中期因子在急性髓系白血病患者的表達(dá)及臨床意義

1、中期因子在急性髓系白血病患者的表達(dá)及臨床意義 作者：楊琳，董作仁，潘崚，羅建民，徐世榮【摘要】 為了探討中期因子(midkine，MK)與急性髓系白血病(AML)患者預(yù)后的關(guān)系，本研究采用半定量RT-PCR方法檢測(cè)65例M患者與15例正常人骨髓單個(gè)核細(xì)胞(MNC) MK、bcl-2 mRNA的表達(dá)，并對(duì)20例AML患者和5例正常人采用Western blot檢測(cè)MNC中MK基因的表達(dá)。結(jié)果顯示：初治組、復(fù)發(fā)組和化療緩解組MK基因表達(dá)水平分別為0.331±0.436，0.374±0.463和0.067±0.190，正常人MK基因表達(dá)陰性；MK基因表達(dá)陽性與表達(dá)陰性患

2、者的首次完全緩解（CR）率分別為63.16%和93.55%（P=0.01），MK基因表達(dá)陽性患者的復(fù)發(fā)率（100%）明顯高于表達(dá)陰性者（40%）（P=0.019）；多藥耐藥組與藥物敏感組MK基因的表達(dá)率分別為57.69%和25.64%（P0.01）； MK與bcl-2基因表達(dá)呈正相關(guān)（r=0.556，P<0.001）。結(jié)論：AML患者白血病細(xì)胞可以產(chǎn)生MK，且MK陽性率的高低與AML病期相關(guān)，是影響AML患者近期預(yù)后的重要因素之一。MK可能通過上調(diào)bcl-2的表達(dá)抑制白血病細(xì)胞凋亡。 【關(guān)鍵詞】 急性髓系白血病Expression of Midkine in Patients w

3、ith Acute Myeloid Leukemia and Its SignificanceAbstract The study was aimed to investigate the expression of midkine (MK) in bone marrow mononuclear cells (BM MNC) from 65 acute myeloid leukemia patients and 15 normal controls. The method of RT-PCR was used to examine the expression of MK mRNA in BM

4、 MNC. Parts of samples were incubated for 24 hours and the gene expression of MK in the BM MNC was detected by means of Western blot. The results showed that the expression of MK of BM MNCs in 50 newly diagnosed AML patients (0.331±0.436) and 15 AML patients in relapse （0.374±0.463）were ma

5、rkedly higher than that in 15 CR cases (0.067±0.190)，and 15 normal controls（0），respectively. The complete remission in MK positive patients （63.16%）was significantly lower than that in MK negative group（93.55%）. The patients with positive MK expression had a higher relapse rate than those with

6、negative MK expression. The positive rate of MK gene expression in drug-resistant patients and drug-sensitive patients were 57.69% and 25.64% respectively and there was positive correlation between the gene expressions of MK and bcl-2 （P0.01） (r=0.0556，P<0.001). It is concluded that MK can be

7、 secreted by AML cells and involved in drug-resistent，its positive expression may be associa-ted with the poor prognosis in newly diagnosed AML patients. The inhibitory effect of MK on apoptosis of leukemic cells is induced by upregulating bcl-2 expression.Key words acute myeloid leukemia； midkine；

8、prognosis中期因子(midkine，MK)基因是近年來新發(fā)現(xiàn)的肝素結(jié)合性生長(zhǎng)因子，其多種生物學(xué)活性與癌有關(guān)。近幾年國(guó)外研究報(bào)道，MK在多種人類腫瘤組織中高表達(dá)，并參與腫瘤發(fā)病過程1-3。在髓系白血病細(xì)胞株中發(fā)現(xiàn)MK的異常表達(dá)，它可能參與白血病的發(fā)生、發(fā)展4。對(duì)AML患者表達(dá)情況的臨床研究目前尚未有報(bào)道。我們分別應(yīng)用RT-PCR和Western blot 檢測(cè)了初治組、化療完全緩解組、復(fù)發(fā)組AML患者M(jìn)K基因與蛋白表達(dá)水平的變化，探討MK表達(dá)與AML的近期預(yù)后和細(xì)胞凋亡的關(guān)系，推斷其在AML發(fā)病中的可能作用。材料和方法病例65 例 AML 患者包括 50 例初治患者，15 例復(fù)發(fā)患者，1

9、5 例健康志愿者作為正常對(duì)照。 患者均符合FAB診斷標(biāo)準(zhǔn)5，其中M1 1例、M2 12例、M3 19例、M4 15例、M5 17例、M6 1例。男36例，女29例，中位年齡為32（14-64）歲。15例健康志愿者中男9例，女6例，中位年齡35（18-55）歲。髓系細(xì)胞株K562、HL-60由中國(guó)協(xié)和醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所細(xì)胞中心提供。逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）應(yīng)用TRIzoL提取BMMNC的總RNA，然后逆轉(zhuǎn)錄成cDNA并進(jìn)行PCR擴(kuò)增。MK上游引物：5-CCA GGCTTGGCGTCTAGT-3，下游引物：5-ATGCAGCACCGAGGCTTCCT-3，擴(kuò)增產(chǎn)物445 bp。bc

