力生長因子在大腸桿菌中的表達及活性分析

1、生物工程學報 Chin J Biotech 2008, July 25; 24(7): 1180-1185 Chinese Journal of Biotechnology ISSN 1000-3061 cjb © 2008 Institute of Microbiology, CAS & CSM, All rights reserved力生長因子在大腸桿菌中的表達及活性分析張兵兵1,2, 江鵬1,2, 鮮成玉1,2, 李玉筱1,2, 李大軍1,2, 唐麗靈1,2, 王遠亮1,21 重慶大學生物工程學院, 重慶 4000302 重慶大學國家“985工程”生物材料與仿生工程研究

2、中心, 重慶 400030摘 要: MGF(Mechano-growth factor)是一種IGF-1變體形式, 研究發(fā)現(xiàn)該因子具有應力敏感性, 并且具有促進肌肉肥大、再生以及神經(jīng)損傷修復的功能。通過RT-PCR從拉伸刺激的人成骨細胞中克隆MGF cDNA序列, 并去除5'端9 bp的序列, 使N端缺少對腸激酶(Enterokinase, EK)具有抑制作用的脯氨酸, 將截短型MGF (des(1-3) MGF) cDNA序列克隆入pET32a(+)質粒, 構建重組表達質粒。重組質粒轉化E. coli BL21(DE3), 在30oC培養(yǎng)下以可溶形式表達融合蛋白Trx/再對融合蛋白E

3、K酶切, rpHPLCdes(1-3)MGF, 采用離子交換層析和Ni2+金屬親和層析, 獲得純度95%以上的融合蛋白。分離獲得純度達98%的des(1-3)MGF, SDS-PAGE及質譜分析蛋白分子量與理論值相符。生物活性實驗顯示, 所制備的des(1-3)MGF比des(1-3)IGF-1更顯著的促進MC3T3-E1細胞的增值和遷移。關鍵詞: 胰島素樣生長因子-1, 力生長因子, 原核表達, 增殖, 遷移Expression of Mechano-growth Factor in Escherichia coli and Activity AnalysisBingbing Zhang1,

4、2, Peng Jiang1,2, Chengyu Xian1,2, Yuxiao Li1,2, Dajun Li1,2, Liling Tang1,2, and Yuanliang Wang1,21 Bioengineering College, Chongqing University, Chongqing 400030, China2 National “985 Projiect Programme” Research Center of Bioinspired Materials Science and Engineering, Chongqing University, Chongq

5、ing 400030, China Abstract: Mechano-growth factor (MGF) is one of IGF-1 isoforms. MGF is mechanosensitive and has important functions in muscle hypertrophy, regeneration and nerve injury recovery. In this study, MGF cDNA (330 bp) was cloned from stretched osteoblasts by RT-PCR. In order to avoid pro

6、lin residue inhibiting enterokinase cleavage, 9bp of MGF cDNA 5 end sequence was truncated by primer, then the obtained truncated MGF (des(1-3)MGF) cDNA (321 bp) was subcloned in pET32a(+) vector to construct a prokaryotic recombination expression plasmid. Trx/des(1-3)MGF fusion protein, existing in

7、 forms of solution, was expressed in transformed Escherichia coli strain BL21(DE3) by IPTG induction at 30oC. The supernatant of cell lysates was subjected to ion exchange chromatography and Ni2+ metal affinity chromatography, and the fusion protein was obtained with the purity over 95%. After the f

8、usion protein was cleaved by enterokinase, Trx and des(1-3)MGF was isolated by reverse-phase HPLC. Through these procedures, des(1-3) MGF was obtained with the purity of 98%. The protein molecular mass was conformity to the theoretical value by SDS-PAGE and mass spectrometry analysis. The purified d

9、es(1-3)MGF was incubated with MC3T3-E1 for cell proliferation and migration assays. The results show that des(1-3)MGF exhibited more facilitative effects on proliferation and migration of MC3T3-E1 than that of des(1-3)IGF-1.Keywords: insulin-like growth factor-1(IGF-1), mechano-growth factor (MGF),

