石榴葉乙醇水提取物的抑菌殺蟲活性研究修改建議王慶忠

1、石榴葉乙醇水提取物的抑菌殺蟲活性研究王東方 谷鵬 柏顯首 王慶忠 山東省高校生物化學(xué)與分子生物學(xué)重點實驗室（濰坊學(xué)院生物與農(nóng)業(yè)工程學(xué)院）,山東,濰坊,261061)（濰坊學(xué)院 生物與農(nóng)業(yè)工程學(xué)院，山東省高校生物化學(xué)與分子生物學(xué)重點實驗室， 山東 濰坊 261061）摘要 用索氏提取法以用乙醇水加熱提取石榴葉的有效成分，并對提取物的對細菌的抑菌作用和及對果蠅與和槐蚜觸殺活性藥理作用活性進行了初步探究。結(jié)果表明，石榴葉提取物對革蘭氏陽性菌（白色葡萄球菌）有明顯抑制作用，其有效抑菌濃度值為40mg/mL ；對果蠅的藥理作用明顯，數(shù)據(jù)變化顯著，有上升趨勢；對槐蚜藥理作用有明顯的觸殺活性，其LC50為1

2、0.4203mg/mL。因此，石榴葉提取物對革蘭氏陽性菌及昆蟲有良好的的抑菌殺蟲效果。關(guān)鍵字 石榴葉；提取物；生物活性；細菌；果蠅中圖分類號 S482.1 文獻標(biāo)識碼 AThe Study of the Ethanol Antimicrobial, Insecticidal Biological Activity of the Ethanol and Water Extract of Pomegranate LeafWang Dongfang, Gu Peng, Bai Xianshou, Wang QingzhongKey Laboratory of biochemistry and mol

3、ecular biology in university of Shandong province (College of bio-engineering and agriculture, Weifang university), Shandong, Weifang, 261061abstract In present study, theAn active ingredient was of the extracted fron of pomegranate leaf extracted by Soxhlet extraction method with ethanol and water

4、solution accompanied by with heatinged, and preliminary study of the extract that can interacted bacteria bacteriostatic action and the activity of the drosophilas and the Cassia aphids pharmacological role initial inquiry. The results showed that pomegranate leaf extract have significantly suppress

5、 of Gram-positive bacteria (Staphylococcus albus),the effective inhibitory concentration value of 40mg/ml; and it has obviously pharmacological on Drosophila with data changes, and rising;With pharmacological effects Cassia aphids value , its LC50 is 10.4203mg/mL. Therefore, the pomegranate leaf ext

6、ract is good antibacterial insecticidal effect on gram-positive bacteria and insect.Key words pomegranate leaf; extract; biological activity ; Bacterial; drosophilas石榴葉為石榴科植物石榴(punica granatun L)的葉。石榴葉具有收斂止瀉、解毒殺蟲功效，主治泄瀉、痘風(fēng)瘡、癩瘡、跌打損傷，在埃及作為傳統(tǒng)的藥材。以前的研究表明，科學(xué)研究者對石榴葉化學(xué)成分進行了許多研究，取得了較大進展，其藥理活性也日益明確。從石榴葉中含有已分

7、離到20多種化合物，其中包括熊果酸、白果酸、白樺脂酸、甘露醇 、菟資單寧、鞣花單寧以及黃酮苷類等化合物1。 已有研究表明石榴葉水浸劑能顯著增強大鼠胃蛋白酶活性，促進膽汁分泌，并可以加強大鼠小腸蠕動；能顯著抑制大鼠胃液分泌和總酸排出量2。研究還觀察到石榴葉水浸劑對大鼠試驗性胃潰瘍的作用，發(fā)現(xiàn)石榴葉水浸劑可顯著降低大鼠胃潰瘍發(fā)生率，并減少胃潰瘍面積和降低胃潰瘍程度。石榴葉水提取物在調(diào)節(jié)血脂、清除氧自由基等方面也有活性，具有調(diào)脂作用的活性部位石榴葉鞣質(zhì)，在體外試驗中，石榴葉鞣質(zhì)能明顯抑制還原酶活性，石榴葉鞣質(zhì)的效價較辛伐他汀強100倍左右，同時也提示了石榴葉鞣質(zhì)降低膽固醇的作用機制，部分與抑制該酶活

8、性有關(guān)3；鞣質(zhì)能凝固微生物體的原生質(zhì)及多種酶，因而對各種細菌和真菌有抑制作用。臨床研究已經(jīng)證實石榴皮對淋球菌有明顯的抑制作用。4本實驗用乙醇水提取石榴葉的有效成分，然后用提取液對細菌進行抑菌試驗和果蠅毒理實驗，統(tǒng)計和分析實驗所得數(shù)據(jù)，最終得到試驗結(jié)果。1 材料和方法1.1 材料與儀器試劑材料來源：石榴葉采集于濰坊學(xué)院校園內(nèi)；大腸桿菌（革蘭氏陰性菌）和白色葡萄球菌（革蘭氏陽性菌）菌株取自濰坊學(xué)院生物與農(nóng)業(yè)工程學(xué)院微生物實驗室，菌種斜面培養(yǎng)進行繁殖；成年雌雄黑腹果蠅取自遺傳實驗室，后在微生物實驗室內(nèi)擴代培養(yǎng)了；槐蚜采集于濰坊學(xué)院校內(nèi)。主要儀器有800型中藥粉碎機（青州市精誠醫(yī)藥裝備制造有限公司）、

