蛋白純化硫酸銨沉淀鹽析法

1、蛋白純化硫酸銨沉淀鹽析法法還能想起那些在熒屏中曾經(jīng)震撼過我們，具有超能力的英雄么？蜘蛛俠，敏捷，靈活迅速飛流直下，忽閃直沖高樓；綠巨人浩克，力量，速度，耐力，在我們的想象力中膨脹；還有，我們隨身攜帶星形盾牌，品格高尚的美國隊(duì)長(zhǎng)幻想里中的人物形象存在我們的記憶力，然而生物背景出身的我們，總歸要鍛煉出屬于自己的實(shí)驗(yàn)技能，即便是相同的實(shí)驗(yàn)步驟，每個(gè)人做出來的結(jié)果也不盡相同，差別在哪？反復(fù)練習(xí)，用心總結(jié)出屬于自己的心得，轉(zhuǎn)化為自己的實(shí)驗(yàn)“超能力”吧。本文總結(jié)了蛋白純化硫酸銨沉淀詳細(xì)的實(shí)驗(yàn)原理、步驟，供大家參考。 -鍛煉屬于我們自己的實(shí)驗(yàn)“超能力”之一我是超級(jí)蜘蛛精看我有勁兒不？而我是一只冷靜的科研小蝸

2、牛沖啊，我是美國隊(duì)長(zhǎng)這次，我們所要分享的便是一種很常見，但是也很重要的蛋白質(zhì)純化方法：硫酸銨沉淀蛋白法，一起走進(jìn)實(shí)驗(yàn)室吧。硫酸銨沉淀法是粗分離蛋白時(shí)常用的純化和濃縮蛋白的技術(shù)。蛋白質(zhì)的溶解度和鹽濃度密切相關(guān)，在低濃度的條件下，隨著鹽濃度的增加，蛋白質(zhì)的溶解度增加；但在高濃度的鹽溶液里，鹽離子競(jìng)爭(zhēng)性的結(jié)合蛋白表面的水分子，破壞蛋白表面的水化膜，溶解度降低，蛋白質(zhì)在疏水作用下聚集形成沉淀。每種蛋白質(zhì)的溶解度不同，因此可以用不同濃度的鹽溶液來沉淀不同的蛋白質(zhì)。硫酸銨的溶解度大，解離形成大量的NH4+、SO42-離子，會(huì)結(jié)合大量的水分子，使蛋白質(zhì)的溶解度下降，另外，其溫度系數(shù)小，不易使蛋白質(zhì)變性，因此

3、，蛋白質(zhì)粗分離時(shí)硫酸銨沉淀法是很重要的一種技術(shù)，后續(xù)可采用層析技術(shù)進(jìn)一步純化蛋白，效率更高。硫酸銨沉淀法是常用的分離免疫球蛋白的方法。各種不同蛋白質(zhì)鹽析需要不同濃度的硫酸銨溶液。在實(shí)驗(yàn)中建議配置不同梯度濃度的硫酸銨溶液來確定蛋白質(zhì)沉淀所需的最佳濃度。（1） 參照如下表格配置不同濃度的硫酸銨溶液；例如，在25 條件下，配置飽和度為100 %的硫酸銨溶液，稱取767 g的硫酸銨固體，邊攪拌邊加入到1 L的蒸餾水中，完全溶解后，用氨水或者硫酸調(diào)節(jié)pH到7.0。（2） 沉淀蛋白將樣品離心，去除沉淀，保留上清液并測(cè)量體積；一邊攪拌一邊慢慢的加入硫酸銨。接著，將溶液放在磁力攪拌器上攪拌6 h，或者4 ，攪

4、拌過夜，使蛋白質(zhì)充分沉淀。加入硫酸銨有兩種方式，一種是直接加入硫酸銨固體，在操作上速度緩慢，不易太快，否則會(huì)造成蛋白變性；另一種方式是加入飽和的硫酸銨液體，但若需要較高濃度的硫酸銨溶液，需要加入較大體積的飽和硫酸銨溶液，在后續(xù)實(shí)驗(yàn)操作中，因蛋白質(zhì)上清液和硫酸銨飽和溶液的體積之和過大，離心機(jī)無法離心，因此根據(jù)需要加入的硫酸銨飽和溶液的體積選擇合適的方法。另外，每種蛋白質(zhì)沉淀所需要的硫酸銨溶液的濃度也不同，因此在每次實(shí)驗(yàn)中應(yīng)該做好觀察記錄，積累經(jīng)驗(yàn)值。分享來自網(wǎng)上的一種簡(jiǎn)單的方法來估計(jì)蛋白沉淀所需要的硫酸銨溶液的濃度范圍，供大家參考：將蛋白質(zhì)溶液分成5份，每份分別加入硫酸銨至濃度分別為20%、30%、40%、50%、60%，離心，棄蛋白質(zhì)沉淀，留取上清，再向上清液中加入硫酸銨，使得濃度從原先的20%升高到30%，30%的濃度升到40%，40%的濃度升為50%.，離心保留沉淀，分析沉淀中是否含有目的蛋白，以此確定沉淀目的蛋白所需要的最佳硫酸銨溶液的濃度。（3） 透析除去硫酸銨將蛋白質(zhì)溶液離心沉淀，棄上清保留沉淀。加入10-20 ml的PBS-疊氮化鈉溶液溶解蛋白質(zhì)，疊氮化鈉不于蛋白質(zhì)反應(yīng)，但能防止蛋白質(zhì)變性。蛋白沉淀溶解之后，放入透析袋中透析24-48 h，每隔5 h更換透析液除去硫酸銨。收集透析液，離心，測(cè)