一種改進(jìn)型動(dòng)態(tài)應(yīng)變?nèi)S細(xì)胞培養(yǎng)裝置的研制

1、一種改進(jìn)型動(dòng)態(tài)應(yīng)變?nèi)S細(xì)胞培養(yǎng)裝置的研制         11-02-08 17:00:00     編輯：studa20                 作者：張玉龍，秦廷武，楊志明 【摘要】  介紹了一種用于組織工程研究的改進(jìn)型動(dòng)態(tài)應(yīng)變細(xì)胞培養(yǎng)裝置，針對原有的舊設(shè)備，分別從控制單元的硬件和軟件設(shè)

2、計(jì)、機(jī)械單元結(jié)構(gòu)及細(xì)胞培養(yǎng)單元的結(jié)構(gòu)三方面進(jìn)行改進(jìn)和升級，新裝置使用范圍廣、可控精度高、操作簡單。 【關(guān)鍵詞】  組織工程；細(xì)胞培養(yǎng)；生物反應(yīng)器；機(jī)械刺激；動(dòng)態(tài)應(yīng)變    Abstract：An improved dynamic strain device for cell culture used in tissue engineering is introduced in this paper. It is improved in three aspects including the design of hardware and software

3、of controlled unit, the structure of mechanical unit, and the cell culture unit compared with the old device. The advantages of the new device are also discussed.    Key words：Tissue engineering；Cell culture；Bioreactor；Mechanical stimulus；Dynamic strain    1  引

4、0; 言    隨著組織工程的進(jìn)一步發(fā)展，傳統(tǒng)的靜態(tài)培養(yǎng)已經(jīng)不能滿足組織工程的要求。在細(xì)胞-支架復(fù)合物靜態(tài)培養(yǎng)中，由于重力的因素，細(xì)胞很容易聚集在載體外或載體底部，導(dǎo)致支架中細(xì)胞生長分布不均、成活率不高。研究表明應(yīng)力刺激是調(diào)節(jié)細(xì)胞生理功能的重要因素, 對組織的形成起促進(jìn)作用1。組織工程化組織培養(yǎng)與應(yīng)用的成功需要合適的應(yīng)力(應(yīng)變) 條件，機(jī)械應(yīng)力(應(yīng)變) 是一種重要的影響細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的外界刺激2，適宜的機(jī)械刺激條件能誘導(dǎo)和促進(jìn)體外細(xì)胞增殖3。目前，廣泛使用的細(xì)胞加載裝置主要有旋轉(zhuǎn)式生物反應(yīng)器、灌注式生物反應(yīng)器、基底膜拉伸式加載裝置等。旋轉(zhuǎn)式生物反應(yīng)器通過旋轉(zhuǎn)模擬一

5、種微重力環(huán)境4，并且反應(yīng)器的旋轉(zhuǎn)還有利于氧氣與營養(yǎng)成分的運(yùn)輸；灌注式生物反應(yīng)器通過流體剪切力對細(xì)胞進(jìn)行動(dòng)態(tài)刺激5，基底膜拉伸式裝置通過氣壓6、液壓7的方式作用于彈性膜，間接作用與附著在彈性膜上的細(xì)胞，使之受到拉伸刺激。我們在2000年自行研制了一臺動(dòng)態(tài)細(xì)胞培養(yǎng)裝置8，用于體外細(xì)胞動(dòng)態(tài)培養(yǎng)和組織工程化組織的體外構(gòu)建，在長達(dá)近8年的使用過程中，已暴露出一些問題。因此，為了更好的進(jìn)行組織工程方面研究，綜合考慮了其他生物反應(yīng)器的優(yōu)點(diǎn)后，我們又研制了一臺改進(jìn)型的動(dòng)態(tài)應(yīng)變?nèi)S細(xì)胞培養(yǎng)裝置，針對老設(shè)備在諸多方面做了一些改進(jìn)，新裝置結(jié)構(gòu)更為簡單，操作更為方便，傳質(zhì)效率高，并且不易發(fā)生污染。 

6、0;  2  系統(tǒng)設(shè)計(jì)    新裝置與舊裝置的總體設(shè)計(jì)基本相同：將細(xì)胞種植在三維支架材料中，通過電機(jī)驅(qū)動(dòng)三維支架材料拉伸運(yùn)動(dòng)產(chǎn)生動(dòng)態(tài)應(yīng)變，使之作用于附著在支架材料中的細(xì)胞，見圖1。整個(gè)裝置由控制單元、機(jī)械單元和細(xì)胞培養(yǎng)單元組成?？刂茊卧饕晌⑻幚砥?、驅(qū)動(dòng)電路和人機(jī)操作界面（顯示器和鍵盤）組成；機(jī)械單元主要由直線步進(jìn)電機(jī)、滾珠絲杠、滾珠絲母和直線導(dǎo)軌組成；細(xì)胞培養(yǎng)單元包括培養(yǎng)瓶、夾具、三維支架、細(xì)胞及培養(yǎng)液等。機(jī)械單元和細(xì)胞培養(yǎng)單元置于CO2培養(yǎng)箱中。   3  組成單元基本結(jié)構(gòu)和工作原理  &

