肥大細胞膜穩(wěn)定劑對大鼠重癥急性胰腺炎腸組織保護作用的實驗研究

1、作者：王紅祿 孫家邦 張淑文 崔葉青 李非 劉爽【摘要】目的：探討肥大細胞（MC）穩(wěn)定劑酮替芬對重癥急性胰腺炎（SAP）大鼠腸道組織的保護作用。方法：SAP大鼠模型前或模型后30min給予酮替芬，模型后3h及6h取大鼠末端回腸組織行HE染色觀察病理變化。甲苯胺藍及免疫組化染色計算MC數(shù)目，測定髓過氧化物酶（MPO）活性了解中性粒細胞（PMN）聚集程度，Western Blot法檢測類胰蛋白酶表達。結(jié)果：酮替芬應(yīng)用組腸組織病理損害較SAP組明顯減輕；酮替芬預(yù)處理組3h及6h甲苯胺藍染色每高倍視野MC計數(shù)分別為1.21及1.08，相應(yīng)時段SAP組MC計數(shù)為3.52及1.38，兩組3h MC計數(shù)差異

2、有統(tǒng)計學(xué)意義，6h MC計數(shù)差異無統(tǒng)計學(xué)意義；酮替芬早期治療組3h及6h MC計數(shù)為1.19及1.03，與酮替芬預(yù)處理組同時段比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義；各組免疫組化染色MC計數(shù)亦呈上述趨勢；酮替芬處理組MPO活性較SAP組明顯降低；酮替芬處理組類胰蛋白酶表達較SAP組明顯下降。結(jié)論：預(yù)防性或SAP早期應(yīng)用酮替芬，可減輕SAP腸組織的損害。 【關(guān)鍵詞】胰腺炎，急性壞死性肥大細胞酮替芬小腸大鼠，SpragueDawley Experimental study of protective effects of mast cell stabilizer on ileum of rat with sever

3、e acute pancreatitis 【ABSTRACT】Objective:To investigate the protective role of mast cells stabilizer on ileum of rats with severe acute pancreatitis(SAP).Methods:Ketotifen was intraperitoneal injected 30 minutes before or after SAP model,after 3 hours and 6 hours,terminal ileum was removed to make H

4、E staining,to count the number of MC by the method of toluidine blue staining and immunohistochemistry staining,to measure the level of MPO and activation level of tryptase by western blot,and compare these parameters with those of SAP rats without ketotifen treatment.Results:The pathologic damage o

5、f ketotifen treatment group was lighter than SAP groups.The MC numbers per high visual field of 3h and 6h of ketotifen pretreatment group were 1.21 and 1.08,and the MC numbers of SAP group 3.52 and 1.38,there was significant difference between 3h groups,but no significant difference between 6h group

6、s.There was no significant difference between the ketotifen pretreatment group and the early treatment group;the data of MC number by immunohistochemistry staining has the similar trend,and the activation level of MPO of ketitofen group was lower than SAP group,And the expression of tryptase in keto

7、tifen group decreased compared with that of SAP group.Conclusion:MCs are activated in the early period of SAP,and induce damage of ileum.Pretreatment or early using of ketotifen can decrease the severity of ileum in SAP. 【KEY WORDS】Pancreatitis,acute necrotizingMast cellKetotifenIntestine,smallRats,

8、SpragueDawley 重癥急性胰腺炎（severe acute pancreatitis,SAP）發(fā)病機制仍未徹底闡明。肥大細胞（mast cell,MC）是一種重要炎癥效應(yīng)細胞，SAP時，MC激活釋放的細胞因子及炎性介質(zhì)，可導(dǎo)致腸粘膜屏障功能受損，腸內(nèi)細菌及內(nèi)毒素移位，發(fā)生胰腺及胰外器官感染等。酮替芬是一種MC穩(wěn)定劑，通過穩(wěn)定MC膜抑制MC的脫顆粒，降低炎性介質(zhì)及細胞因子的釋放，從而降低組織損害程度。本研究主要觀察酮替芬對大鼠SAP腸組織的作用，現(xiàn)報告如下。 1材料和方法 1.1動物及試劑雄性SD大鼠72只，體重230260g，購自軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物中心。牛磺膽酸鈉、富馬酸酮替芬、

9、鼠抗人類胰蛋白酶單抗、鄰聯(lián)茴香胺二鹽酸等主要試劑購自于美國Sigma公司。 1.2模型制備及分組參照Aho1等的方法制備SAP動物模型，抽簽法隨機分為6組，每組12只。A組：假手術(shù)組，腹腔內(nèi)注射純水（pure water,PW）4ml/kg。30min后制作假手術(shù)模型，模型后3h及6h隨機各取6只大鼠，取末端回腸組織10cm(距回盲部5cm)行HE染色、甲苯胺藍染色及類胰蛋白酶免疫組化染色、酶顯色法檢測MPO髓過氧化物酶活性，Western blot法檢測肥大細胞類胰蛋白酶（mast cell tryptase,MCT）表達。B組：SAP組，腹腔內(nèi)注射PW后30min制作SAP模型，測定方案同

