利用發(fā)光細(xì)菌檢驗(yàn)水中有毒有害物質(zhì)

1、    利用發(fā)光細(xì)菌檢驗(yàn)水中有毒有害物質(zhì)            作者：岳舜琳糜曄新陸瑩時(shí)間：2007-11-24 17:38:00                     摘要：水源污染引發(fā)了一系列的問(wèn)題，首先是水質(zhì)檢驗(yàn)，特別是水中有毒有害

2、物質(zhì)的檢驗(yàn)問(wèn)題，水中有毒有害物質(zhì)可以通過(guò)各種水質(zhì)分析方法予以檢出，然后對(duì)之進(jìn)行對(duì)人體健康的綜合評(píng)價(jià)，檢測(cè)水中有毒有害物，有時(shí)采用生物方法，如魚(yú)毒理學(xué)生物檢驗(yàn)，水蚤試驗(yàn)等；也有采用近代遺傳毒理學(xué)的方法，如Ames致突變?cè)囼?yàn)1，姐妹染色體交換試驗(yàn)等等，則可提供水質(zhì)對(duì)人體健康影響的信息，本文則介紹利用發(fā)光細(xì)菌檢驗(yàn)水中有毒有害物質(zhì)的基本原理，檢驗(yàn)方法和評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)。 關(guān)鍵詞：水質(zhì)檢驗(yàn) 發(fā)光細(xì)菌 有毒有害物質(zhì)  一、發(fā)光細(xì)菌的存在，分離，純化和培養(yǎng)2廣闊的海洋是發(fā)光細(xì)菌生活的大本營(yíng)，從近海沿岸到南北極；從海水表面到深達(dá)1000米的海底都可找到發(fā)光細(xì)菌，只有少數(shù)生活在淡水湖泊河流中；有的寄生于各種海

3、洋動(dòng)物如海魚(yú)的發(fā)光器官中；有的獨(dú)立生活在海水中，其數(shù)量依外界條件的變化而異，據(jù)測(cè)定夏秋季的海水中每毫升多達(dá)幾十到幾百個(gè)，發(fā)光細(xì)菌屬于腸道菌屬，分為十個(gè)種四個(gè)屬，在我國(guó)海洋中也陸續(xù)分離到十個(gè)種的六種，其中包括我國(guó)特有的新種。發(fā)光細(xì)菌可以直接從海水中和海魚(yú)的體表和內(nèi)臟中分離，所采用的培養(yǎng)基為：胰蛋白胨0.5%，酵母膏0.5%，甘油0.3%，KH2PO40.1%，Na2HPO40.5%，NaCI3%，瓊脂2%，pH6.5。高壓滅菌后制成平板，將海魚(yú)或無(wú)脊椎動(dòng)物（如烏賊）切成34cm大小小塊，或取其內(nèi)臟放入滅菌培養(yǎng)皿中20培養(yǎng)1218小時(shí)，在暗室中尋發(fā)光點(diǎn)，用接種環(huán)挑取發(fā)光點(diǎn)，在營(yíng)養(yǎng)平板上，線(xiàn)培養(yǎng)后形

4、成單個(gè)發(fā)光菌，再挑取單菌落反復(fù)劃線(xiàn)分離幾次，即可得到純化的發(fā)光菌株，將純化的菌株接種入同樣成分的斜面培養(yǎng)基上，經(jīng)培養(yǎng)12小時(shí)后，在4下保存，每月轉(zhuǎn)接一次，可長(zhǎng)期保存活力，使用前接種到液體培養(yǎng)基中20下振蕩培養(yǎng)1012小時(shí)，用磷酸緩沖液稀釋后備用。國(guó)內(nèi)外一般都用明亮發(fā)光桿菌(Photobacterium Phospholcum)作有毒有害物的檢驗(yàn)，上海華東師范大學(xué)已將此菌種制成干燥粉劑-20下可長(zhǎng)期保存，使用極為方便。 二、發(fā)光菌的發(fā)光機(jī)理微生物在氧化代謝或呼吸作用過(guò)程中得到能量，呼吸作用等于生物的氧化作用，好氣性細(xì)菌具有細(xì)胞色素氧化還原酶系統(tǒng)，由于好氣性細(xì)菌的細(xì)胞色素可以作為氫的最終受體而利用

5、空氣中的氧，底物的氫傳遞到NAD（煙酰胺腺嘌呤核苷酸）的脫氫酶的輔基上，結(jié)果形成還原型的AAD-H2，它可以將氫傳遞給黃素腺嘌呤二核苷酸FAD，后者轉(zhuǎn)化為FAD- H2，就可以傳遞給細(xì)胞色素，能量以ATP（三磷酸腺苷）的形式釋放。發(fā)光細(xì)菌的發(fā)光過(guò)程是一種光呼吸過(guò)程，是上述電子傳遞鏈上的一個(gè)側(cè)支2，還原型的黃素單核苷酸，F(xiàn)MNH2充當(dāng)反應(yīng)的底物，螢光酶起催化作用，長(zhǎng)鏈脂肪醛起作改變螢光酶構(gòu)造的“修飾”作用。螢光酶通過(guò)分子氧催化FMNH2和脂肪醛(RCHO)的氧化，這種氧化還原反應(yīng)結(jié)果便產(chǎn)生磷光(465490nm之間較多)。外界條件和培養(yǎng)基成分pH，溫度，氧濃度變化會(huì)影響細(xì)菌的發(fā)光，而有毒的化學(xué)物