7、#160; 3.1  控制單元    圖2  控制部分原理框圖    Fig 2  Schematics of the control unit    不同，新裝置采用89C52+ ispLSI1032雙片控制系統(tǒng)，具有極強(qiáng)的靈活性和通用性。ispLSI器件是當(dāng)今世界上速度最快，密度最高的CPLD之一，它采用先進(jìn)的ISP（系統(tǒng)內(nèi)編程）技術(shù)，使器件無需拆卸即可在系統(tǒng)內(nèi)重新配置邏輯功能，使用復(fù)雜的可編程邏輯器件取代了老設(shè)備傳統(tǒng)的標(biāo)準(zhǔn)集成電路、接口電路，因此，新裝置的控制器體積明顯

8、減小，操作也更為快捷。根據(jù)總體設(shè)計(jì)思想，其他硬件配置主要包括：74LS373地址鎖存器，62256數(shù)據(jù)存儲器，LED數(shù)碼管，一個(gè)鍵盤控制接口，步進(jìn)電機(jī)驅(qū)動(dòng)器SH_2H042Ma等。此裝置通過鍵盤輸入電機(jī)工作的初始值，包括電機(jī)運(yùn)行的距離，運(yùn)行的時(shí)間，工作頻率。微處理器89C52配合ispLSI1032完成按鍵的采集，將按鍵輸入的數(shù)據(jù)進(jìn)行處理運(yùn)算，控制步進(jìn)電機(jī)驅(qū)動(dòng)器SH_2H042Ma使電機(jī)按預(yù)設(shè)值轉(zhuǎn)動(dòng)。    3.2  機(jī)械單元    機(jī)械部分執(zhí)行的功能就是在水平方向上進(jìn)行拉伸或壓縮運(yùn)動(dòng)，舊儀器是通過三相步進(jìn)電機(jī)先產(chǎn)生旋轉(zhuǎn)運(yùn)動(dòng)

9、，再通過相關(guān)的機(jī)械結(jié)構(gòu)將旋轉(zhuǎn)運(yùn)動(dòng)轉(zhuǎn)變?yōu)橹本€運(yùn)動(dòng)。而新裝置直接采用直線步進(jìn)電機(jī)，再通過滾珠絲杠和直線導(dǎo)軌就可以實(shí)現(xiàn)水平方向上的運(yùn)動(dòng)。因此與舊儀器相比，新裝置的機(jī)械結(jié)構(gòu)更為簡單，體積明顯減小，同時(shí)機(jī)械可控精度更高。新裝置機(jī)械原理為：直線步進(jìn)電機(jī)通過連軸器與滾珠絲杠相連，在微處理器的控制下帶動(dòng)滾珠絲杠連同導(dǎo)軌產(chǎn)生周期性位移運(yùn)動(dòng)；位于培養(yǎng)瓶內(nèi)的支架材料，一端固定在固定夾具上，另一端固定在活動(dòng)夾具上，活動(dòng)夾具通過限位插銷與導(dǎo)軌相連，則支架材料隨著導(dǎo)軌的運(yùn)動(dòng)產(chǎn)生動(dòng)態(tài)應(yīng)變。     11-02-08 17:00:00     編

10、輯：studa20    3.3  細(xì)胞培養(yǎng)單元    相比舊儀器而言，這部分的改進(jìn)是最多的。    (1)細(xì)胞培養(yǎng)皿用聚四氟乙烯材料制作而成，取代原有的玻璃培養(yǎng)瓶，這種材料有優(yōu)良的綜合性能，耐高低溫，耐腐蝕，不粘，自潤滑，易清洗，適于細(xì)胞培養(yǎng)。    (2)原有的夾具全部由聚四氟乙烯材料制作而成，但由于聚四氟乙烯強(qiáng)度不高，因此長時(shí)間使用，夾具易變形；新設(shè)計(jì)的夾具由聚四氟乙烯（夾具下半部分）和不銹鋼（夾具上半部分）組成，通過不銹鋼釘將上、下部分固定，因此新夾具的強(qiáng)度