10、prokaryotic expression, proliferation, migrationReceived: November 8, 2007; Accepted: January 18, 2008Supported by: the National Natural Science Foundation of China (No. 30600130).Corresponding author: Yuanliang Wang. Tel: +86-23-65102509; E-mail: cqingzbb國家自然科學基金(No. 30600130)資助。張兵兵等: 力生長因子在大腸桿菌中的表

11、達及活性分析1181IGF-1是一種重要的生理調控因子, 在胚胎期和出生后的發(fā)育過程中具有重要作用, 同時在整個生命過程中它都通過調節(jié)細胞的增殖、分化、凋亡來影響各種組織的動態(tài)平衡以及組織功能。在以往對IGF-1的研究中, 認為它由肝臟產生, 是一種通過循環(huán)系統(tǒng)發(fā)揮功能的內分泌型生長因子1。最近, 在受應力刺激的肌肉、骨骼, 以及損傷的肌肉、神經(jīng)組織中發(fā)現(xiàn)一種IGF-1變體在局部組織中高表達, 該變體除了包含成熟IGF-1的全部序列外, 在羧基端(C端)多出40個氨基酸(Amino acid, aa)的延伸肽(E肽), 因為這種因子在肌肉中具有應力刺激敏感性, 故命名為力生長因子(Mechan

12、o-growth factor, MGF)25。MGF以自分泌/旁分泌的方式發(fā)揮功能, 與鍛煉引起的肌肉肥大相關, 具有治療肌肉萎縮或神經(jīng)損傷的潛MGF主要由發(fā)生應激在價值, 因此受到廣泛關注6,7。反應的局部組織表達, 在體內的半衰期短, 直接從動物體內獲取該因子較困難。通過基因工程制備重組蛋白, 是大量獲得該因子的有效途徑。長期以來, 胰島素和IGF-1在大腸桿菌(Escherichia coli)中的表達有大量研究, 并獲得成功9,108位點以及腸激酶(Enterokinase, EK)酶切位點(Asp)4-Lys, 在3 端引入翻譯終止密碼以及EcoR I位點。將構建好的序列插入pET

13、32a(+)的BamH I與EcoR I之間, 獲得N端連接Trx融合配體的pET32a(+)/des(1-3)MGF重組質粒, Trx與des(1-3) MGF之間有6His、EK酶切位點等序列連接。將構建好的重組質粒, 轉化E. coli DH5進行擴增, 并通過酶切和測序鑒定。1.3 重組蛋白的表達鑒定正確的重組質粒轉化BL21(DE3)菌株, 挑取陽性克隆接種到含100 u/mL Amp的 LB培養(yǎng)基(LA)中, 30oC, 150 r/min培養(yǎng)過夜作為種子液。搖瓶表達條件: 種子液1:20 (V/V)轉接到LA培養(yǎng)基，培養(yǎng)物在37oC, 250 r/min的條件下培養(yǎng), 通過檢測發(fā)

14、酵條OD600值控制細菌在對數(shù)生長期內進行誘導。件: 種子液1:20 (V/V) 轉接到M9CA培養(yǎng)基中, 37oC培養(yǎng), 低溫誘導, 溶氧50%, 氨水調節(jié)pH 7.0。補料流加液: 30% 葡萄糖、5%胰蛋白胨、3%酵母提取物、50%甘油。對不同誘導溫度、誘導時間和IPTG濃度進行優(yōu)化實驗。誘導結束后, 將所有培養(yǎng)物收集, 4oC, 10 000 r/min離心10 min, 獲細胞沉淀。將細胞沉淀在20oC和37oC反復凍融兩次, 然后1:10 (W/V) 重懸在 Buffer A (50 mmol/L Tris-HCL, pH 9.5, 5 mmol/L EDTA,0.2 mg/mL

15、Lysozyme)中, 37oC緩慢攪動30 min, 再將獲得的粘稠物置于冰上分批進行超聲破菌, 每次500 mL, 超聲功率50 W, 脈沖15 s, 間歇5 s, 共進行50次。超聲至破菌溶液不再粘稠, 將溶液在4oC, 12 000 r/min離心15 min, 沉淀和上清分別進行SDS-PAGE分析。本研究以pET32a(+)質粒作載體, 利用它提供的T7啟動子, 以及Trx蛋白, 采用融合蛋白的表達策略獲得MGF類似物des(1-3)MGF。1 材料與方法1.1 材料pET32a(+)質粒、 E. coli菌株BL21(DE3)均為Novagen (Madison, WI, USA

