IN1以及聯(lián)合NT3對(duì)大鼠脊髓損傷后NF表達(dá)變化的影響及意義

1、IN-1以及聯(lián)合NT-3對(duì)大鼠脊髓損傷后NF表達(dá)變化的影響及意義【摘要】 目的 探討大鼠脊髓損傷后給予髓磷脂相關(guān)生長阻逆蛋白抗體(IN-1)以及和神經(jīng)營養(yǎng)素3(NT-3)聯(lián)合作用后神經(jīng)元中絲蛋白（neurofilaments, NF）的表達(dá)有無變化。方法 健康Sprague-Dawley（SD）大鼠18只，平均隨機(jī)分為損傷對(duì)照組、IN-1組及IN-1和NT-3聯(lián)合作用組。各組分別在術(shù)后28天取材行HE染色、免疫組化染色檢測NF表達(dá)的變化。結(jié)果 聯(lián)合組NF染色灰度值明顯小于其他兩組（P<0.05或P<0.01）。結(jié)論 IN-1及聯(lián)合應(yīng)用NT-3后可以促進(jìn)脊髓損傷后軸突

2、的再生，促進(jìn)運(yùn)動(dòng)功能的恢復(fù)。 【關(guān)鍵詞】 脊髓損傷 髓磷脂相關(guān)生長阻逆蛋白抗體 神經(jīng)營養(yǎng)因子3 神經(jīng)元中絲蛋白Abstract: Objective To observe the changes of neuro (NF) in rats with spinal cord injury after treated with myelin-associated growth inhibitor Nogo-A (IN-1) and in combination with neurotrophin3 (NT-3). Methods 18 healthy Sprague-Dawley (SD) rat

3、s were randomly allocated to injured control group, IN-1 group, IN-1 combined with NT-3 group. 28 days after operation, samples were collected each group. An HE staining and an immuno-histochemical staining were performed to observe the changes of NF. Results In IN-1 combined with NT-3 group, the gr

4、ay value of NF was lower than the other two groups (P<0.05 or P<0.01). Conclusion IN-1 and IN-1 combined with NT-3 results in increased regenerative sprouting and growth of lesioned spinal cord axons and enhanced rehabilitation of motor function. Key words: spinal cord injuries; myelin

5、-associated growth inhibitor Nogo-A; neurotrophin3; neurofilament脊髓損傷是世界性的醫(yī)學(xué)難題，國內(nèi)外學(xué)者進(jìn)行了大量的研究，試圖通過各種方法來減輕脊髓的損傷，促進(jìn)脊髓損傷的修復(fù)及神經(jīng)功能的恢復(fù)。目前研究較多的是通過一定的干預(yù)手段，觀察脊髓損傷的修復(fù)情況，而神經(jīng)元中絲蛋白（NF）可以從側(cè)面反映脊髓損傷后軸突再生的情況。本實(shí)驗(yàn)通過給予髓磷脂相關(guān)生長阻逆蛋白抗體（IN-1）及聯(lián)合應(yīng)用神經(jīng)營養(yǎng)素3（NT-3），觀察大鼠脊髓損傷后NF表達(dá)的變化，探討二者對(duì)脊髓損傷修復(fù)的影響。1 材料與方法1.1 主要試劑 NT-3購自美國Peprotech

6、EC公司，IN-1購自美國Santa公司，NF一抗、NF免疫組化試劑盒購自美國Sigma公司。1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 清潔型SD大鼠18只（由中南大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物部提供）,雌雄不限，體重250300g，隨機(jī)分為手術(shù)對(duì)照組(n=6)、IN-1組（n=6）及IN-1和NT-3聯(lián)合作用組(以下簡稱聯(lián)合組，n=6)。1.3 動(dòng)物模型的制作 所有動(dòng)物首先采用改良Yaksh法1，后正中切開大鼠頸背側(cè)皮膚，沿中線分離肌肉，暴露寰枕膜，用尖刀小心切開寰枕膜、硬脊膜和蛛網(wǎng)膜，直到有清亮腦脊液流出為止，然后將外徑0.61mm的PE-10聚乙烯導(dǎo)管經(jīng)枕骨大孔順行插入蛛網(wǎng)膜下腔6.06.5cm，達(dá)T8上緣水平，依次縫合軟

7、組織，將導(dǎo)管牢固固定在傷口周圍皮膚。所有動(dòng)物在麻醉清醒后飼養(yǎng)3天，確定無后肢功能障礙者納入實(shí)驗(yàn)組。參照Brosamle等2方法制作脊髓半橫斷模型，采用水合氯醛（0.3ml/100g）腹腔注射麻醉。用剪刀剪掉背發(fā)，取俯臥位，消毒鋪巾，以T8棘突為中心，做長約2cm的縱行切口，顯露T7至T9棘突和椎板，在手術(shù)顯微鏡下小心咬除T79棘突及椎板，剪開硬脊膜，在相當(dāng)于T8椎板水平用做好標(biāo)記的顯微剪刀剪斷脊髓的后2/3，深度為1.5mm，再用做好標(biāo)記的11號(hào)刀片的尖端部分在損傷的脊髓處來回劃動(dòng)次，以確?？煽康那懈?。其中手術(shù)對(duì)照組通過置管每天注入生理鹽水30l，而IN-1組每天用微量進(jìn)樣器注入IN-1 24

