[農(nóng)學]第二章 植物組織培養(yǎng)的培養(yǎng)條件

1、第二章第二章 植物組織培養(yǎng)的條件植物組織培養(yǎng)的條件Genotype Environment Physiology Phenotype第一節(jié)第一節(jié) 植物組織培養(yǎng)的條件植物組織培養(yǎng)的條件1. 植物組織培養(yǎng)最基本的前提條件：用于培養(yǎng)的外植體細胞必須具有全能性2.離體隔離3.適宜的培養(yǎng)條件 環(huán)境條件：光照、溫度、濕度。 營養(yǎng)條件：培養(yǎng)基。一、環(huán)境條件一、環(huán)境條件 植物組織培養(yǎng)在最適宜的溫度下生長分化才能表現(xiàn)良好，大多數(shù)植物組織培養(yǎng)都是在23-27 之間進行，一般采用25土2。溫度溫度 組織培養(yǎng)中光照也是重要的條件之一，主要表現(xiàn)在光強、光質(zhì)、以及光照時間方面：一般來說，光照強度較強，幼苗生長的粗壯，而光

2、照強度較弱幼苗容易徒長。一般光照強度為10005000 lx光周期，最常用的周期是16h的光照，8h的黑暗。 光質(zhì)，對愈傷組織誘導，培養(yǎng)組織的增殖以及器官的分化都有明顯的影響。光照光照Light x hormone responses:In vitro rooting of Prunus insititaLight Colour+NAA- NAAWhite100 81Far Red 93 10Red100100Blue 36 71Darkness100 5(From Rossi et al., 1993) 濕度的影響包括培養(yǎng)容器保持和環(huán)境的濕度條件，容器內(nèi)濕度要保持在99%左右，環(huán)境的相對濕度

3、一一般要求般要求70-80的相對的相對濕度。濕度。濕度濕度其它因素其它因素滲透壓滲透壓 培養(yǎng)基中由于有添加的鹽類、蔗糖等化合物，因此，而影響到滲透壓的變化。通常1-2個大氣壓對植物生長有促進作用，2個大氣壓以上就對植物生長有阻礙作用， 而5-6個大氣壓植物 生長就會完全停止， 6個大氣壓以上植物 細胞就不能生存。其它因素其它因素通氣狀況通氣狀況 氧氣是組織培養(yǎng)中必需的因素，瓶蓋封閉時要考慮通氣問題，可用附有濾氣膜的封口材料。固體培養(yǎng)基可加進活性炭來增加通氣度固體培養(yǎng)基可加進活性炭來增加通氣度,以利于發(fā)根。以利于發(fā)根。液體培養(yǎng)時，可考慮采取振蕩培養(yǎng)的方式，以增加通氣性。液體培養(yǎng)時，可考慮采取振蕩

4、培養(yǎng)的方式，以增加通氣性。二、營養(yǎng)條件二、營養(yǎng)條件培養(yǎng)基培養(yǎng)基培養(yǎng)基：是離體培養(yǎng)的組織或者細胞賴以生存的營養(yǎng)基質(zhì)，是為離體培養(yǎng)材料提供的近似于生物體內(nèi)生存的營養(yǎng)環(huán)境，滿足其正常生長和維持其完整結(jié)構(gòu)及功能。 無機鹽類：大量元素：C、H、O、N、P、K、S、Ca、Mg 微量元素：Mo、Co 、Mn、Cu、Zn、Fe等 有機營養(yǎng)：碳源：蔗糖、葡萄糖、果糖 氮源：氨基酸類、酰胺類 活性物質(zhì)：維生素類、肌醇、生物素等 生長調(diào)節(jié)物質(zhì)： 生長素類：IAA、NAA、IBA等 細胞分裂素類：激動素、玉米素等 其它類：赤霉素、脫落酸、乙烯 固化劑： 瓊脂、明膠、卡拉膠等培養(yǎng)基的組成培養(yǎng)基的組成 元素名稱元素名稱

5、添加形式添加形式 N KNO3,NH4NO3大量元素大量元素 P KH2PO4 , NaH2PO4KKCl, KNO3 , Ca CaCl2 2H2O, Ca(NO3)2 4H20或100mg/l) Mg Mg2SO4 7H2O S Mg2SO4 7H2O, Na2SO4 微量元素微量元素 Fe Fe-EDTA(Na2- EDTA+FeSO4 7H2O ) B H3BO3 Mn MnSO4 7H2O() Cu CuSO4 Mo Na2MoO4 2H2O Zn ZnSO4 7H2O I KI Co CoCl3Murashige and Skoog stock solutions (MS Medi

6、um ) Macro elements Micro elements (0.5mmol/L) (0.5mmol/L) (0.5mmol/L)MgSO4.7H2O 0.37 g/L KI 0.83 mg/LNH4NO3 1.65 g/L H3BO3 6.2 mg/LKNO3 1.9 g/L MnSO4.4H2O 22.3 mg/LCaCl2 0.33 g/L ZnSO4.7H20 8.6 mg/LKH2PO4 0.17 g/L Na2MoO4.2H2O 0.25 mg/L CuSO4.5H2O 0.025 mg/L CoCl2.6H2O 0.025 mg/L Na2.EDTA 37.3 g/L