6、質(zhì)，重金屬離子，抗生素，化學(xué)治療劑，農(nóng)藥等同樣會(huì)影響細(xì)菌發(fā)光，故采用發(fā)光細(xì)菌作為敏感的指標(biāo)物測(cè)定有毒有害物是可能的。 三、發(fā)光細(xì)菌檢測(cè)有毒有害的方法31.儀器：SHG-1型生物化學(xué)發(fā)光測(cè)量?jī)x（上海市技術(shù)監(jiān)督局實(shí)驗(yàn)工廠產(chǎn)品）或Microtox 2055型毒物分析系統(tǒng)（美國(guó)MICROBICS CORPORATION產(chǎn)品）2.培養(yǎng)基(1)液體培養(yǎng)基：酵母膏5g，胰蛋白胨5g，NaCI40g，Na2HPO45g，KH2PO4lg，甘油3g，蒸餾水1000ml，pH6.5。(2)固體培養(yǎng)基：上述液體培養(yǎng)基成份加2%瓊脂即可。(3)稀釋用磷酸緩沖液：Na2HPO45g，KH2PO4lg，NaCI30g，蒸

7、餾水100ml，pH6.5。3.水樣濃縮作某化學(xué)物質(zhì)的試驗(yàn)只需配制一定濃度的溶液即可，進(jìn)行水樣中有毒有害物質(zhì)的試驗(yàn)則需事先進(jìn)行水樣中毒害物的吸附，洗脫和濃縮。取一定體積水樣V升（視水質(zhì)而定），用大孔樹(shù)脂(XAD系列事先分別經(jīng)甲醇、乙腈、丙酮回流8小時(shí)后保存于甲醇中)，用重蒸乙醚洗脫，濃縮至殘?jiān)?，?ml重蒸過(guò)的二甲亞砜溶解之。1ml1V升水樣0.1ml0.1V升水樣4.測(cè)定步驟(1)菌體活化：裝置為0.5ml干燥菌劑，開(kāi)封后注入23ml冷的稀釋液，在旋轉(zhuǎn)混合器上振蕩23分鐘，20平衡510分鐘，使其活化，待發(fā)光穩(wěn)定后即為活化菌懸浮液，置4下備用（活化后一天可用）。(2)菌液處理：吸取不同體積（

8、視水質(zhì)而定）二甲亞砜水樣濃縮液，分別在試管中用無(wú)菌蒸餾水稀至1ml，加入1ml緩沖液，然后再加入0.1ml菌懸浮液，搖勻，在一定溫度下(20±1)反應(yīng)10分鐘。并同時(shí)以二甲亞砜作對(duì)照試驗(yàn)。(3)用SAG-1型發(fā)光測(cè)量?jī)x測(cè)定光強(qiáng)度。(4)活菌計(jì)數(shù)在測(cè)定光強(qiáng)度的同時(shí)用上述加有菌懸浮液的稀釋液稀釋涂布營(yíng)養(yǎng)平板，23培養(yǎng)1216小時(shí)，計(jì)算活菌數(shù)。(5)結(jié)果計(jì)算：相對(duì)抑光率=對(duì)照管光強(qiáng)樣品管光強(qiáng)對(duì)照管光強(qiáng)×100細(xì)菌死亡率=對(duì)照活菌數(shù)樣品組活菌數(shù)對(duì)照組合菌數(shù)×100對(duì)于單一化學(xué)物質(zhì)當(dāng)達(dá)到抑光率為50%時(shí)的濃度用EC50表示，目前已有大量的有機(jī)物測(cè)得了其EC50值4。對(duì)于水樣

9、試驗(yàn)結(jié)果只能用水樣體積表示，EV50即表示抑光率為50%時(shí)所相對(duì)應(yīng)的水樣體積。5.試驗(yàn)結(jié)果的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)對(duì)于某個(gè)水樣品可根據(jù)EC50評(píng)價(jià)其毒性的有無(wú)，按照25%的準(zhǔn)則，當(dāng)某個(gè)水樣品的EC5025%時(shí)可記為有毒，按50%準(zhǔn)則，某個(gè)水樣的EC5050%可記為有毒5，還有一些其它分級(jí)方法。如何用發(fā)光細(xì)菌的檢驗(yàn)結(jié)果來(lái)評(píng)價(jià)水質(zhì)進(jìn)行分類(lèi)是一個(gè)有待研究的問(wèn)題，目前只能用以在相同條件下比較不同水樣的毒性，即加入同一水樣體積后測(cè)定其抑光率，抑光率大小評(píng)價(jià)其毒性；或者測(cè)得其EV50，依EV50的大小評(píng)價(jià)其毒性。   參考資料1岳舜琳：“給水環(huán)境毒理學(xué)簡(jiǎn)介”上海城鎮(zhèn)供水1988年1期14-17頁(yè)。2吳自榮：“觀察生物發(fā)光現(xiàn)象的好材料發(fā)光細(xì)菌生物學(xué)通報(bào)1986年第6期。3吳自榮等“以發(fā)光細(xì)菌作指示生物快速評(píng)價(jià)塑料包裝材料的生物毒性”中國(guó)環(huán)境監(jiān)測(cè)1987年3卷第4期。4KLAUS L.E.KAISER;“Photobacterium pho phoreum Toxicity Bioassay 11,Toxicity Data Compilation”Toxicity Assesmint:An International Journal Vo1.3 195-23