8、l(0.6g/l)，聯(lián)合組每天注入IN-1 24l(0.6g/l)和NT-3 3l(1g/l)。每天分為早、中、晚次注射，每次注射完畢后用10l生理鹽水沖管，以保證藥物進(jìn)入蛛網(wǎng)膜下腔，每組連續(xù)使用1周。術(shù)后人工擠壓膀胱排尿，每天3次，直至形成排尿反射。1.4 標(biāo)本的收集和處理 所有動(dòng)物均分別于術(shù)后28天用4多聚甲醛/0.1mol/L PBS經(jīng)左心室主動(dòng)脈灌注后取出脊髓組織，灌注液中固定12h左右，然后放入30蔗糖溶液中，待組織沉底在開放冰凍切片機(jī)上切片，厚度30m。1.5 NF免疫組化染色 NF200染色采用鏈親和素生物素（SABC）法，嚴(yán)格按照試劑盒說明操作（NF200一抗稀釋度為12000

9、），DAB顯色，脫水，封片，對(duì)照以0.02mol/L PBS代替一抗。光鏡下觀察，有棕黃色染色為陽性。1.6 圖像分析 NF免疫組化染色結(jié)果采用德國KONTRON IBAS 2.5全自動(dòng)圖像分析系統(tǒng)，在損傷的頭尾兩側(cè)，分別取10個(gè)視野，以切片的背景調(diào)整灰度，測定其灰度值，計(jì)算平均灰度值，作為該切片的灰度值。1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 計(jì)量數(shù)據(jù)用±s表示，對(duì)多組實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)組間是否存在顯著性差異，采用One-Way ANOVA分析；對(duì)兩組實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，采用獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)：=0.05。2 結(jié)果2.1 HE染色 損傷對(duì)照組斷端間硬膜相互靠攏，損傷區(qū)內(nèi)脊髓的正常結(jié)構(gòu)明顯破壞，中央管消失，有灶狀壞

10、死，灰質(zhì)中形成較大空腔，多數(shù)神經(jīng)細(xì)胞胞核溶解，壞死灶內(nèi)有炎性細(xì)胞浸潤；IN-1組脊髓結(jié)構(gòu)破壞較對(duì)照組明顯減輕，壞死面積減少，壞死灶內(nèi)有炎性細(xì)胞浸潤，神經(jīng)組織軟化灶形成，殘存的神經(jīng)組織內(nèi)可見少量殘存的神經(jīng)元，神經(jīng)纖維水腫；聯(lián)合組損傷區(qū)內(nèi)有細(xì)長的多級(jí)細(xì)胞，新生的軸突呈樹狀，伸向斷端間組織，周圍有炎性細(xì)胞浸潤（見圖1）。2.2 NF免疫組化染色 NF免疫組化染色切片上， NF免疫陽性染色呈棕褐色，在手術(shù)對(duì)照組可見少量染色陽性纖維，纖維細(xì)小，排列方向紊亂；IN-1組NF免疫組化染色可見大量染色陽性纖維，纖維較長，多呈縱向排列，損傷平面頭側(cè)可見少量彎曲、不連續(xù)的神經(jīng)纖維向瘢痕方向生長，有少量的纖維生長入

11、瘢痕組織內(nèi)；聯(lián)合組則可見更多的染色陽性纖維，在損傷平面頭側(cè)可見大量的再生神經(jīng)纖維，并有較多的纖維長入瘢痕組織內(nèi)（見圖2）。 三組動(dòng)物中NF免疫組化染色灰度值分析結(jié)果顯示，對(duì)照組與IN-1組及聯(lián)合組相比差異均有顯著性（P<0.05或P<0.01），聯(lián)合組與IN-1組相比，灰度值差異也有顯著性（P均<0.05），見表1。圖1 HE聯(lián)合組(×10)（略）圖2 NF聯(lián)合組尾側(cè)(SP×10)（略）表1 NF免疫組化灰度值（略）與對(duì)照組比較，a:t=2.69,c:t=2.64,P均<0.05,b:t=5.37,d:t=4.53,P

12、均<0.01;與IN-1組比較,e:t=2.31,f:t=2.24,P均<0.053 討論 NT又稱神經(jīng)營養(yǎng)因子家族3，是近幾年發(fā)現(xiàn)的對(duì)神經(jīng)元在胚胎期及成熟發(fā)育期存活和發(fā)育所必需的一些生長因子，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，對(duì)神經(jīng)營養(yǎng)因子家族有了越來越深入的研究。它由神經(jīng)元靶區(qū)組織分泌后通過軸漿逆行運(yùn)輸?shù)竭_(dá)神經(jīng)元或通過自分泌和旁分泌方式作用于神經(jīng)元，對(duì)神經(jīng)元的結(jié)構(gòu)和功能發(fā)揮作用。NT-3是神經(jīng)營養(yǎng)因子家族成員之一，其在神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育和分化過程中，在調(diào)節(jié)神經(jīng)元活動(dòng)及神經(jīng)損傷中以及在非神經(jīng)系統(tǒng)中都起重要的作用。成熟NT-3蛋白的分子量為13.5KD，在生理?xiàng)l件下主要以二