16、)產品。質粒提取試劑盒、PCR試劑、內切酶、連接酶均購自TaKaRa (Dalian, China)。所有蛋白層析操作在AKTA explorer 100上進行, 層析柱填料為Amersham Biosciences (Uppsala, Sweden)產品。HPLC分析在Waters 600 (Waters, USA)上進行, 質譜分析用Agilent 1100 MSD SL (USA)型質譜儀。Des(1-3)IGF-1和Enterokinase分別為Peninsula Laboratories和Sigma公司產品。MC3T3-E1購置中國科學院上海細胞庫, Milicell-PCF培養(yǎng)小室

17、為Milicell公司產品。1.4 重組蛋白的純化將離心獲得的含Trx/des(1-3)MGF的上清溶液, 進行陰離子交換層析, 層析柱Q Sepharose FF先用Buffer B (25 mmol/L Tris-HCL, pH 8.0)平衡, 上樣結束, 繼續(xù)用Buffer B復平衡去除非特異性結合蛋白, 結合蛋白用補加了0.3 mol/L NaCl的Buffer B洗脫。接著, 在蛋白洗脫液中補加30 mmol/L的咪唑, 加載Ni2+ Chelating Sepharose FF層析柱, 上樣前柱體經(jīng)Buffer C (25 mmol/L Tris-HCl, pH 8.0, 30 m

18、mol/L Imidazole, 0.3 mol/L NaCl)平衡, 上樣結束, 柱體用Buffer C再次平衡。牢固結合在層析柱上的目的蛋J1.2 重組質粒的構建MGF cDNA序列(GenBank Accession No. AX147742)通過RT-PCR從拉伸刺激的成骨細胞中擴增獲得5。再次通過PCR去除cDNA 5端9 bp的序列, 獲得des(1-3)MGF cDNA, 同時引入BamH I1182 ISSN1000-3061 CN11-1998/Q Chin J Biotech July 25, 2008 Vol.24 No.7白用含咪唑的Buffer C梯度洗脫。含融合蛋白

19、的洗脫液, 在Buffer C中, 4oC, 透析12 h, 去除咪唑。純化得到的Trx/des(1-3)MGF凍干濃縮至濃度 5 mg/mL, 然后以下述條件進行EK酶切: 2.5 mg融反應合蛋白, 用酶0.1 u, 37oC, 緩慢攪動, 反應3 h?；旌衔颒CL調節(jié)pH到3.0, 通過rpHPLC進一步分離, 層析柱填料為Source 15 RPC。流動相組成如下: H2O-0.1% CF3COOH (流動相A), 80% CH3CN-0.1% CF3COOH (流動相B)。rpHPLC制備獲得的des(1-3) MGF經(jīng)質譜鑒定。(Fig. 1)。重組質粒在DH-5菌株中擴增, 提取

20、質粒經(jīng)過酶切和測序鑒定(結果未顯示)。圖1 重組結構示意圖Fig. 1 Schematic diagram of recombination constructionDes(1-3)MGF was expressed as fusions to the C-terminus of Trx.The fusion construction has six histidines, an enterokinase recognition, cleavage site positioned at the N-terminusof des(1-3)MGF1.5 生物活性分析MTT法比較分析des(1-3)

21、MGF和des(1-3)IGF-1對MC3T3-E1細胞增殖的影響11。細胞制成3×105個/mL的-MEM (含10%胎牛血清)懸液, 100 L/孔接種到96孔板, 培養(yǎng)12 h, 更換無血清的新鮮-MEM, 進行血清饑餓12 h后加入含不同濃度des(1-3)MGF 和 des(1-3)IGF-1 (10、20、50、100 ng/mL)的-MEM, 繼續(xù)培養(yǎng)24 h, MTT法分析細胞量。通過Milicell-PCF遷移小室分析des(1-3)MGF2.2 重組蛋白的表達通過OD監(jiān)測, 控制誘導時間點位于細菌的對數(shù)生長期內。結果顯示, IPTG誘導后, 細胞的生長率明顯降低,