9、RE5299旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、SHZIIIA循環(huán)水真空泵（上海一凱設(shè)備有限公司）、CJ一1680型超凈工作臺，YSQSG41280型手提式壓力蒸汽滅菌鍋、低溫冰箱、指形管等。主要試劑有乙醇（上海凌峰化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn)）、二甲基亞砜（DMSO）（國藥集團化學(xué)試劑有限公司）、鏈霉素、青霉素；牛肉膏、蛋白胨、瓊脂；蔗糖、Nacl、甲醇、HCl、NaOH等。以上藥品均為AR級。1.2石榴葉提取物的制備采集石榴葉并經(jīng)清洗和晾干；烘箱中65烘干后，用中藥粉碎機粉碎1530s；稱取100g粉末置入索氏提取裝置的燒瓶中，加入75乙醇500ml，在電磁恒溫攪拌器上攪拌煮沸回流萃取2h；真空抽濾后用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀40濃縮

10、至干；稱重后，用10 DMSO配制成配制成濃度為60mg/ml儲存液備用。5。1.3石榴葉提取物對細菌的抑菌活性測定 將培養(yǎng)基制成平板，細菌用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基。用無菌生理鹽水把各種菌種（大腸桿菌和白色葡萄球菌菌種）配制成106107個L孢子懸液，吸取0.2 mL孢子懸液均勻涂抹到滅菌平板上。6用10% DMSO將石榴葉提取物配制成濃度分別為10 mg/L、 20 mg/L、 30 mg/L 、40 mg/L 、50 mg/L、 60 mg/L的溶液。將直徑約0.4cm濾紙圓片置于各質(zhì)量濃度的溶液中浸泡，將浸漬過提取物溶液的濾紙片風(fēng)干，放到每個涂有菌液的平板上，等距離放4片，每個試驗平行3次，

11、文中所列數(shù)據(jù)為平均值。細菌培養(yǎng)在37下24 h。測定抑菌圈直徑大小，并用無菌水作空白對照(以CK表示)，以直徑大于1.00cm為有效果來確定抑菌效果7。以上操作均在無菌條件下進行。統(tǒng)計結(jié)果（如圖1）。圖1 提取物的抑菌效果用10% DMSO分別配制鏈霉素、青霉素各濃度。鏈霉素：30u/mL、50u/mL、80u/mL、100u/mL、150u/mL、200u/mL；青霉素：10 mg/L、1 mg/L、10-1 mg/L、10-2 mg/L、10-3 mg/L。作為參照，將直徑約0.4cm濾紙圓片置于各質(zhì)量濃度的溶液中浸泡，將浸漬過提取物溶液的濾紙片風(fēng)干，放到每個涂有菌液的平板上，等距離放4片

12、，每個試驗平行3次，文中所列數(shù)據(jù)為平均值。細菌培養(yǎng)在37下24 h。測定抑菌圈直徑大小，并用無菌水作空白對照(以CK表示)，以直徑大于1.00cm為有效果來確定抑菌效果。以上操作均在無菌條件下進行7。統(tǒng)計結(jié)果。（見圖2和圖、3）圖2 鏈霉素的抑菌效果圖3 青霉素的抑菌效果1.4 石榴葉提取物對果蠅的毒理活性測定研究石榴葉提取物對果蠅的影響方案常采用棉球飼喂法。8。（1）配制果蠅培養(yǎng)基，飼養(yǎng)繁殖黑腹果蠅。（2）供試飼養(yǎng)液的制備：用2%的蔗糖水溶液作為對照培養(yǎng)液；在2%的蔗糖水溶液中加入不同量的石榴葉提取物，配制成一定濃度梯度：1、2、3、4、5及10mg/mL。（3）果蠅毒性試驗：供試果蠅為黑腹

13、果蠅成蟲，用乙醚麻醉后，饑餓56h后飼以不同濃度的供試溶液，準備10個指形管，每指形管中放置一個0.2g的脫脂棉球，棉球上蘸有大約2.5mL飼養(yǎng)液，各指形管中接入大約25頭果蠅，設(shè)置5次重復(fù)，用2%的蔗糖水溶液作為對照組，所有的指形管置于溫度25、相對濕度為5060%、光照周期為12D/12L的培養(yǎng)箱中，連續(xù)飼養(yǎng)4d，每1213h記錄各處理的死亡果蠅數(shù)，4d統(tǒng)計匯總各組果蠅死亡數(shù)。9 。（見圖4）圖4 不同濃度下的死亡率圖1.5 石榴葉提取物對槐蚜的殺蟲活性測定石榴葉提取物的殺蚜活性測定采用室內(nèi)葉片法。采集蟲口密度大的國槐枝葉帶回實驗室，選擇帶蚜葉片，剔除不合格的蟲，以大小適中的健康無翅成蚜為

