高考選修考點(diǎn)五：基因工程

1、考點(diǎn)五：基因工程基礎(chǔ)知識一、基因工程的含義與工具1 .基因工程與遺傳工程：基因工程是狹義的遺傳工程。廣義的遺傳工程泛指把一種生物的遺 傳物質(zhì)(細(xì)胞核、染色體脫氧核糖核酸等)移到另一種生物的細(xì)胞中去，并使這種遺傳物質(zhì)所帶 的遺傳信息在受體細(xì)胞中表達(dá)。2 .基因工程的核心是：構(gòu)建重組DNA分子。3 .基因工程的工具(1)限制性核酸內(nèi)切酶a.來源:主要是從微生物(如細(xì)菌)中分離純化出來的。b.功能:識別并切開每條鏈中兩個脫氧核甘酸之間的磷酸二酯鍵。c.特點(diǎn):具有專一性，表現(xiàn)在以下兩個方面：識別DNA分子中某種特定的核甘酸序列；使每一條鏈中特定位點(diǎn)的兩個核甘酸之間的磷酸 二酯鍵斷開。d.作用結(jié)果:產(chǎn)生

2、粘性末端 或平末端。(2)DNA連接酶功能:將末端堿基互補(bǔ)的2個DNA片段連接起來。(3)載體a.最常用的載體一一質(zhì)粒實質(zhì):是能夠自主復(fù)制的雙鏈環(huán)狀 DNA分子，是一種特殊的遺傳物質(zhì)，在細(xì)菌中以獨(dú)立于擬核 之外的方式存在。b.其他載體：噬菌體、植物病毒和動物病毒等。二、基因工程基本操作步驟1 .基因工程基本操作“五步曲”(1)獲得目的基因序列未知：建立一個包括目的基因在內(nèi)的基因文庫，再從基因文庫中獲取。序列已知 化學(xué)方法(如逆轉(zhuǎn)錄法)合成或者用PCR擴(kuò)增目的基因。PCR技術(shù)與DNA復(fù)制的比較PCR技術(shù)DNA復(fù)制相同點(diǎn)原理DNA雙鏈復(fù)制（堿基互補(bǔ)配對）原料四種游離的脫氧核甘酸條件模板、酶、能量等

3、不同點(diǎn)解旋方式DNA在圖溫卜受性解旋解旋酶催化場所體外復(fù)制主要在細(xì)胞核內(nèi)酶熱穩(wěn)定的DNA聚合酶細(xì)胞內(nèi)含有的DNA聚合酶結(jié)果在短時間內(nèi)形成大量的 DNA片段形成整個DNA分子（2）形成重組DNA分子曩體（質(zhì)粒）DNA分廣（含目的基因）一同種限制性一核酸內(nèi)切的切割囊得粘性末端 獲得目的基因I 重SID N A分子（環(huán)狀重組質(zhì)粒）一般采用同種限制性核酸內(nèi)切酶切割質(zhì)粒和目的基因，以獲得相同的粘性末端 （或平末端，以利于形成重組 DNA分子，但有時用不同的限制性核酸內(nèi)切酶處理也可以獲得相同的粘性末端（或平末端）。目的基因的插入可能會破壞轉(zhuǎn)基因生物原有基因的結(jié)構(gòu)，影響轉(zhuǎn)基因生物的正常生長，甚至致死。限制性

4、核酸內(nèi)切酶只識別雙鏈DNA分子中特定的核甘酸序列，對RNA不起作用。用DNA連接酶連接時，可形成3種不同的連接物 的的基因一載體連接物、載體一載體連接物、目的基因一目的基因連接物 ，導(dǎo)入受體細(xì)胞后，可利用抗性基因的差異進(jìn)行篩選。（3）將重組DNA分子導(dǎo)入受體細(xì)胞生物種類植物細(xì)胞動物細(xì)胞微生物細(xì)胞常用方法農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法顯微注射技術(shù)2+ 一一，Ca處理法受體細(xì)胞體細(xì)胞受精卵原核細(xì)胞轉(zhuǎn)化過程將目的基因插入Ti質(zhì)粒的T-DNA上一導(dǎo)入農(nóng)桿 菌一侵染植物細(xì)胞一目的基因穩(wěn)定維持和表達(dá)將重組DNA分子提純一 取卵（受精卵）一顯微注射 一受精卵發(fā)育一獲得具有新性狀的動物.2+ .、用Ca處理細(xì)胞使之成為感受態(tài)細(xì)

