內(nèi)生放線菌和寄主植物的抑菌活性及其關系

1、內(nèi)生放線菌和寄主植物的抑菌活性及其關系 作者：鐘莉田新莉周敏王韜成秋香陳振華范云覃重軍 【摘要】從68種中草藥植物中分離了 560株內(nèi)生放線菌菌株，其中84株(約 占15%)對金葡菌有抑菌活性，36株(約6%)對白念珠菌有抑菌活性，提示中草 藥植物的內(nèi)生放線菌可能是抗菌新藥的一個來源。檢測了 9種中草藥植物的水 或乙醇抽提液對金葡菌的抑菌活性，發(fā)現(xiàn)內(nèi)生放線菌菌株的抑菌活性與其寄主 植物沒有明顯的對應關系。 【關鍵詞】中草藥植物；內(nèi)生放線菌；抑菌活性 ABSTRACT This paper reports that total 84 or 36 out of the tested 560 end

2、ophytic actinomycetes strains from 68 Chinese medicinal herbs, showed inhibition activity against Staphylococcus aureus or Candida albicans, respectively, suggesting a potential source for novel antibiotics. Further investigation by using water or ethanol extracts of the nine herbs against Staphyloc

3、occus aureus, indicated no apparent relationships on inhibition of the pathogen between herbs and their endophytic actinomycetes. KEY WORDS Chinese medicinal herbs; Endophytic actinomycetes; Inhibition activity 目前發(fā)現(xiàn)的放線菌(主要來自土壤)產(chǎn)生的抗生素和生理活性物質(zhì)超過 10000種，占己發(fā)現(xiàn)微生物藥物的約2/3 1。近年來從獨特生境中分離放線 菌并尋找新的抗生素已逐漸受到重視，如從

4、植物組織內(nèi)部中分離其內(nèi)生放線菌 和尋找新抗生素2。我國擁有豐富的中草藥植物資源，其中一些中草藥長期 被用來清熱解毒、化膿消腫，提示可能存在抗菌活性物質(zhì)。本文報道從68種中 草藥植物中分離大量的內(nèi)生放線菌，其中約15%菌株具有抗金葡菌的活性，約6% 菌株對白念珠菌有抑菌活性。此外，初步探討了內(nèi)生放線菌與其寄主植物在抗 菌活性方面可能的對應關系。 1材料與方法 1.1中草藥植物和病原菌來源 本試驗所用大部分中草藥植物采自上海植物園，丹參和燈盞花采自云南昆 明(邱明華研究員提供)，青蒿采自四川酉陽(利民青蒿基地提供)，金葡菌由揚 州大學微生物實驗室金文杰老師提供。 試驗中分離內(nèi)生放線菌所用的為S培養(yǎng)

5、基2、S培養(yǎng)基+重鉻酸鉀+萘啶 酮酸、S培養(yǎng)基+重鉻酸鉀+萘啶酮酸+鏈霉素、S培養(yǎng)基+重鉻酸鉀+萘啶酮酸+萬 古霉素等4種培養(yǎng)基(重鉻酸鉀的終濃度為85J mol/L,萘啶酮酸65p mol/L, 鏈霉素2p g/ml,萬古霉素4p g/ml),純化和進一步培養(yǎng)內(nèi)生放線菌采用高氏 一號培養(yǎng)基3。培養(yǎng)金葡菌用LB培養(yǎng)基D 1.3植物內(nèi)生放線菌的分離 將采摘的新鮮植物用清水洗凈，根、莖、葉各部分分開，于陰涼處風干。 用70%的乙醇、0.87%的次氯酸鈉和10%的碳酸氫鈉分別處理5、20和lOmin以 達到表面消毒，接著 用無菌水洗滌三次，再用無菌濾紙吸干水分。將植物剪成 約1cm的小段，置于上述4