13、聚體的形式存在，通過與高親和力受體trkC結(jié)合來發(fā)揮作用。 Nogo為對(duì)神經(jīng)突再生起抑制作用的髓磷脂蛋白成分，IN-1為nogo的單克隆抗體，它的發(fā)現(xiàn)成為脊髓損傷修復(fù)的突破性進(jìn)展，為脊髓損傷的實(shí)驗(yàn)性治療提供了廣泛的前景。Schwab等4在脊髓損傷后大鼠腦內(nèi)植入能分泌IN-1的雜交瘤細(xì)胞，通過對(duì)脊髓皮質(zhì)脊髓束標(biāo)記發(fā)現(xiàn)，有少量皮質(zhì)脊髓束軸突能再生1cm左右，且下肢主動(dòng)活動(dòng)功能有部分恢復(fù)。 NF主要構(gòu)成神經(jīng)胞體尤其是神經(jīng)軸突的細(xì)胞骨架框架，是神經(jīng)元特異中間絲，由神經(jīng)絲蛋白構(gòu)成，對(duì)于維持細(xì)胞的特定形態(tài)及多種細(xì)胞的生理功能具有重要意義，并且在維護(hù)神經(jīng)元的功能和軸漿運(yùn)輸?shù)纫幌盗信c脊髓損傷修復(fù)相關(guān)的病理生理

14、變化中發(fā)揮著重要的作用5。根據(jù)其分子量的差別，分為3種：68KD、140KD、200KD。目前對(duì)正常神經(jīng)中絲特異結(jié)合的單克隆抗體有抗68KD和抗200KD兩種。68KD的神經(jīng)中絲存在于神經(jīng)細(xì)胞的胞體及軸突中，而200KD則存在于軸突中，在胞體中無分布，故在正常情況下只顯示軸突，胞體不著色。當(dāng)脊髓因軸突修復(fù)或神經(jīng)細(xì)胞功能改善時(shí)，胞體和軸突中開始合成并積聚大量的200KD的神經(jīng)中絲，這就在形態(tài)學(xué)基礎(chǔ)上反映了所染結(jié)構(gòu)的一個(gè)功能側(cè)面。當(dāng)脊髓損傷后，損傷區(qū)內(nèi)的神經(jīng)細(xì)胞受創(chuàng)傷及繼發(fā)因素的直接影響出現(xiàn)變性壞死、結(jié)構(gòu)破壞及細(xì)胞崩解，失去對(duì)創(chuàng)傷的反應(yīng)能力，而損傷區(qū)外的相鄰神經(jīng)元在創(chuàng)傷刺激及多種因素作用下，開始合

15、成及積存NF200，以適應(yīng)神經(jīng)再生的需要。有研究表明，脊髓不完全損傷后NF200陽性神經(jīng)元的數(shù)量及神經(jīng)元胞體和軸索著色的程度與后肢功能恢復(fù)情況密切相關(guān)6，表明NF200染色程度不僅能顯示脊髓損傷后神經(jīng)元的形態(tài)，也能反映其功能狀態(tài)。因此本實(shí)驗(yàn)采用抗200KD神經(jīng)中絲抗體特異性地顯示神經(jīng)軸突。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，對(duì)照組損傷的鄰近脊髓組織，NF染色呈陽性，纖維細(xì)小，排列方向紊亂，表明神經(jīng)纖維功能狀態(tài)不良；IN-1組損傷鄰近區(qū)域，可見大量免疫陽性纖維，纖維較長，多呈縱向排列，說明神經(jīng)纖維再生功能良好，以合成大量的NF200來適應(yīng)軸突再生的需要；而聯(lián)合組NF染色的灰度值與其他兩組相比差異有顯著性(P&

16、;lt;0.05或P<0.01)，從側(cè)面反映了本組軸突再生的能力和神經(jīng)的功能都明顯高于其他兩組。由此可見，IN-1以及聯(lián)合應(yīng)用NT-3都促進(jìn)了軸突的再生，促進(jìn)神經(jīng)功能的恢復(fù)?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】 1 Yaksh TL, Rudy TA. Chronic catheterization of the spinal subarachnoid space J. Physiol Behav,1976,17(6):1031-1036.2 Brosamle C, Huber AB, Fiedler M, et al. Regeneration of lesioned cortico-spinal tract fibers in the adult rat induced by a recombinant, humanized IN-1 antibody fragment J. J Neurosci,2000,20(21):8061-8068.3 郭家松.NT-3基因修飾施萬細(xì)胞與神經(jīng)干細(xì)胞聯(lián)合移植治療全橫斷性脊髓損傷的實(shí)驗(yàn)研究D.博士學(xué)位論文，廣州：中山大學(xué)，2003.4 Schwab ME, Brosamle C. Regeneration of lesioned corticospinal tract fibers in the adult rat spina