10、l-2的上游引物：5-CAACATCACCTATTGGATCC-3，下游引物：5-CGGGTGTAGAGTCTCTCGCT-3，擴(kuò)增產(chǎn)物318 bp。由對(duì)照GAPDH的上游引物：5-CGGAGTCAACGGATTTGGTCGATA-3，下游引物：5-AGCCTTCTCCATGGTTGGTGAACAC-3，擴(kuò)增產(chǎn)物374 bp。擴(kuò)增條件：對(duì)MK，94變性45秒，60退火1分鐘，72延伸2分鐘，35個(gè)循環(huán)；對(duì)bcl-2，94變性60秒，61退火50秒，72延伸50秒，30個(gè)循環(huán)。對(duì)GAPDH，94變性40秒，55退火60秒，72延伸60秒，20個(gè)循環(huán)。取4 l擴(kuò)增產(chǎn)物，同時(shí)加入4 l GAPDH

11、擴(kuò)增產(chǎn)物，經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳（含溴化乙啶），90 V，45分鐘，Eagle Eye讀膠儀掃描定量，以MK/GAPDH、bcl-2/GAPDH的比值作為其mRNA相對(duì)表達(dá)水平。細(xì)胞孵育隨機(jī)選取20例急性髓系白血病患者（包括復(fù)發(fā)患者2例，緩解期患者2例），5例正常人，分別無菌抽取骨髓5 ml，無菌條件下以淋巴細(xì)胞分離液（密度1.077）分離單個(gè)核細(xì)胞，用RPMI 1640培養(yǎng)液洗2遍，以5×106/ml的接種密度將細(xì)胞接種于RPMI 1640培養(yǎng)液中（無血清），于細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育24小時(shí)（孵育條件：溫度37，CO2 5%）。孵育后1 200×g離心5分鐘分離細(xì)胞和培養(yǎng)液，

12、用部分細(xì)胞提取總RNA，用RT-PCR方法檢測(cè)MK mRNA（方法同前）；并取1×107細(xì)胞進(jìn)行裂解，成勻漿后取上清液（相當(dāng)于3 mg組織蛋白）用于Western blot分析。Western blot分析取15 l勻漿后的上清液與15 l上樣緩沖液充分混勻后進(jìn)行10% SDS-PAGE電泳，并轉(zhuǎn)印至PVDF膜上，膜用1% BSA和0.05% Tween 20封閉1.5小時(shí)，抗MK單克隆抗體（1100稀釋）4過夜，過氧化物酶標(biāo)記的羊抗小鼠IgG二抗孵育1小時(shí)，DAB顯色并照相。臨床耐藥標(biāo)準(zhǔn)4一線藥物誘導(dǎo)治療無效；第一次誘導(dǎo)緩解后6個(gè)月內(nèi)復(fù)發(fā)；第一次誘導(dǎo)緩解后6個(gè)月后復(fù)發(fā)再次誘導(dǎo)治療無

13、效；2次或2次以上復(fù)發(fā)者。按照該標(biāo)準(zhǔn)將65例患者分為多藥耐藥組和藥物敏感組，其中多藥耐藥組26例，藥物敏感組39例。臨床治療方案對(duì)初治AML（M3除外）患者采用DA方案（阿糖胞苷、柔紅霉素）化療誘導(dǎo)緩解。對(duì)復(fù)發(fā)AML患者分別采用AME（阿糖胞苷、米托蒽醌、足葉乙苷）、IA（阿糖胞苷、去甲氧柔紅霉素）等方案。M3患者采用全反式維甲酸（ATRA）或以ATRA為主，聯(lián)用小劑量DA、HA（阿糖胞苷、高三尖杉酯堿）方案誘導(dǎo)分化或ATRA加As2O3治療，復(fù)發(fā)M3者應(yīng)用As2O3治療或標(biāo)準(zhǔn)化療。統(tǒng)計(jì)學(xué)處理SPSS 10.0統(tǒng)計(jì)軟件分析處理，采用t檢驗(yàn)、 2檢驗(yàn)及四格表確切概率法。結(jié)果AML MK mRNA

14、表達(dá)及其與FAB分型的關(guān)系因M1、M6、M7病例數(shù)少或缺如，在方差分析時(shí)去除。本研究只分析了M2、M3、M4、M5 4種類型患者中MK的表達(dá)，應(yīng)用方差分析，P0.05，由此認(rèn)為4種類型患者M(jìn)K表達(dá)不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。正常人及AML患者M(jìn)K mRNA和蛋白的表達(dá)AML患者M(jìn)K基因的陽性表達(dá)率及平均表達(dá)水平見表1。同等擴(kuò)增條件下，15例正常人均未檢測(cè)到MK基因陽性表達(dá)。初治組、復(fù)發(fā)組MK基因表達(dá)率及表達(dá)水平明顯高于緩解組（P0.05）。初治組與復(fù)發(fā)組相比，無顯著性差異（P0.05）。所有MK蛋白與其mRNA表達(dá)相平行（圖1、2）。Table. Expression of MK mRNA in new