22、 搖瓶表達, 溫控30oC誘導培養(yǎng)4 h, 收獲菌體濕重約20 g/L, 破菌溶液經(jīng)SDS-PAGE分析, 在分子量標準31 kD附近有明顯的特異條帶產生, Trx/des(1-3)MGF融合蛋白的理論分子量為33 kD, 可初步確定該特異條帶即為融合蛋白, 約占細菌總蛋白的15%, 融合蛋白主要位于上清液中(Fig.2,。發(fā)酵罐發(fā)酵, 菌體產量約為120 g/L, 融合 對細胞遷移的影響11,12。在24孔板中加入含 Lane S)蛋白表達可溶, 約占細菌總蛋白的12%。通過對誘25 ng/mL des(1-3)MGF或des(1-3)IGF-1的無血清-MEM 300 L/孔, 然后將Mi

23、licell-PCF小室置于其中, 再將無血清的200 L細胞懸液接種在Milicell-PCF小室, 培養(yǎng)24 h后去除培養(yǎng)液, 棉簽清除濾膜上表面未遷移細胞, 遷移到下表面的細胞經(jīng)蘇木素染色, 顯微鏡下對每組實驗取10個視野計數(shù), 然后取平均值, 比較細胞的遷移能力。導起始時間、IPTG濃度、溫度、誘導持續(xù)培養(yǎng)時間的優(yōu)化, 確定最佳表達條件是: 菌種以1:20 (V/V)的密度接種, 37oC培養(yǎng), 搖瓶培養(yǎng)OD600達到0.6, 發(fā)酵罐OD600達到3開始誘導, IPTG濃度為0.2 mmol/L, 誘導過程中溫度降低至30oC, 繼續(xù)培養(yǎng)4 h。2 結果2.1 pET32a(+)/de

24、s(1-3)MGF重組質粒的構建從拉伸刺激后的人成骨細胞中RT-PCR擴增MGF cDNA (330 bp) 序列5, 再次設計引物, 在MGF基因序列的N端引入EcoR I位點和EK酶切位點, 為了避免第2位脯氨酸對EK酶切的抑制作用pET System Manual, 去除5端9 bp的序列, 在3 端引入翻譯終止密碼, 以及BamH I位點, 重組序列共計348 bp。構建好的des(1-3)MGF重組序列克隆入pET32a(+)質粒的BamH I與EcoR I之間, 使得des(1-3)MGF位于Trx蛋白的閱讀框內, 實現(xiàn)Trx/des(1-3)MGF融合表達, 在des(1-3)M

25、GF的N端引入EK酶切位點, 便于將Trx與des(1-3)MGF分離J圖2 重組蛋白表達、純化與酶切結果的SDS-PAGE分析Fig. 2 SDS-PAGE analysis of recombinant proteinexpression, purification and EK cleavageM: molecular weight marker; P: pellet sample from the cell lysates; S: supernatant sample from the cell lysates; Q: fusion protein eluted from Q Seph

26、arose FF column; N, fusion protein purified by Ni2+ chelating Sepharose FF column; E: fusion protein cleaved by enterokinase張兵兵等: 力生長因子在大腸桿菌中的表達及活性分析11832.3 重組蛋白的純化與分子量鑒定對破菌上清液中的融合蛋白進行三步層析操作。首先通過離子交換層析, Trx/ des(1-3)MGF融合蛋白的理論等電點(pI)為5.9, 蛋白溶液pH 8.0能使融合蛋白凈帶負電荷, 通過Q Sepharose FF強陰離子交換層析使目的蛋白的濃度提高到80%