7、FeSO4.7H2O 27.8 mg/L一、一、母液的配制與保存母液的配制與保存培養(yǎng)基母液：培養(yǎng)基各類溶液的濃縮液。一、一、母液的配制與保存母液的配制與保存 培養(yǎng)基母液：配制母液不但可以保證各物質(zhì)成分的準確性及配制時的快速移取。一般母液配成比所需濃度高。 常將大量元素、微量元素、鐵鹽、有機物類和激素類分別配制成比培養(yǎng)基濃度高10-100倍的母液，低溫保藏。一、一、母液的配制母液的配制(以MS為例) (一一)母液配制母液配制要求：要求： 1.母液濃縮倍數(shù)：大量元素母液濃縮倍數(shù)：大量元素10 ;微量元微量元素素10、鐵鹽、鐵鹽100;有機物有機物50100 . 2.選用蒸餾水、重蒸餾水、分析純或化

8、學選用蒸餾水、重蒸餾水、分析純或化學純試劑純試劑 3.防止沉淀防止沉淀 4.激素母液配制激素母液配制 混配法配制母液：配制母液時為減少工作量，將幾種藥品配在同一母液中。 通常大量元素、微量元素、有機物均可采用混配方法配成濃縮一定倍數(shù)的母液。collecting the ingredients無機鹽L培養(yǎng)基中用量(mg)稱取量（g）定容體積KNO3190019分別溶解后混合定容至1000 ml。NH4NO3165016.5MgSO47H2O3703.70KH2PO41701.70CaCl22H2O4404.40大量元素母液（擴大10倍） 注意：為避免發(fā)生沉淀，應注意各種化合物的組合以及加入的先后

9、順序。 母液的濃度可用a ml/L表示，其意義為：配制1升培養(yǎng)基吸取該母液a毫升。Murashige and Skoog (MS） MediumMgSO4.7H2O 0.37 g/L KI 0.83 mg/LNH4NO3 1.65 g/L H3BO3 6.2 mg/LKNO3 1.9 g/L MnSO4.4H2O 22.3 mg/LCaCl2 0.33 g/L ZnSO4.7H20 8.6 mg/LKH2PO4 0.17 g/L Na2MoO4.2H2O 0.25 mg/L CuSO4.5H2O 0.025 mg/L甘氨酸 2mg/L CoCl2.6H2O 0.025 mg/L鹽酸硫胺素（VB

10、1）鹽酸吡哆醇（VB6） Na2.EDTA 37.3 g/L 煙酸 0.5 mg/L FeSO4.7H2O 27.8 mg/L肌醇 100mg/L 鐵鹽的配法: Fe2+在培養(yǎng)基中不穩(wěn)定，故要用螯合劑Na2EDTA來配制，配制方法如下： 在裝有400 ml蒸餾水的燒杯中加入2?？列遭c，溶解后加入3.73g Na2 EDTA, 加熱使其全部溶解，然后邊攪拌，邊慢慢加入2.78g FeSO47H2O直至全部溶解,冷卻后定容至1000 ml（濃度10 ml/L)，倒入棕色試劑瓶棕色試劑瓶中，置于冰箱中冷藏，保存?zhèn)溆?單配法配制母液：對于激素類等針對不同單配法配制母液：對于激素類等針對不同培養(yǎng)物需要調(diào)

11、節(jié)用量的物質(zhì)可配成單一化培養(yǎng)物需要調(diào)節(jié)用量的物質(zhì)可配成單一化合物的母液。合物的母液。 這種母液的濃度一般用這種母液的濃度一般用a mg/ml。 其意義為：其意義為：每毫升母液中含有每毫升母液中含有a毫克溶質(zhì)。毫克溶質(zhì)。 某種激素母液濃度為某種激素母液濃度為 mg/ml，如果要配制，如果要配制該激素為該激素為0.5 mg/l的的MS培養(yǎng)基培養(yǎng)基1L，則應吸，則應吸取該激素母液取該激素母液 ml。 激素母液的配制: 激素類物質(zhì)一般都難溶于水,在溶解時要借助其它溶劑使其能溶于水中. 細胞分裂素類一般先用少量1N鹽酸溶解后,再加入溫水冷卻后定容 生長素類一般先用少量1N NaOH或酒精溶解后,再加入一

12、定量的溫水,冷卻后定容 。 配制好的各種母液應分別貼上標簽，寫明母液名稱、配制1L培養(yǎng)時的取用量、配制日期等，置于冰箱中冷藏保存。 培養(yǎng)基中的其它成分如瓊脂（7g/L)、蔗糖(3%)等無需配成母液，在培養(yǎng)基配制時直接加入。二、培養(yǎng)基的配制二、培養(yǎng)基的配制正確的培養(yǎng)基配制順序（主要步驟）： 在燒杯中加入一定量一定量的水依次加入各類母液加入蔗糖并充分溶解定容調(diào)pH值（加瓊脂）分裝封囗滅菌 filling the vesselsautoclaving 如何配制如何配制1L的的MS + 30g/L蔗糖蔗糖 + 2mg/L 6-BA + NAA + 玉米素玉米素 + 8g/L 瓊脂培養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基基,并分裝在并分裝在20個個100mL三三角燒瓶中角燒瓶中?Stock solutionMS大量大量 10MS微量微量 100MS有機有機 1006-BA 1mg/mL玉米素玉米素 0.1 mg/mL請你實踐：請你實踐：錄相:植物的組織培養(yǎng)及其應用pHpH值值 組織培養(yǎng)最適pH是多少？如果pH值過高或過低會有什么后果?如何調(diào)節(jié)？不同植物的最適p值種 類最適pH值種 類最適pH值杜 鵑4.0月 季5.8越 桔4.5胡蘿卜6.0蠶 豆5.5石刁柏7.0番茄、葡萄5.7桃