11、和使用壽命都有所增強(qiáng)。    (3)夾具中間新增了一個(gè)活動(dòng)壓塊，由聚四氟乙烯制成，通過一個(gè)不銹鋼調(diào)節(jié)螺釘調(diào)節(jié)其上下運(yùn)動(dòng)，便于更好地夾緊支架材料。    (4)新設(shè)計(jì)的培養(yǎng)瓶前后側(cè)分別開一個(gè)孔用于放置生物膜，阻斷細(xì)菌的進(jìn)入同時(shí)又使密封的培養(yǎng)瓶保持通透性。    4  討論    用細(xì)胞動(dòng)態(tài)培養(yǎng)取代傳統(tǒng)的靜態(tài)培養(yǎng)方法已成為組織工程領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)，實(shí)現(xiàn)這一轉(zhuǎn)變所需的工具就是體外細(xì)胞加載裝置。張延芳等人9用自制的旋轉(zhuǎn)生物反應(yīng)器提供微重力和低剪應(yīng)力環(huán)境，掃描電鏡結(jié)果顯示，在反

12、應(yīng)器內(nèi)培養(yǎng)的細(xì)胞生長速度、數(shù)量和形態(tài)明顯優(yōu)于24孔板靜態(tài)培養(yǎng)。李宏等10在構(gòu)建組織工程肌腱的實(shí)驗(yàn)中，用生物反應(yīng)器對細(xì)胞-材料復(fù)合物進(jìn)行動(dòng)態(tài)培養(yǎng)，結(jié)果表明恒定交變應(yīng)力作用下培養(yǎng)的肌腱具有一定的組織結(jié)構(gòu)和機(jī)械強(qiáng)度，明顯優(yōu)于靜態(tài)培養(yǎng)的肌腱組織。應(yīng)力應(yīng)變因素影響著組織的力學(xué)特性，因此，研究應(yīng)變條件下的三維細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)具有重要的意義。    本研究所介紹的加載裝置綜合考慮上述生物反應(yīng)器的優(yōu)點(diǎn)，在原有自行研制的動(dòng)態(tài)細(xì)胞加載裝置的基礎(chǔ)上做了進(jìn)一步的改進(jìn)，本裝置（1）使用范圍廣，可產(chǎn)生伸長、壓縮、既伸長又壓縮三種應(yīng)變方式；（2）可控應(yīng)變范圍大、控制精度更高，裝置運(yùn)行位移可在40

13、mm范圍內(nèi)連續(xù)可調(diào)，可精確到0.01 mm，應(yīng)變頻率可在5 Hz范圍內(nèi)連續(xù)可調(diào)；（3）操作可靠性、安全性高，不易發(fā)生污染；（4）操作界面更人性化，應(yīng)變頻率、應(yīng)變作用時(shí)間等參數(shù)均可以由微機(jī)鍵盤隨意設(shè)置。本裝置將為組織工程體外構(gòu)建新型人工活性組織替代物的研究提供一種結(jié)構(gòu)簡單、使用方便的實(shí)驗(yàn)裝置，目前此裝置正用于實(shí)驗(yàn)室組織工程研究中?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】  1李德強(qiáng)，戴冠戎. 生物反應(yīng)器在組織工程中的應(yīng)用進(jìn)展J. 國際骨科學(xué)雜志，2008，29（1）：8-10.2秦廷武，楊志明，解慧琪，等. 動(dòng)態(tài)應(yīng)變下肌腱細(xì)胞三維培養(yǎng)的初步研究J. 四川大學(xué)學(xué)報(bào)（醫(yī)學(xué)版），2002，33（1）：1-4.3宋關(guān)斌，

14、汪露，申曉東，等. 機(jī)械拉伸刺激對大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖的調(diào)節(jié)J. 醫(yī)用生物力學(xué)，2007，22（1）：15-20.4邱濤，王曉燕，王，等. 旋轉(zhuǎn)生物反應(yīng)器及微載體技術(shù)：組織工程種子細(xì)胞大規(guī)模擴(kuò)增的新方法J. 中華整形外科雜志，2006，22（2）：149-151.5韓雪峰，李健寧，楊大平，等. 組織工程軟骨實(shí)驗(yàn)生物反應(yīng)器的設(shè)計(jì)J. 中國美容醫(yī)學(xué)，2007，16（10）：1328-1330.6唐林，林珠，李永明. 機(jī)械牽張力對成骨細(xì)胞堿性磷酸酶及骨鈣蛋白的影響J. 臨床口腔醫(yī)學(xué)雜志，2005，21（11）：648-650.7鮮成玉，王遠(yuǎn)亮，唐麗靈，等. 大鼠成骨細(xì)胞對動(dòng)態(tài)拉伸刺激的生理響應(yīng)J