6、種分離培養(yǎng)基表面，于30*0培養(yǎng)。樣品表面消毒方 法參照文獻4, 5,分離內(nèi)生放線菌的方法參照文獻4，根據(jù)形態(tài)和培養(yǎng) 特征初步鑒定放線菌菌株參照文獻3，部分放線菌菌株的鑒定采用16S rDNA序列測定和比對。 1.4內(nèi)生放線菌的抑菌試驗 金葡菌或白念珠菌接種于25ml LB液體，37°C培養(yǎng)過夜，取10ml菌液與 250ml LB混合，澆制成平板。植物內(nèi)生放線菌菌株接種于高氏一號培養(yǎng)基，于 3(TC生長7d,用打孔器在平板上打孔，接種針挑出放線菌瓊脂菌塊，放置在混 合有指示菌的平板上，30°C培養(yǎng)2?3d后觀察和測量可能的抑菌圈。 1.5植物的水或乙醇的提取及提取液的抑菌試

7、驗 將采摘的新鮮植物用清水洗凈和風干，一份稱取0.8g,用研磨碾碎后加入 3.2ml 70%乙醇，隔一段時間振蕩一次進行萃?。涣硪环莘Q取0. lg,進行表面 消毒(方法同上)，然后剪碎并轉(zhuǎn)移至Eppendorf管，用研磨碾碎后加入0.4ml 無菌水浸泡。將滅菌的圓形濾紙片(4mm)置于混合有指示菌的平板上，加入 5p 1水或醇提取液于濾紙片上，30°C培養(yǎng)2?3d后進行抑菌圈測定D 2結(jié)果 2. 1中草藥植物的內(nèi)生放線菌對金葡菌和白念珠菌的抑菌活性 從上海市植物園、云南昆明和四川酉陽等地釆集到68種中草藥植物，表面 消毒后在4種固體培養(yǎng)基上共分離，并初步鑒定了 560株內(nèi)生放線菌。這

8、些放 線菌菌株在高氏一號培養(yǎng)基上經(jīng)劃線純化培養(yǎng)后打下圓形菌塊，置于混合有金 葡菌或白念珠菌的平板上以檢測可能的抑菌活性。表1結(jié)果顯示，來自35種中 草藥植物的84株內(nèi)生放線菌對金葡菌具有抑菌活性(抑菌圈直徑在4.5?19mra, 詳細數(shù)據(jù)未列出），占測試菌株總數(shù)的約15%。來自33種中草藥植物(包括白毛 夏枯草、腹水草、萱草、大蔥、小蔥、大蒜、艾蒿、燈盞花、三七、青蒿、移 星草、薄荷、三白草、富貴草、九頭獅子草、絞股藍、東風菜、玄參、白英、 茜草、馬兜鈴、博落回、厚果雞血藤、杜仲、山楂、側(cè)柏、苦參、桑樹、雪松、 川楝、三尖杉、日本常山云和南旌節(jié)花)的167株內(nèi)生放線菌未檢測到明顯的抑 制金葡菌

9、的活性。 除去分離到較少(如<5株)內(nèi)生放線菌菌株的植物外，分離菌株較多的植物 如紫金牛、野蕎麥、毛茛和紫菀等的內(nèi)生放線菌菌株具有抑菌活性的比例較高， 分別為56%、50%、50%和41%，提示具有抑制金葡菌活性的植物內(nèi)生放線菌的分 布可能有偏好性。 表1結(jié)果顯示，來自22種中草藥植物中的36株放線菌對于白念珠菌具有 抑菌活性(約占測試菌株總數(shù)的6%)，其中來自貫眾、磨芋、敗醬和陸 英等的內(nèi) 生放線菌菌株具有抑菌活性的比例較高，分別為21%、表1 43種中草藥植物 中對金葡菌和白念珠菌有抑菌活性的內(nèi)生放線菌株數(shù)20%、17%和29%。 2.2中草藥植物的抽提液對金葡菌的抑菌活性 為了進一

