問題有：1 .引物設(shè)計(jì)不合適：選擇的擴(kuò)增序列與非目的擴(kuò)增序列有同源性，因而在進(jìn)行 PCR擴(kuò)增時(shí)，擴(kuò)增出的 PCR產(chǎn)物為非目的性的序列。靶序列太短或引物太短，容易出現(xiàn)假陽性。2 . Mg2+濃度不合理：Mg2+離子濃度對(duì)PCR擴(kuò)增效率影響很大，濃度過高可降 低PCR擴(kuò)增的特異性，濃度過低則影響PCR擴(kuò)增產(chǎn)量甚至使 PCR擴(kuò)增失敗而不出擴(kuò)增條帶。3 .反應(yīng)體積的改變：通常進(jìn)行 PCR擴(kuò)增采用的體積為 20ul、 30ul、 50ul ?；?100ul ,應(yīng)用多大體積進(jìn)行 PCR擴(kuò)增，是根據(jù)檢測(cè)不同目的而

23、設(shè)定，在做小體積如20ul后，再做大體積時(shí)，一定要模索條件，否則容易失敗。4 .PCR溫度設(shè)置不合理：變性對(duì) PCR擴(kuò)增來說相當(dāng)重要，如變性溫度低，變性時(shí)間 短，極有可能出現(xiàn)假陰性； 退火溫度過低，可致非特異性擴(kuò)增而降低特異性擴(kuò)增效率退火溫 度過高影響引物與模板的結(jié)合而降低 PCR擴(kuò)增效率。六、檢測(cè)極限問題當(dāng)樣品中轉(zhuǎn)基因成分很低時(shí)，反應(yīng)體系內(nèi)可能不含有擴(kuò)增模版，因而容易造成假陰性 結(jié)果。PCR理論檢測(cè)極限是在反應(yīng)體系中存在一個(gè)拷貝的目標(biāo)DNA分子，由于人的判讀能力限制和PCR效率等原因，定性檢測(cè)實(shí)際極限值一般是理論檢測(cè)極限值的10-30倍。也就是說，如果轉(zhuǎn)基因成分低到檢測(cè)極限時(shí)，檢測(cè)不到轉(zhuǎn)基因

24、成分的可能性會(huì)很大，或者說出現(xiàn)假陰性的概率很大。出現(xiàn)假陰性的原因是由于抽樣誤差，反應(yīng)體系中不存在有效擴(kuò)增的模版分子。此時(shí)是不適合做 PCR檢測(cè)的。根據(jù)作物基因組的大小， 可以計(jì)算出不同作物的理論檢測(cè)極限并估計(jì)出實(shí)際檢測(cè)極限。 例如在100微升的反應(yīng)體系中，小麥基因組有0.58萬個(gè)拷貝，一個(gè)轉(zhuǎn)基因拷貝的重量比 （理 論檢測(cè)極限）是0.0174% ,玉米的理論檢測(cè)極限是0.003 ,其他作物的理論檢測(cè)極限一般在0.001%-0.01%。如果反應(yīng)體系是 20微升，理論檢測(cè)極限值將提高5倍，小麥為0.085%,玉米為0.015% ,其他作物將在0.005-0.05%之間。反應(yīng)體系是 20微升的定性檢測(cè)

25、實(shí)際極 限值一般是在 0.05-0.5% 。低于這個(gè)含量時(shí)，反應(yīng)體系中有時(shí)不含擴(kuò)增模版DNA,因此很難得到正確的檢測(cè)結(jié)果。七.怎樣查找污染源如果不慎發(fā)生污染情況，應(yīng)從下面幾條出發(fā)，逐一分析，排除污染。（一）設(shè)立陰陽性對(duì)照：有利于監(jiān)測(cè)反應(yīng)體系各成分的污染情況。選擇陽性對(duì)照時(shí)，應(yīng)選擇擴(kuò)增弱，且重復(fù)性好的樣品，因強(qiáng)陽性對(duì)照可產(chǎn)生大量不必要的擴(kuò)增序列，反而可能成為潛在的污染源。如果以含靶序列的重組質(zhì)粒為對(duì)照，100個(gè)拷貝之內(nèi)的靶序列就足以產(chǎn)生陽性擴(kuò)增。陰性對(duì)照的選擇亦要慎重，因?yàn)镻CR敏感性極高，可以從其它方法（Sourthern印跡或點(diǎn)雜交等）檢測(cè)陰性的標(biāo)本中檢測(cè)出極微量的靶分子。此外，每次擴(kuò)增均應(yīng)

26、包括PCR體系中各試劑的時(shí)機(jī)對(duì)照，即包括 PCR反應(yīng)所需的全部成分，而不加模板 DNA ,這對(duì)監(jiān)測(cè)試劑中 PCR產(chǎn)物殘留污染是非常有益的。如果擴(kuò)增結(jié)果中試劑對(duì)照為陽性 結(jié)果，就是某一種或數(shù)種試劑被污染了。此時(shí)，要全部更換一批新的試劑進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增時(shí)設(shè)立不同的反應(yīng)管，每一管含有一種被檢測(cè)試劑，在檢出污染試劑后，應(yīng)馬上處理。（二）環(huán)境污染：在排除試劑污染的可能性外，更換試劑后，若不久又發(fā)現(xiàn)試劑被污 染了，如果預(yù)防措施比較嚴(yán)密，則考慮可能為環(huán)境污染。環(huán)境污染中常見的污染源主要有：1 .模板提取時(shí)真空抽干裝置；2.凝膠電泳加樣器；3.電泳裝置；4.紫外分析儀；5.切膠用刀或手術(shù)刀片；6.離心機(jī)；7.冰