5、胞一重組 DNA分子與感受態(tài)細(xì)胞混合一感受態(tài)細(xì)胞吸收重組DNA分子（4）篩選含有目的基因的受體細(xì)胞原理:質(zhì)粒上有抗生素抗性基因等標(biāo)記基因。方法利用選擇培養(yǎng)基 篩選。舉例：所有受體細(xì)胞？處含四環(huán)素培養(yǎng)基？活的受體細(xì)胞迪里?導(dǎo)人，養(yǎng)重組DNA分子含重組DNA分子的受體細(xì)胞（質(zhì)粒上有四環(huán)素抗性基因）在實際應(yīng)用中還有：a.檢測是否插入目的基因 利用DNA分子雜交技術(shù)，目的基因DNA 一條鏈（作探針）與受體細(xì) 胞中提取的DNA雜交，看是否有雜交帶。b.檢測是否轉(zhuǎn)錄出了 mRNA,禾1J用核酸分子雜交技術(shù)，目的基因DNA 一條鏈（作探針）與受體細(xì) 胞中提取的mRNA雜交，看是否有雜交帶。（5）目的基因的表

6、達(dá)：看到目的性狀或分離到目的基因表達(dá)產(chǎn)物檢測目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì) ，方法是從轉(zhuǎn)基因生物中提取蛋白質(zhì) ，用相應(yīng)的抗體進(jìn)行 抗瓦抗體雜交。個體生物學(xué)水平的鑒定：如轉(zhuǎn)基因抗蟲植物是否出現(xiàn)抗蟲性狀。2 .有關(guān)基因工程操作易錯分析基因文庫中的基因保存在受體菌中。(2)原核生物繁殖快、多為單細(xì)胞、遺傳物質(zhì)相對較少，有利于目的基因的復(fù)制與表達(dá) ，因此常采用大腸桿菌等原核生物作為受體細(xì)胞。(3)植物細(xì)胞的全能性較高，可經(jīng)植物組織培養(yǎng)過程成為完整植物體，因此受體細(xì)胞可以是受精卵也可以是體細(xì)胞；動物基因工程中的受體細(xì)胞一般是受精卵。(4)操作工具有三種，但常用工具酶有兩種，載體不是酶；在基因工程操作步驟“獲得

7、目的基因”和“形成重組DNA分子”兩個過程中通常用同種限制酶，目的是產(chǎn)生相同的粘性末端(或平末端);DNA連接酶只在“形成重組DNA分子”操作中用到。(5)一般情況下，用同一種限制性核酸內(nèi)切酶切割質(zhì)粒和含有目的基因的DNA片段，但有時可用兩種限制性核酸內(nèi)切酶分別切割質(zhì)粒和目的基因，這樣可避免質(zhì)粒和質(zhì)粒之間、目的基因和目的基因之間的連接。(6)標(biāo)記基因的種類和作用：標(biāo)記基因的作用一一篩選、檢測目的基因是否導(dǎo)入受體細(xì)胞，常見的有抗生素抗性基因、發(fā)光基因(表達(dá)產(chǎn)物為帶顏色的物質(zhì))等。三、基因工程與遺傳育種1 .轉(zhuǎn)基因植物一一八一a所需時間較短培育優(yōu)占? b.克服遠(yuǎn)緣親本？ 難以雜交的缺陷2 .轉(zhuǎn)基因

8、動物含義轉(zhuǎn)入了外源基因的動物。(2)培育優(yōu)點(diǎn)：省時、省力。四、基因工程與疾病治療1.基因工程藥物名稱成分用途傳統(tǒng)方法基因工程方法胰島素蛋白質(zhì)治療胰島素依賴型糖尿病從豬和羊的胰腺中提取通過大腸桿菌生產(chǎn)干擾素?糖蛋白治療病毒性肝炎和腫瘤從人血液中提取通過基因工程，使人白細(xì)胞干擾素基因獲得克隆和表達(dá)乙型肝炎疫苗蛋白質(zhì)預(yù)防乙型肝炎通過基因工程利用酵母菌和哺乳動物細(xì)胞生產(chǎn)2.基因治療指的是向目標(biāo)細(xì)胞中引入正常功能的基因，以糾正或補(bǔ)償基因的缺陷達(dá)到治療的目的。五、基因工程與生態(tài)環(huán)境保護(hù)1 .利用轉(zhuǎn)基因植物生產(chǎn)聚羥基烷酯，用于合成可降解的新型塑料。2 .改造分解石油的細(xì)菌，提高其分解石油的能力。3 .利用轉(zhuǎn)