14、試蟲，并將帶蟲葉片修剪為每片25頭蟲左右，置于鋪有濾紙的培養(yǎng)皿中。用10DMSO水溶液梯度稀釋石榴葉提取物儲存液，并噴灑于各個試驗皿中，以10 DMSO水溶液作為對照，然后置于溫度為25、濕度為80的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，24后統(tǒng)計蚜蟲死亡率。每濃度3次重復(fù)，死亡率以3次重復(fù)的平均值計。10死亡率（%） 100 ； 校正死亡率（%） 100 。2 結(jié)果分析與小結(jié)2.1 石榴葉提取物及青霉素、鏈霉素對細菌的抑菌活性測定通過以上3個圖表（圖1、2和3）可以看出，提取物的成分與青霉素的效果相似，對白色葡萄球菌（即革蘭氏陽性菌）有明顯效果，而對大腸桿菌（即革蘭氏陰性菌）無明顯效果。2.2 石榴葉提取物對果蠅的

15、毒理活性測定結(jié)果由圖4可以看出，提取物對果蠅有很好的觸殺作用，濃度越高，死亡數(shù)越多。其觸殺作用的毒力回歸方程0.95515+10.07，相關(guān)系數(shù)為R20.9635，其LC50=52.36mg/ml表 石榴葉提取物對槐蚜的觸殺作用（SEM，n=4）11提取液濃度mgmL-124h死亡率%24h校正死亡率%6096.841.296.725095.071.994.894086.31.289.522077.41.480.291038.92.140.35對照3.61.7注：表示與對照組比較差異顯著（0.05）2 結(jié)果分析與小結(jié)2.1 石榴葉提取物及青霉素、鏈霉素對細菌的抑菌活性測定通過以上3個圖表（圖1

16、、2和3）可以看出，提取物的成分與青霉素的效果相似，對白色葡萄球菌（即革蘭氏陽性菌）有明顯效果，而對大腸桿菌（即革蘭氏陰性菌）無明顯效果。2.2 石榴葉提取物對果蠅的毒理活性測定結(jié)果由圖4可以看出，提取物對果蠅有很好的觸殺作用，濃度越高，死亡數(shù)越多。其觸殺作用的毒力回歸方程0.95515+10.07，相關(guān)系數(shù)為R20.9635，其LC50=52.36mg/ml2.3 石榴葉提取物對槐蚜的殺蟲活性測定結(jié)果由表可以看出，提取物對槐蚜有很好的觸殺作用，2040時，校正死亡率達到89.52；當(dāng)濃度為60mgmL時，校正死亡率達到96.72。其觸殺作用的毒力回歸方程21.28120.71，相關(guān)系數(shù)為R2

17、0.864，LC50為10.4203mg/mL。2.4 緒論與討論 小結(jié)石榴葉提取物對革蘭氏陽性菌有明顯的抑菌效果，對革蘭氏陰性菌效果不明顯；提取物對黑腹果蠅成蟲有明顯毒害作用，且毒性效果與濃度呈正相關(guān)，可用作除蠅成分。提取物對槐蚜有明顯的防治效果，60mg/ml提取物24h后的防治效果達96.72，與目前使用的化學(xué)農(nóng)藥吡蟲啉的防治效果相比無顯著差異（P0.05）。石榴是我國重點發(fā)展的經(jīng)濟水果之一，在我國各地均有栽培，種植面積正大規(guī)模發(fā)展。但是在很多地區(qū)石榴葉僅作為茶葉飲用，這就造成了嚴重的資源浪費。在今后，社會應(yīng)進一步加強石榴葉的藥理活性成分研究，為臨床研制出一個新的有效天然藥物，為天然性新

18、藥的開發(fā)打下良好基礎(chǔ)12。石榴葉越來越明確的藥理作用已經(jīng)越來越受到人們的關(guān)注，相信隨著對天然性藥物研究的深入，必將擁有一個更加明亮的開發(fā)前景。參考文獻1 周建華,胡建平.石榴生物活性物質(zhì)的研究進展J.中國釀造，2008(14):4244.2 雷帆,邢東明,向蘭，等.石榴葉提取物中鞣花酸在大鼠體內(nèi)藥物動力學(xué)研究J.藥品評價,2005(1):2325.3 鄧文龍,王浴生,等.中藥藥理與應(yīng)用(二版) M.人民衛(wèi)生出版社,北京,1998.4 趙彥君，師寶君，胡兆農(nóng)杠柳毒素NW殺蟲活性昆蟲知識，2008，45(6)：9509525張羽飛, 于春麗, 張春枝.乙醇室溫浸提法提取黃芩總黃酮的工藝條件J. 大連輕工業(yè)學(xué)院學(xué)報,2004,23(3):190193.6 周德慶. 微生物學(xué)實驗手冊M.上?？萍汲霭嫔?上海，1987.7 付良臣,孟昭禮. 柳樹中用抑菌活性物的初步研究J.當(dāng)代生態(tài)農(nóng)業(yè), 2005, 21（1）：113 114.8 王菊鳳, 李鵠鳴. 蛹