無溶劑體系中蛋白酶催化氨基酸糖酯合成研究

1、無溶劑體系中蛋白酶催化氨基酸糖酯合成研究黃成紅 馬林*基金項目 中山大學化學與化工學院第三屆創(chuàng)新化學實驗基金項目（批準號：02005）資助第一作者 黃成紅（1981年出生），女，中山大學化學與化工學院材料化學專業(yè)99級指導老師 馬林(導師) Email：cesmal中山大學化學與化工學院，有機化學研究所，廣州，510275摘要 在無溶劑體系中，糜蛋白酶催化N-叔丁氧?；?L-苯丙氨酸乙酯與D-葡萄糖進行酯交換反應，結(jié)果表明是在6位伯羥基(6-OH)進行定位?；?。生成的氨基酸葡萄糖酯可通過HPLC-UV定性并定量檢測,最適條件下的反應轉(zhuǎn)化率達到90%以上。關(guān)鍵詞 蛋白酶，無溶劑體系，糜蛋白酶，苯

2、丙氨酸，葡萄糖1 前言糖類是自然界廣泛存在的一大類生物活性分子。近年來糖科學的發(fā)展，揭示了糖類在生命過程中起著重要作用，參與了許多生理和病理現(xiàn)象。在細胞表面的大量受體分子幾乎都是糖蛋白或糖酯類糖鏈化合物，對生物信息的傳遞作用起著重要作用1。糖酯作為一種生物功能分子和化工原料具有重要價值,可用于醫(yī)藥、食品及高分子材料，具有其他單體無可比擬的優(yōu)越性。已經(jīng)合成并應用的糖酯多是高級脂肪酸糖酯、芳香酸糖酯，而氨基酸糖酯，除了甘糖酯已較為廣泛的應用于醫(yī)藥外，其他還不多見報道。氨基酸及多肽作為另一大類生物活性分子，具有多種生理功能。我們試圖將氨基酸及多肽的官能團引入糖類化合物，形成一類具有多種生理機能的氨基

3、酸糖酯化合物。但是氨基酸和多肽的化學合成，由于需要保護與脫保護，合成比較困難，為此Cerovsky等人用有機相酶催化反應，進行氨基酸糖酯合成的研究，反應轉(zhuǎn)化率達到20-60%，并表明產(chǎn)物主要是6位氨基酸糖酯2。糖是極性化合物，需要選擇強極性溶劑如吡啶、DMF等(或者將糖形成糖苷或其他衍生物以增加它在有機溶劑中溶解性) 3,4,而酶是水溶性的,不溶于有機溶劑,這就給有機溶劑中酶催化反應帶來許多困難，而無溶劑條件下或超飽和體系中酶催化可以解決這些問題。為此我們用蛋白水解酶進行氨基酸糖酯的合成研究。糜蛋白酶是一種研究比較多的酶，有較好的催化活性，它能催化水解L型芳香族氨基酸(如苯丙氨酸、酪氨酸和色氨

4、酸)所組成的肽鍵、酰胺鍵和酯鍵5。用糜蛋白酶直接催化苯丙氨酸、酪氨酸及色氨酸與葡萄糖進行酯化反應,之后先將苯丙氨酸形成酯,再與葡萄糖進行酯交換反應，反應式如下（scheme1）：Scheme1 N-叔丁氧酰基-L-苯丙氨酸乙酯與葡萄糖的酯交換反應2 實驗2.1 儀器和材料78-1磁力加熱攪拌器儀器，GKC-11R1型可控恒溫水浴鍋，SHZ-D循環(huán)水式真空泵，ZF-Z型三用紫外儀，HP1100型高效液相色儀，DAD檢測器。N-叔丁氧酰基L-酪氨酸、N-叔丁氧?；?L-賴氨酸、N-叔丁氧?；?L-苯丙氨酸均購于Sigma, Aldrich公司，蛋白酶購于日本化成工業(yè)株式會社，-糜蛋白酶、胃蛋白酶D

5、MAP和DCCI均為國產(chǎn)，其它試劑均為分析純，購于廣州化學試劑廠。2.2 實驗方法2.2.1 蛋白酶催化氨基酸與葡萄糖的酯化反應將3種氨基酸：N-叔丁氧?；鵏-酪氨酸、N-叔丁氧?；?L-賴氨酸、N-叔丁氧?；?L-苯丙氨酸與3種蛋白酶：-糜蛋白酶、胃蛋白酶、蛋白酶適量交叉混合于9支小試管中，再加入葡萄糖和一定pH值的K2HPO4/KH2PO4緩沖溶液10µl，攪拌均勻。和底物空白、酶空白一起密封置于45水浴中反應8天。取出用乙酸乙酯萃取后進行HPLC-UV檢測。2.2.2 N-叔丁氧酰基-L-苯丙氨酸乙酯的合成6按文獻用DMAP和DCCI在二氯甲烷中催化脫水合成，產(chǎn)物用乙酸乙酯萃取