10、A組。C組：SAP+酮替芬組，腹腔內(nèi)注射0.025%酮替芬溶液1mg/kg，30min制作SAP模型，測定方案同A組。D、E、F 3組動物數(shù)量、制模方法、測定方案同A、B、C 3組，只是把制模前30min的相應(yīng)干預(yù)改在制模后30min給予。 1.3觀察腸組織病理變化HE染色光鏡下觀察腸粘膜絨毛結(jié)構(gòu)及形態(tài)的完整性，有無腸絨毛萎縮、上皮分離、炎性細胞浸潤、絨毛破損、脫落現(xiàn)象，了解腸粘膜受損情況。 1.4甲苯胺藍染色行MC計數(shù)甲苯胺藍液染色后，隨機選10個高倍視野（400），計算腸組織MC平均數(shù)目，并觀察MC脫顆粒情況，從而判斷MC的活性。 1.5類胰蛋白酶免疫組化染色MC計數(shù)MCT染色膠片，利用I

11、DA2000數(shù)碼圖像分析系統(tǒng)分析，隨機取10個高倍視野行MC平均計數(shù)。 1.6回腸組織MPO活性檢測稱取各組回腸組織100mg，剪碎后加入0.5%溴化十六烷基三甲胺（hexadecyltrimethyl ammonium bromide,HTAB）2ml，充分勻漿，反復(fù)凍融3次，超聲粉碎后，12000r/min，4離心30min，取上清液0.1ml加鄰聯(lián)茴香胺反應(yīng)液2.9ml。立即在紫外分光光度計460nm波長下掃描2min,記錄第30s和第90s的光密度差值。 MPO活力單位（U/g）=(A460/min)/(11.3所加組織量g/L反應(yīng)液) 1.7Western blot法測定回腸組織MC

12、T表達聚丙烯酰胺凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜、10%脫脂奶粉封閉后，加入1150稀釋的鼠抗人類胰蛋白酶單抗，萬向脫色搖床上4下過夜，棄去一抗。加入12000堿性磷酸酶標記的羊抗鼠IgG，室溫下2h。堿性磷酸酶顯色液顯色，蛋白條帶掃描儲存，KDS1D圖像轉(zhuǎn)換系統(tǒng)測出每條帶的平均灰度值。 1.8統(tǒng)計學(xué)處理實驗結(jié)果以（xs）表示，采用SPSS11.5統(tǒng)計軟件，3組資料比較，采用單因素方差分析，再行組間q檢驗；兩組數(shù)據(jù)采用獨立樣本t檢驗。P0.05認為有統(tǒng)計學(xué)差異。 2結(jié)果 2.1腸組織病理變化A組：大鼠腸粘膜絨毛完整、無破損，無炎性細胞浸潤，見圖1。B組：3h見腸粘膜絨毛頂端上皮下間隙增大、粘膜層與固有層分離、炎

13、性細胞浸潤、絨毛頂端破損；6h見絨毛破損、斷裂，見圖2。C組：腸粘膜絨毛可見為粒細胞浸潤、絨毛上皮頂端分離、絨毛萎縮，但絨毛結(jié)構(gòu)尚保持完整，見圖3。C組制模前后腸組織病理變化一致。 2.2甲苯胺藍染色MC計數(shù)A組：腸組織內(nèi)MC數(shù)目少，體積小，MC呈非活化狀態(tài)見圖4。B組：3h 時MC數(shù)增多，體積增大，見圖5；6h 時MC數(shù)較SAP 3h減少，見圖6。C組：3h組與B組3h組腸組織MC數(shù)相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義；6h組3組MC數(shù)比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義，見表1、2。C組制模前后給同時段MC數(shù)，差異無統(tǒng)計學(xué)意義，見表3。 2.3類胰蛋白酶免疫組化染色A組：腸組織免疫組化染色MC少見，且體積小，見圖7。

14、B組3h組MC增多，且體積增大，染色深，見圖8；6h組MC數(shù)下降，染色深度較3h組降低。C組：3h與B組同時段組比較，MC數(shù)下降，染色變淺，見圖9；6h組與B組相同時段比較，MC數(shù)變化不明顯，見表1、2。C組制模前后同時段MC數(shù)差異無統(tǒng)計學(xué)意義，見表3。2.4腸組織MPO活性A組：3h組腸組織MPO活性即明顯增強，6h組MPO活性增強更明顯。B組：與B組相應(yīng)時段比較，MPO活性明顯降低，但仍高于A組；C組6h與3h相比，MPO活性明顯增高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，見表1、2。D、E、F組制模前后給予酮替芬相同時段觀察，MPO活性差異無統(tǒng)計學(xué)意義，見表3。表13個制模前干預(yù)組腸組織甲苯胺藍MC計數(shù)與類