27、 (Fig. 2 Lane Q)。第二步, 將第一步中的洗脫液加載Ni2+ Chelating Sepharose FF親和層析柱, 咪唑梯度洗脫,融合蛋白主要在80至120 mmol/L咪唑濃度之間被充分洗脫, 洗脫的蛋白純度可達95% (Fig. 2 Lane N)。純度達95%的融合蛋白透析除去咪唑, 按上述方法進行EK酶切, 3 h即可將融合蛋白充分酶切, 酶切比例達到80% (Fig. 2 Lane E)。rpHPLC分離酶切混合物, 獲純度達到98%的des(1-3)MGF (Fig. 3a)。質譜鑒定des(1-3)MGF的分子量為12123.25, 在誤差范圍內與理論計算值12

28、123.77一致(Fig. 3b)。圖3 純化蛋白的HPLC與質譜分析Fig. 3 HPLC and Mass spectrometry analysis of purified des(1-3)MGF(a)loading sample is the eluted fraction from Source 15 RPC column, 20 L sample be analyzed, the absorbance was monitored at 214nm, des(1-3)MGF absorbance peak were detected about 22.9 min, purity is

29、 98%. (b) mass spectrometry analysis of purified des(1-3)MGF.Mw=121232.4 des(1-3)MGF對MC3T3-E1增殖和遷移的影響MTT法分析細胞增殖, 結果顯示, 在10、20、 50 ng/mL的濃度范圍內, 與對照組相比des(1-3) MGF和des(1-3)IGF-1均能顯著促進細胞增殖(P<0.01), des(1-3)MGF作用組與des(1-3)IGF-1作用組OD值相比較, 在3種濃度下前者分別是后者的1.6、1.7、1.3倍。在100 ng/mL的濃度下, 兩種生長因子對細胞的增殖作用均減弱, 其

30、中des(1-3)MGF組與對照組間沒有顯著差異(Fig. 4)。圖4 des(1-3)MGF和des(1-3)IGF-1對MC3T3-E1增殖的影響Fig. 4 Effect of des(1-3)MGF and des(1-3)IGF-1 onMC3T3-E1 proliferationThe result of MTT had shown, des(1-3)MGF significantly promoted MC3T3-E1 proliferation at concentrations 10, 20 and 50 ng/mL, but not 100 ng/mL. (P<0.0

31、1, comparisons were made between des(1-3)MGF and control (or des(1-3)IGF-1)對細胞遷移能力的影響通過穿過Milicell-PCF小室底部有孔膜的細胞數(shù)目來評價(Fig.5a)。實驗中生長因子的濃度采用25 ng/mL是因為文獻報道該濃度的IGF-1具有明顯的促細胞遷移能力18。每組實驗取10個不同的視野細胞計數(shù), 取平均值得: 對照組33個, MGF組216個, IGF-1組96個(Fig. 5b)。因此des(1-3)MGF組細胞遷移數(shù)分別是對照組的6.5J1184 ISSN1000-3061 CN11-1998/Q

32、Chin J Biotech July 25, 2008 Vol.24 No.7倍, 是相同濃度des(1-3)IGF-1處理組的2.5倍。與des(1-3)MGF融合表達。MBP/des(1-3)MGF能實現(xiàn)高表達, 但產物仍以包含體為主(數(shù)據(jù)未顯示)。Trx/des(1-3)MGF融合蛋白的表達, 通過改變誘導溫度來調節(jié)蛋白的表達速度, 改變蛋白折疊的熱力學環(huán)境, 實現(xiàn)了融合蛋白可溶表達。pET32a(+)質粒中, 在Trx序列之后有緊接著的6His標簽, 利用His與Ni2+間的配位親和作用, 使得融合蛋白得到了有效純化。為了從融合蛋白中分離出目標蛋白, 在des(1-3)MGF的N端設

33、計EK酶切位點, 酶切位點鄰近的氨基酸殘基會對酶切效率產生影響, 尤其是緊隨其后的脯氨酸對酶切具有抑制作用。完整MGF的第二位脯氨酸可能表現(xiàn)出這種抑制作用, 因此有必要去除或突變。在哺乳動物中存在一種N端缺少3個aa的截短型IGF-1 (des(1-3) IGF-1), 研究發(fā)現(xiàn)des(1-3)IGF-1具有比完整IGF-1更高的活性16,17。受到該現(xiàn)象的啟發(fā), 我們截去MGF N端3個aa, 在不降低MGF活性的前提下提高了酶切效率, 后續(xù)活性實驗顯示這種截短型MGF具有非常高的促進細胞增殖和遷移的活性。目前對MGF功能的研究顯示, MGF能夠明顯的促進應力損傷后的肌肉再生, 并認為這種功