15、. 北京生物醫(yī)學(xué)工程，2006，25（3）：277-279.8秦廷武，楊志明，夏興仲. 智能化動(dòng)態(tài)應(yīng)變?nèi)S細(xì)胞培養(yǎng)裝置的研制J. 中國醫(yī)療器械雜志，2000，24（4）：187-190.9張延芳，陳槐卿，黃華，等. 旋轉(zhuǎn)生物反應(yīng)器的力學(xué)環(huán)境及其對細(xì)胞生長的影響J. 生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)雜志，2006，23（2）：400-404.10李宏，魏嫻，劉偉，等. 生物反應(yīng)器的設(shè)計(jì)與組織工程肌腱的構(gòu)建J. 醫(yī)用生物力學(xué)，2006，21（2）：115-119.     11-02-08 17:00:00     編輯：studa20

16、    3.3  細(xì)胞培養(yǎng)單元    相比舊儀器而言，這部分的改進(jìn)是最多的。    (1)細(xì)胞培養(yǎng)皿用聚四氟乙烯材料制作而成，取代原有的玻璃培養(yǎng)瓶，這種材料有優(yōu)良的綜合性能，耐高低溫，耐腐蝕，不粘，自潤滑，易清洗，適于細(xì)胞培養(yǎng)。    (2)原有的夾具全部由聚四氟乙烯材料制作而成，但由于聚四氟乙烯強(qiáng)度不高，因此長時(shí)間使用，夾具易變形；新設(shè)計(jì)的夾具由聚四氟乙烯（夾具下半部分）和不銹鋼（夾具上半部分）組成，通過不銹鋼釘將上、下部分固定，因此新夾具的強(qiáng)度和使用壽命都有所增

17、強(qiáng)。    (3)夾具中間新增了一個(gè)活動(dòng)壓塊，由聚四氟乙烯制成，通過一個(gè)不銹鋼調(diào)節(jié)螺釘調(diào)節(jié)其上下運(yùn)動(dòng)，便于更好地夾緊支架材料。    (4)新設(shè)計(jì)的培養(yǎng)瓶前后側(cè)分別開一個(gè)孔用于放置生物膜，阻斷細(xì)菌的進(jìn)入同時(shí)又使密封的培養(yǎng)瓶保持通透性。    4  討論    用細(xì)胞動(dòng)態(tài)培養(yǎng)取代傳統(tǒng)的靜態(tài)培養(yǎng)方法已成為組織工程領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)，實(shí)現(xiàn)這一轉(zhuǎn)變所需的工具就是體外細(xì)胞加載裝置。張延芳等人9用自制的旋轉(zhuǎn)生物反應(yīng)器提供微重力和低剪應(yīng)力環(huán)境，掃描電鏡結(jié)果顯示，在反應(yīng)器內(nèi)培養(yǎng)的細(xì)胞生

18、長速度、數(shù)量和形態(tài)明顯優(yōu)于24孔板靜態(tài)培養(yǎng)。李宏等10在構(gòu)建組織工程肌腱的實(shí)驗(yàn)中，用生物反應(yīng)器對細(xì)胞-材料復(fù)合物進(jìn)行動(dòng)態(tài)培養(yǎng)，結(jié)果表明恒定交變應(yīng)力作用下培養(yǎng)的肌腱具有一定的組織結(jié)構(gòu)和機(jī)械強(qiáng)度，明顯優(yōu)于靜態(tài)培養(yǎng)的肌腱組織。應(yīng)力應(yīng)變因素影響著組織的力學(xué)特性，因此，研究應(yīng)變條件下的三維細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)具有重要的意義。    本研究所介紹的加載裝置綜合考慮上述生物反應(yīng)器的優(yōu)點(diǎn)，在原有自行研制的動(dòng)態(tài)細(xì)胞加載裝置的基礎(chǔ)上做了進(jìn)一步的改進(jìn)，本裝置（1）使用范圍廣，可產(chǎn)生伸長、壓縮、既伸長又壓縮三種應(yīng)變方式；（2）可控應(yīng)變范圍大、控制精度更高，裝置運(yùn)行位移可在40 mm范圍內(nèi)連續(xù)可調(diào)，可精確到0.01 mm，應(yīng)變頻率可在5 Hz范圍內(nèi)連續(xù)可調(diào)；（3）操作可靠性、安全性高，不易發(fā)生污染；（4）操作界面更人性化，應(yīng)變頻率、應(yīng)變作用時(shí)間等參數(shù)均可以由微機(jī)鍵盤隨意設(shè)置。本裝置將為組織工程體外構(gòu)建新型人工活性組織替代物的研究提供一種結(jié)構(gòu)簡單、使用方便的實(shí)驗(yàn)裝置，目前此裝置正用于實(shí)驗(yàn)室組織工程研究中?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】  1李德強(qiáng)，戴冠戎. 生物反應(yīng)器在組織工程中的應(yīng)用