6、并用飽和NaHCO3溶液洗滌有機層，以無水Na2SO4干燥，有機溶劑在真空下抽干,得白色油狀物。2.2.3 -糜蛋白酶催化N-叔丁氧?；?L-苯丙氨酸乙酯與葡萄糖的酯交換反應分別稱取N-叔丁氧?；?L-苯丙氨酸乙酯(25µmol)與硅藻土的混合物21.9mg和葡萄糖(0mg-9.9mg)于小試管, 再分別加入-糜蛋白酶(0-10mg)和一定pH值的K2HPO4/KH2PO4緩沖溶液(0µl-20.0µl)于小試管中，攪拌均勻。和底物空白一起密封置于45水浴中反應60-90小時。取出用乙酸乙酯萃取后進行HPLC-UV檢測。3 結(jié)果與討論3.1 蛋白酶催化氨基酸與葡萄

7、糖的酯化反應氨基酸直接與葡萄糖在蛋白酶催化下進行酯化，反應效果不好。相比之下，-糜蛋白酶在生理活性的pH值下催化效果比較好。胃蛋白酶在pH=1.5-2的酸性環(huán)境中催化活性會比較好。3種氨基酸的反應性沒有明顯差別，基本上都沒有產(chǎn)物氨基酸糖酯，僅-糜蛋白酶催化的苯丙氨酸有極少量酯生成。3.2 -糜蛋白酶催化N-叔丁氧?；?L-苯丙氨酸乙酯與葡萄糖的酯交換反應 鑒于無溶劑體系中-糜蛋白酶催化N-叔丁氧酰基-L-苯丙氨酸與葡萄糖的酯化反應效果較差，為此，我們合成了N-叔丁氧?；?L-苯丙氨酸乙酯，研究了-糜蛋白酶催化N-叔丁氧?；?L-苯丙氨酸乙酯與葡萄糖的酯交換反應。3.2.1 底物比對N-叔丁氧酰

8、基-L-苯丙氨酸乙酯與葡萄糖的酯交換反應的影響 圖1 底物比對反應的影響 一般在蛋白酶催化反應中排毒養(yǎng)顏膠囊，底物比為1時反應效果最好，并且可避免多酯及其它副產(chǎn)物生成。由圖1可見，轉(zhuǎn)化率在葡萄糖與N-叔丁氧酰基-L-苯丙氨酸乙酯的配比為0.75左右最好。由于N-叔丁氧酰基-L-苯丙氨酸乙醇酯是油狀物，比較難抽干其中的水，所以葡萄糖與N-叔丁氧?；?L-苯丙氨酸乙酯的實際比接近1。 3.2.2 加酶量對N-叔丁氧?；?L-苯丙氨酸乙酯與葡萄糖的酯交換反應的影響 圖2 加酶量對反應的影響 酶不會改變反應平衡，但可以加快反應速度，所以在一定時間內(nèi)轉(zhuǎn)化率隨酶量增加相應增大。但由于加酶量大會增大工藝成本

9、，我們往往權(quán)衡反應轉(zhuǎn)化率、反應時間及工藝成本尋求一個比較合適的加酶量。由圖2可見，當?shù)孜锪俊?加水量及其它條件一定時，轉(zhuǎn)化率隨加酶量增加而增大，到一個最大值時又呈下降趨勢。這可能因為水量一定，過多的酶爭奪水分子，必然有一些水分子處于失活狀態(tài)，導致反應體系中載體、底物和帶結(jié)合水的活性酶分子不能均勻分散，使反應速度減小。這樣痔瘡偏方，一定時間內(nèi)的反應轉(zhuǎn)化率也就相應減小。 3.2.3 加水量對N-叔丁氧?；?L-苯丙氨酸乙酯與葡萄糖的酯交換反應的影響 酶催化反應中，酶只需少量結(jié)合水，-糜蛋白酶只需幾十分子水既可以保持其構(gòu)象以維持催化活性。多余的水一方面會使-糜蛋白酶失活，另一方面會導致氨基酸糖酯水解