15、胰蛋白酶MC計數(shù)（個/高倍視野）、MPO活性（U/L）表23個制模后干預(yù)組腸組織甲苯胺藍MC計數(shù)與類胰蛋白酶MC計數(shù)（個/高倍視野）、MPO活性（U/L）（xs）組別MC（甲苯胺藍）3h6hMC（類胰蛋白酶）表3C組腸組織甲苯胺藍MC計數(shù)與類胰蛋白酶MC計數(shù)（個/高倍視野）、MPO活性 2.5腸組織MCT表達腸組織Western blot結(jié)果表明，無論是制模前干預(yù)還是制模后干預(yù)組，A組蛋白條帶最淺，B組蛋白條帶明顯加深，C組各時段MCT條帶深度較B組明顯變淺，但較A組稍深。3h組與6h組比較，條帶深度相似。見圖10和表4。表4制模前后干預(yù)腸組織Western blot條帶平均灰度值3討論 腸粘

16、膜肥大細胞（intestinal mucosal mast cells,IMMC）存在于腸道粘膜固有層，與腸神經(jīng)、血管相鄰，和其它免疫細胞及神經(jīng)系統(tǒng)通過神經(jīng)肽和細胞因子相互作用，形成精密的調(diào)控網(wǎng)，維持正常的腸道生理功能。唐承薇等2認為，IMMC的過度活化與MODS的發(fā)病有關(guān)。IMMC的過度活化釋放出大量的細胞因子及炎癥介質(zhì)，促使免疫亢進，加重病理損傷3。SAP時，IMMC被激活，后者脫顆粒釋放細胞因子及炎性介質(zhì)引起腸組織血管擴張，IMMC是腸道組織TNF的主要來源，在所有產(chǎn)生TNF的腸道細胞中，IMMC占其中的60%，TNF是MODS時激活細胞級聯(lián)反應(yīng)，引起過度炎癥反應(yīng)的主要介質(zhì)4。其所激活的

17、嗜酸性粒細胞變性成分也可直接損傷腸上皮細胞。這些均導(dǎo)致腸粘膜通透性增加，腸內(nèi)細菌移位，胰腺及胰外器官感染，繼而啟動MODS的發(fā)生。研究證實，SAP感染的胰腺及胰周培養(yǎng)出的細菌多數(shù)為大腸和末段回腸常駐菌，依次為大腸埃希桿菌屬、變形桿菌屬、類腸球菌屬5。可見腸道細菌移位是導(dǎo)致胰腺及其它器官繼發(fā)感染的重要原因。Andoh等6研究認為，MC在腸道缺血再灌注損傷中還起著重要作用。酮替芬通過穩(wěn)定MC，降低對SAP腸道組織的損害。 SAP時，中性粒細胞（polymorphonuclear,PMN）聚集及激活是腸組織損傷的重要因素。SAP時，MC激活釋放PMN趨化因子，加重了PMN的聚集，MPO活性上升。聚集

18、的PMN，一方面機械性堵塞毛細血管致微循環(huán)障礙；另一方面釋放大量的炎性介質(zhì)，加重腸組織的損傷。Dib等7給予急性胰腺炎大鼠MC穩(wěn)定劑，顯著減少了結(jié)腸和肺MPO的產(chǎn)生。表明MC穩(wěn)定劑的應(yīng)用減輕了組織中PMN的聚集，從而降低了SAP時肺臟及腸道組織中的炎癥反應(yīng)。 MC在循環(huán)中以未分化的定向前體形式存在，易于聚集在炎癥部分，并增殖為MC。SAP時，組織損傷釋放的細胞因子和炎性介質(zhì)，趨化MC前體進入炎癥部位，分化增殖為成熟的MC。Yonetci等8于蛙皮素誘導(dǎo)的急性胰腺炎大鼠模型前30min給予酮替芬，明顯減少了MC的數(shù)量，表明酮替芬通過穩(wěn)定MC，減少了細胞因子及炎癥介質(zhì)的釋放，從而減少了對MC的趨化

19、作用，使腸組織中MC數(shù)量下降。MC脫顆粒釋放的MCT是MC的主要蛋白酶，是MC活性的特異性標記蛋白。Mentula等9報道，發(fā)生MODS的SAP患者血清中MCT的峰值較未發(fā)生MODS者明顯升高，表明MC的激活在SAP及其所致的MODS的發(fā)病機制中起著重要作用。 參考文獻 1Aho HJ,Koskensalo ML,Nevalainen TJ.Experimental pancreatitis in the rat:sodium taurocholateinduced acute haemorrhagic pancreatitisJ.Scand J Gastroenterol,1980,15:4

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