10、步研究內(nèi)生放線菌菌株與其寄主中草藥植物在有或無抑菌活性方 面是否有對應關系，我們測定了一些植物提取液的抑菌活性。選取內(nèi)生放線菌 菌株具有較高抑菌比例的紫金牛、野蕎麥、毛莨、紫菀和貫眾等5種植物，以 及具有較低抑菌比例的陸英、打破碗花花、括樓和澤蘭等4種植物，用水或70% 乙醇抽提，檢測對金葡菌的抑菌活性。表2結(jié)果表明，雖然紫金牛、毛茛、紫 菀和貫眾等4種植物的水或醇提取物具有抑菌活性，但野蕎麥的水或醇提取液 中沒有檢測到抑菌活性：另一方面，雖然括樓的提取液中沒有抑菌活性，但是 陸英、打破碗花花和澤蘭的提取液中卻具有抑菌活性。這些結(jié)果顯示，內(nèi)生放 線菌菌株對金葡菌的抑菌活性與其寄主植物沒有明顯的

11、對應關系。 3討論 由于植物內(nèi)生菌來自獨特的生存環(huán)境而成為人們尋找微生物新藥的一個重 要藥源。在植物內(nèi)生放線菌產(chǎn)生抗生素方面，有報道從杜鵑花6、蛇藤7 和衛(wèi)矛科植物8分離到的內(nèi)生放線菌產(chǎn)生了新的抗細菌或真菌的化合物。國 內(nèi)文獻報道了水稻內(nèi)生放線菌產(chǎn)生抗真菌的活性9，三葉草中的內(nèi)生放線菌 有抗細菌活性10,西雙版納藥用植物中分離的165株內(nèi)生放線菌中有70株 表現(xiàn)抗多種細菌和真菌活性11。在我們的試驗中，發(fā)現(xiàn)68種中草藥植物的 560株內(nèi)生放線菌中表2 9種新鮮中草藥植物的抽提液對金葡菌的抑菌活性有 84株(約15%)對金葡菌具有抑制活性，有36株放線菌(約6%)對白念珠菌具有 抑菌活性，進一步

12、表明中草藥植物內(nèi)生放線菌可能是篩選抗菌新藥的一個重要 資源。 1993年Stierle等12從短葉紅豆杉中發(fā)現(xiàn)一種可以產(chǎn)紫杉醇的內(nèi)生真 菌，此后還有許多類似的報道，導致了一種觀點：由于植物內(nèi)生菌與寄主植物 的協(xié)同進化，內(nèi)生菌可以產(chǎn)生與寄主植物相同的物質(zhì)。我們的試驗結(jié)果表明， 至少對抑制金葡菌的活性而言，內(nèi)生放線菌菌株的抑菌活性與其寄主植物的沒 有明顯的對應關系。一種可能的原因是放線菌屬于原核生物，寄主植物為真核 生物，兩者之間遺傳物質(zhì)的交換特別是基因表達存在很大障礙；而同屬于真核 生物的內(nèi)生真菌與寄主植物的遺傳物質(zhì)交流和表達的障礙較小。 致謝：上海植物園草藥園，中科院云南植物研究所邱明華研究員

13、，四川酉 陽利民青蒿基地，揚州大學微生物實驗室金文杰老師。 【參考文獻】 1 Berdy J. Bioactive microbial metabolites, a personal view J . J Antibiot,2005,58(l):l?26. 2 曹理想，周世寧.植物內(nèi)生放線菌研究J.微生物學通報，2004, 31 :93 ?96. 3 阮繼生，劉志恒，梁麗糯，等.放線菌研究及應用M.北京：科學出 版社，1990： 2?18. 4 曹理想，田新莉，周世寧.香蕉內(nèi)生真菌、放線菌類群分析J.中山 大學學報，2003, 42(2): 70?73. 5 宋子紅，丁立孝，馬伯軍，等.花生內(nèi)

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