10、，蛋白酶在水溶液中是催化多肽和酯水解的。由圖3可知，在未加水時，依然有氨基酸糖酯生成，但轉(zhuǎn)化率很低，只有10左右。當加水量增大時，轉(zhuǎn)化率也隨之增大，但副反應產(chǎn)物也增多。-糜蛋白酶與水的質(zhì)量比為1：1較合適。 圖3加水量對反應的影響 圖4 pH值對反應的影響3.2.4 pH值對N-叔丁氧?；?L-苯丙氨酸乙酯與葡萄糖的酯交換反應的影響緩沖溶液的pH值主要會對酶活性中心的離子鍵、疏水作用及氫鍵有影響，并進一步影響其高級結(jié)構(gòu)怎么減肚子。-糜蛋白酶的酶解作用是由三個活性中心協(xié)同完成的，而這三個活性中心又分別在兩條鏈（B鏈和C鏈），所以pH值對其影響不可忽略，合適的pH值維持其高級結(jié)構(gòu)是很重要的7。由圖

11、7可知，-糜蛋白酶的催化活性在pH值78時比較好，而在這個范圍附近，pH值對酶的催化活性影響并不是很大，pH=7.5時出現(xiàn)最大值。3.2.5 反應時間對N-叔丁氧酰基-L-苯丙氨酸乙酯與葡萄糖的酯交換反應的影響由于無溶劑體系的反應在反應過程中沒有攪拌，完全是靠自然擴散來完成，所以隨著反應時間延長，反應的轉(zhuǎn)化率增大。圖5反映了反應時間對-糜蛋白酶催化N-叔丁氧酰基-L-苯丙氨酸乙酯與葡萄糖的酯交換反應轉(zhuǎn)化率的影響，圖5(a)為未反應的HPLC-UV檢測圖，譜圖上只有N-叔丁氧?；?L-苯丙氨酸乙酯的吸收峰。圖5（b）為反應60小時的檢測圖，第一個峰為N-叔丁氧?；?L-苯丙氨酸葡萄糖酯的吸收峰，

12、從峰面積可以看到反應的轉(zhuǎn)化率在70左右。圖5（c）為反應90小時的檢測圖, 毛孔大怎么辦反應基本完全，轉(zhuǎn)化率達到90以上。(a) (b) (c)圖5 反應時間對N-叔丁氧?；?L-苯丙氨酸乙酯與葡萄糖的酯交換反應的影響4 結(jié)論N-叔丁氧?；?L-苯丙氨酸乙酯與葡萄糖在-糜蛋白酶催化下進行酯化反應效果不好，生成N-叔丁氧?；?L-苯丙氨酸乙酯后再與葡萄糖在-糜蛋白酶催化下進行酯交換反應，反應的轉(zhuǎn)化率提高。這與-糜蛋白酶的催化機制有關(guān)，His-57的殘基咪唑基是一個高效的質(zhì)子受體與給體，它能接受Ser-102殘羥基的質(zhì)子，使Ser-102形成一個高度極化親核基團，利于和底物的親電基團結(jié)合。而直接用

13、氨基酸，氨基酸羧基上的質(zhì)子則可能與Ser-102的殘羥基競爭，影響活性中心的協(xié)同作用機制。另外，酶催化反應受多種因素影響，我們通過一系列的條件實驗，以尋找反應的最佳條件。理想的無溶劑催化反應中，兩種底物的分子等量、均勻的分布，單分子層排列在每個載體分子周圍。載體表面形成的產(chǎn)物分子層可以及時離開，其它底物分子又擴散到載體分子表面。這樣在沒有攪拌的情況下，酶分子可以通過自然擴散，以最大的反應速度催化反應完成。致謝 我衷心感謝馬林教授岳陽家政、古練權(quán)教授和黃志紓副教授的悉心指導，徐迪師姐的細心指導及實驗室各位師兄師姐的支持與幫助，和黃仲立老師為我們提供的高效液相檢測。參 考 文 獻1郭勇.生物制藥技

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16、hem.1982,47,1962-19657張玉彬.生物催化與手性合成.第1版.北京：化學工業(yè)出版社，2002：16Protease-catalyzed synthesis of monosaccharide amino acid ester in solvent-free system Huang Cheng-hong, Ma Lin* (School of Chemistry and Chemical Engineering, Zhongshan University,Institute of Organic Chemistry, Guangzhou 510275)Abstract The result showed that D-glucose was selectively acylated at one primary hydroxyl(6-OH) when reacting with N-tBOC-phenylalan