27、箱門把手，冷凍架，門把手或?qū)嶒?yàn)臺(tái)面等；此時(shí)可用擦拭實(shí)驗(yàn)來查找可疑污染源：1 ）用無菌水浸泡過的滅菌棉簽擦拭可疑污染源；2 ） 0.1ml去離子水浸泡；3）取5ml做PCR實(shí)驗(yàn)；4）電泳檢測(cè)結(jié)果。8.氣溶膠。如果經(jīng)過上述追蹤實(shí)驗(yàn)，仍不能查找到確切污染源，則污染可能是由空氣 中PCR產(chǎn)物的氣溶膠造成的，此時(shí)就應(yīng)該更換實(shí)驗(yàn)場(chǎng)所，若條件不允許，則重新設(shè)計(jì)新的 引物（與原引物無相關(guān)性）。八.污染處理（一）環(huán)境污染1 .稀酸處理法：對(duì)可疑器具用1mol/L鹽酸擦拭或浸泡，使殘余 DNA脫喋吟；2 .紫外照射（UV）法：紫外波長（nm） 一般選擇 254/300nm，照射30min即可。 需要注意的是，選才

28、i UV作為消除殘留PCR產(chǎn)物污染時(shí)，要考慮PCR產(chǎn)物的長度與產(chǎn)物 序列中堿基的分布，UV照射僅對(duì)500bp以上長片段有效，對(duì)短片段效果不大。UV照射時(shí)，PCR產(chǎn)物中喀咤堿基會(huì)形成二聚體，這些二聚體可使延伸終止，但并不是DNA鏈中所有喀咤均能形成二聚體，且UV照射還可使二聚體斷裂。形成二聚體的程度取決于 UV波 長，喀咤二聚體的類型及與二聚體位點(diǎn)相鄰核甘酸的序列。在受照射的長DNA鏈上，形成二聚體缺陷的數(shù)量少于 0.065/堿基，其他非二聚體的光照損傷（如環(huán)丁烷型喀咤復(fù)合體，胸 腺喀咤乙二醇，DNA鏈間與鏈內(nèi)的交聯(lián)和 DNA斷裂等）均可終止 Taq DNA聚合酶的延 伸。這些位點(diǎn)的數(shù)量與二聚體

29、位點(diǎn)相當(dāng)。如果這些位點(diǎn)（0.13/堿基）在DNA分子上隨機(jī)分布，一個(gè)500bp片段的DNA分子鏈上將有32處損傷位點(diǎn)，那么，105個(gè)這樣的分子中 每個(gè)分子中會(huì)至少有一處損傷。相反，如果 100bp的片段，每條鏈上僅有 6處損傷，105 個(gè)拷貝分子中將有許多分子沒有任何損傷。這就是UV照射有一定的片段長度限制的原因。（二）反應(yīng)液污染可采用下列方法之一處理：1 . DNase I法：PCR混合液（未加模板和 Taq聚合酶）加入 0.5U DNase I ,室溫反 應(yīng)30min后加熱滅活，然后加入模板和 Taq聚合酶進(jìn)行正常 PCR擴(kuò)增。該方法的優(yōu)點(diǎn)是 不需要知道污染 DNA的序列；2 .內(nèi)切酶法：

30、選擇識(shí)別 4個(gè)堿基的內(nèi)切酶（如 Msp I和Taq I等），可同時(shí)選擇幾 種，以克服用一種酶只能識(shí)別特定序列的缺陷，室溫作用 1h后加熱滅活進(jìn)行 PCR ;3 .紫外照射法：未加模板和Taq聚合酶的PCR混合液進(jìn)行紫外照射，注意事項(xiàng)與方 法同上述UV照射法；4 . g射線輻射法：1.5kGy的輻射可完全破壞 0.1ng基因組DNA ,2.0 kGy可破壞104 拷貝的質(zhì)粒分子，4.0 kGy仍不影響PCR，但高于此限度會(huì)使 PCR擴(kuò)增效率下降。引物 可受照射而不影響 PCR , g射線是通過水的離子化產(chǎn)生自由基來破壞DNA的。（三）尿喀咤糖昔酶（UNG ）法由于UV照射的去污染作用對(duì) 500bp以下的片段效果不好，而臨床用于檢測(cè)的PCR擴(kuò)增片段通常為 300bp左右，因此UNG的預(yù)防作用日益受到重視和肯定。1 .原理：在PCR產(chǎn)物或引物中用 dU代替dT。這種dU化白PCR產(chǎn)物與UNG 一 起孵育，因 UDG可裂解尿喀咤堿基和糖磷酸骨架間的N-糖基鍵，可除去 dU而阻止TaqDNA聚合酶的延伸，從而失去被再擴(kuò)增的能力。UNG對(duì)不含dU的模板無任何影響。UNG可從單或雙鏈 DNA中消除尿喀咤，而對(duì) RNA中的尿喀咤和單一尿喀咤分子則無任 何作用。.dUTP法：用dUTP代替dTTP