9、基因微生物吸收環(huán)境中的重金屬、降解有毒化合物和處理工業(yè)廢水。重點(diǎn)難點(diǎn)1.限制性核酸內(nèi)切酶、基因工程的三大操作工具限制性核酸內(nèi)切酶（限制酶）的作用限制酶切割時斷開的是 DNA分子中的磷酸二酯鍵（即相鄰脫氧核甘酸間的鍵 ，而不是兩條鏈之間的氫鍵。如圖切點(diǎn)I cJk二的（2）限制性核酸內(nèi)切酶具有專一性 ，表現(xiàn)在兩個方面識別雙鏈DNA分子中特定的核甘酸序列。切割特定序列中的特定位點(diǎn)。如圖 ：2.DNA連接酶（1）DNA連接酶的作用限腳件梗酸內(nèi)切蜂即糊DN4分71示意圖兩個來源不同的 DNA用相同的限制性核酸內(nèi)切酶切割，形成相同的粘性末端（或平末端）。DNA連接酶能催化磷酸與脫氧核糖之間化學(xué)鍵的形成，將

10、兩個DNA末端的縫隙“縫合”起來。如圖：二蒯nn 二獺n門麗需日.口 MH.nw HQ 口口 口后 UR口口 Huh 日.口 口 Q 口口 Hu HUR 日1|陋占康接麻口口 且口四口 口MUM3:3百"而網(wǎng)制性賊裱內(nèi)切碓ffinNii風(fēng)航作河小gm(2)幾種易混淆酶的比較名稱功能應(yīng)用限制酶特異性地切斷DNA鏈中的磷酸二酯鍵重組DNA技術(shù)DNA連接酶連接DNA片段之間的磷酸二酯鍵基因工程DNA聚合酶連接DNA片段與單個脫氧核甘酸之間的磷酸二酯鍵DNA復(fù)制RNA聚合酶連接RNA片段與單個核糖核甘酸之間的磷酸二酯鍵RNA復(fù)制和轉(zhuǎn)錄逆轉(zhuǎn)錄酶作用于磷酸二酯鍵以RNA為模板獲得DNADNA解旋

11、酶使堿基對之間的氫鍵斷裂DNA復(fù)制DNA水解酶使DNA分子所有磷酸二酯鍵斷裂水解DNA3.載體的種類及作用(1)載體應(yīng)具備的特征能在宿主細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定保存并大量復(fù)制。有1個或多個限制性核酸內(nèi)切酶切點(diǎn)，以便與外源基因連接。具有某些標(biāo)記基因，以便進(jìn)行篩選。(2)載體的種類細(xì)菌質(zhì)粒，最常用大腸桿菌質(zhì)?；蚴删w和某此動植物病毒，因此人們根據(jù)不同目的和需求，對某些天一般來說天然的載體往往不能滿足人們的所有要求然的載體進(jìn)行人工改建。(3)作用一是用它作為運(yùn)載工具，將目的基因送到宿主細(xì)胞中去 ；二是利用它在宿主細(xì)胞內(nèi)對目的基因進(jìn)行大量復(fù)制。二、基因診斷與基因治療1 .基因診斷(1)方法:DNA分子雜交法(即DN

12、A探針法)該方法是根據(jù)堿基互補(bǔ)配對原則 ，把互補(bǔ)的雙鏈 DNA解開，把單鏈的DNA小片段用同位素、熒光分子或化學(xué)發(fā)光催化劑等進(jìn)行標(biāo)記，之后同被檢測的DNA中的同源互補(bǔ)序列雜交，從而檢出所要查明的 DNA或基因。(2)步驟:抽取病人的組織或體液作為化驗樣品；將樣品中的DNA分離出來；用化學(xué)法或熱處理 法使樣品DNA解旋;將事先制作好的 DNA探針引入化驗樣品中，這些已知的經(jīng)過標(biāo)記的探針 若能夠在化驗樣品中找到互補(bǔ)鏈，則與之結(jié)合(雜交而一起找不到互補(bǔ)鏈的DNA探針則可 以被洗脫。這樣通過對遺留在樣品中的標(biāo)記過的DNA探針進(jìn)行基因分析，就能檢出病人所得的病。2 .基因治療(1)原理利用正?；蚣m正或