34、能是由于MGF激活了肌肉內處于靜息狀態(tài)的肌衛(wèi)星細胞增殖, 并且促進細胞遷移, 從而參與肌纖維融合完體外實驗證實了這一點, 比較MGF成再生修復8,18。和IGF-1轉染的C2C12成肌細胞發(fā)現(xiàn), MGF能促進該細胞增殖抑制分化, 而IGF-1具有促進分化的作用19, 同時Philippe等的實驗顯示MGF的C端E肽具有促進C2C12細胞遷移的功能12。以往的實驗使我們認為MGF也可能與應力刺激下骨密質的增加有關5, 本實驗中利用成骨細胞前體細胞MC3T3-E1, 研究所制備的des(1-3)MGF可能的生物活性。增殖實驗顯示, 我們所制備的des(1-3)MGF在一定的濃度范圍內比des(1-

35、3)IGF-1具有更高的促進MC3T3-E1增殖的作用, 其中10、20 ng/mL的促進作用最大, 在50、100 ng/mL的濃度下對細胞的增殖促進能力減弱, 造成這種現(xiàn)象的原因, 一方面可能存在促細胞增殖的濃度閾值, 另一方面可能與樣品中存在某些細胞毒性物質的濃度相應提高有關。細胞遷移實驗顯示, 25 ng/mL的des(1-3)MGF要比同濃度的des(1-3)IGF-1對細胞遷移的促進作用更為明顯。目前對于MGF與IGF-1表現(xiàn)出來的功能差異,圖5 des(1-3)MGF和des(1-3)IGF-1對MC3T3-E1細胞遷移的影響Fig. 5 Effect of des(1-3)MG

36、F and des(1-3)IGF-1 onMC3T3-E1 migration(a) migrated cells in one random microscopic field (×200), (b)average of 10 microscopic fields in each group3 討論MGF和IGF-1屬于胰島素家族成員, 原核表達胰島素取得了巨大成功, 已經(jīng)在臨床上廣泛用于糖尿病的治療, IGF-1與前胰島素有62%的同源性, 也是一種具有重要臨床價值的生長因子, 并有E. coli表達IGF-1成功的報道9,10。MGF是IGF-1的一種前體形式, 因其有望成為

37、治療肌肉萎縮和損傷修復MGF包含IGF-1的的新型藥物而倍受關注68,13,14。全部序列, 具有與IGF-1相同的二硫鍵配對方式, 區(qū)別在于MGF具有C端40個aa的E肽。IGF-1含有三對二硫鍵, 在E. coli的胞質環(huán)境中很難形成正確的配對, 因為錯配幾率高, 體外復性IGF-1包含體較困難, 以往的研究顯示包含體IGF-1的復性率最多只有50%10, 15。因為MGF與IGF-1有70個aa一致的序列, 我們推測MGF也面臨E. coli表達無活性的問題。將目的蛋白與可溶性好的蛋白融合表達是提高蛋白可溶性的有效策略, 我們分別采用pMAL-c2x和pET32a(+)兩種質粒構建des

38、(1-3)MGF融合表達系統(tǒng), 前者實現(xiàn)麥芽糖綁定蛋白(MBP)和des(1-3)MGF的融合表達, 后者是硫氧還蛋白(Trx)J張兵兵等: 力生長因子在大腸桿菌中的表達及活性分析232238.1185主要認為是由于MGF的C端E肽所致, 并認為細胞表面存在一種E肽的特殊受體, 因此MGF可能不通過IGF-1R進行信號轉導, 而是存在獨立的信號轉導通路, 并且MGF通過調節(jié)細胞中纖維蛋白溶解系統(tǒng)和基質金屬蛋白酶系統(tǒng)的表達促進細胞遷移12,19。上述實驗表明, 我們通過原核表達的MGF類似物des(1-3)MGF具備相應的生物活性, 這將有助于對MGF進行更深入的結構和功能研究。9 Kim SO

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