13、補(bǔ)償基因的缺陷，即把正?；?qū)牖颊唧w內(nèi)，使該基因的表達(dá)產(chǎn)物發(fā)揮功能，從而達(dá)到治療疾病的目的，而原有缺陷基因一般不做處理。(2)方法:有體外基因治療和體內(nèi)基因治療，體外基因治療方法療效較好。如重度免疫缺陷癥的 體外基因治療方法：科工淋學(xué)嗯的突粵一缺陷的T淋已細(xì)胞培養(yǎng)轉(zhuǎn)化腺背酸脫密酶基因轉(zhuǎn)入正常腺tr酸脫氮酶基因患者皆.注射 許多正常增殖,培養(yǎng)三性,址尸價附一髓細(xì)織中T淋巴細(xì)胞ILMI”地胞I體內(nèi)的T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生腺仔酸脫氨酶方法：限制性核酸內(nèi)切酶和 DNA連接酶作用分析1.限制酶限制酶具有專一性，表現(xiàn)在兩個方面：(1)識別雙鏈DNA分子中特定的核甘酸序列。識別序列的特點(diǎn)：呈現(xiàn)堿基互補(bǔ)對稱，無論是

14、奇數(shù)個堿基還是偶數(shù)個堿基，都可以找到一條中軸線，如圖，中軸線兩側(cè)的雙鏈 DNA上的堿基是反向?qū)ΨQ重復(fù)排列的。如以中心線為軸，兩側(cè)堿基互補(bǔ)對稱門, 為軸，兩側(cè)堿基互補(bǔ)對稱。GGTCC r（2）切割特定序列中的特定位點(diǎn)，使每一條鏈中特定部位的兩個核甘酸之間的磷酸二酯鍵斷開。產(chǎn)生的DNA片段末端通常有兩種形式一一粘性末端和平末端。a.粘性末端：當(dāng)限制酶在它識別序列的中軸線兩側(cè)將DNA的兩條鏈分別切開時，產(chǎn)生的是粘性末端。如:EcoRI識別GAATTC序列，將G與A之間的磷酸二酯鍵切開。如圖所示 ：切第森J ' FtI I | r-" I I I 1"nnwn中軸線型熱點(diǎn)粘

15、性末端b.平末端：當(dāng)限制酶在它識別序列的中軸線處切開時 ，產(chǎn)生的則是平末端。如:Smal識別CCCGGG序歹U,將C與G之間的磷酸二酯鍵切開。如圖所示i切割出-T1I_*"! I T 'q G / H I I;一一點(diǎn)中物緣知能拓展（1）限制酶具有專一性，一般情況下，不同限制酶切割形成的粘性末端（或平末端）不同。但也有用不同限制酶處理后形成的粘性末端（或平末端）相同,可以用DNA連接酶進(jìn)行連接。如GGATCC和GATC限制酶識別的序列不同，但處理后形成的末端相同。（2）一般情況下，用同一種限制酶分別處理質(zhì)粒和目的基因，使其具有相同的粘性末端 （或平末端）。但如果都用相同的兩種限制酶分別處理，也可形成分別對應(yīng)的相同粘性末端（或平末端）,例如目的基因的兩端分別有BamHl和Hindin的酶切位點(diǎn)，質(zhì)粒上也有這兩種酶的切點(diǎn)。如圖所示：J4亦eH I"加4HIb月皿H I DXA連接隨 r 飛?限:072.限制酶選擇的注意事項圖甲圖乙根據(jù)目的基因兩端的限制酶切點(diǎn)確定限制酶的種類應(yīng)選擇切點(diǎn)位于目的基因兩端的限制酶，如圖甲可選擇 Psti。不能選擇切點(diǎn)位于目的基因內(nèi)部的限制酶，如圖甲不能選擇Smail o為避免目的基因和質(zhì)粒的自身