15、ly diagnosed AML，relapsed AML，AML-CR and normal control （略）MK表達(dá)與AML臨床療效的關(guān)系按MK表達(dá)情況將50例初治AML患者分成兩組，MK陽性組CR率為63.16%（12/19），MK陰性組CR率為93.54%（29/31），兩組差異有顯著性(P=0.010)，MK表達(dá)陰性組的化療療效比陽性組高；對(duì)其中35例CR患者進(jìn)行15個(gè)月的隨訪，隨訪終點(diǎn)為復(fù)發(fā)或死亡，其中5例MK陽性患者均在1年內(nèi)復(fù)發(fā)，30例MK陰性患者中有12例復(fù)發(fā)，其無病存活率為60%，兩組差異有顯著性（P=0.019）。將65例AML患者分為多藥耐藥組和藥物敏感組，多藥耐

16、藥組MK mRNA的表達(dá)率和平均表達(dá)水平明顯高于藥物敏感組 (P<0.01)。MK mRNA表達(dá)與 bcl-2之間的關(guān)系為研究MK與bcl-2的關(guān)系，我們對(duì)65例AML患者進(jìn)行bcl-2 mRNA水平檢測(cè)，采用直線相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)MK基因表達(dá)與bcl-2呈正相關(guān)（r=0.555，P0.05）。結(jié)果見圖3。肝素結(jié)合性生長(zhǎng)因子對(duì)于腫瘤形成有重要作用。MK是近年來發(fā)現(xiàn)的一種新的肝素結(jié)合生長(zhǎng)/分化因子家族成員之一，其結(jié)構(gòu)明顯不同于其它已知的生長(zhǎng)因子，但生物學(xué)活性類似FGF。在小鼠胚胎形成中期，MK mRNA高度表達(dá)于多種組織，成年后除腎臟繼續(xù)表達(dá)外，其他所有正常組織幾乎測(cè)不出MK mRNA表

17、達(dá)。有研究表明，MK在腫瘤形成和發(fā)展中起重要作用，它主要以自分泌方式促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)及腫瘤血管新生和內(nèi)皮細(xì)胞增殖6，7，并通過上調(diào)bcl-2表達(dá)抑制腫瘤細(xì)胞凋亡8。 急性髓系白血病是常見的血液系統(tǒng)惡性腫瘤，發(fā)病機(jī)制尚不明確。在髓系白血病細(xì)胞株中發(fā)現(xiàn)有MK異常表達(dá)，它可能參與了白血病的發(fā)生、發(fā)展過程4。對(duì)AML患者表達(dá)情況的臨床研究目前尚未有報(bào)道。我們分別采用RT-PCR和Western blot技術(shù)檢測(cè)了髓系白血病細(xì)胞株K562和HL-60中MK mRNA和蛋白水平的表達(dá)，結(jié)果與國(guó)外學(xué)者的研究報(bào)道一致4。在AML的病程中我們發(fā)現(xiàn)MK蛋白表達(dá)與其mRNA表達(dá)相平行；MK的表達(dá)在M2、M3、M4、

18、M5各亞型間無顯著性差異（P0.05）；MK表達(dá)與患者的治療期有關(guān)，初治組的MK mRNA表達(dá)率和表達(dá)水平高，緩解后MK mRNA表達(dá)率和表達(dá)水平降低或測(cè)不出，復(fù)發(fā)組的MK mRNA 表達(dá)率和表達(dá)水平再次升高，提示在AML患者中MK主要來源于白血病細(xì)胞，MK表達(dá)的變化參與了AML的病情進(jìn)展，對(duì)MK含量測(cè)定有助于判斷病情變化。AML-CR組的MK表達(dá)雖明顯低于初診AML組，但仍高于正常對(duì)照組，這是否與CR后仍殘存白血病細(xì)胞有關(guān)，有待于進(jìn)一步觀察研究。 MK水平高低與腫瘤預(yù)后密切相關(guān)9，10。我們發(fā)現(xiàn)白血病化療療效和預(yù)后與MK有一定關(guān)系。MK不表達(dá)或低水平表達(dá)者預(yù)后較好，MK高水平表達(dá)者緩解率低，

19、容易復(fù)發(fā)，預(yù)后差，5例MK陽性緩解患者在我們隨訪期間均復(fù)發(fā)。臨床耐藥組MK mRNA的表達(dá)率(57.69%)和平均表達(dá)水平(0.53) 明顯高于臨床敏感組MK mRNA的表達(dá)率(25.64%)和平均表達(dá)水平(0.215)(P<0.01)，這從一個(gè)側(cè)面反映AML化療耐藥現(xiàn)象與MK基因高表達(dá)有關(guān)。 研究發(fā)現(xiàn)，很多控制生長(zhǎng)發(fā)育的基因直接參與凋亡的調(diào)控。bcl-2是重要的凋亡抑制基因，能抑制多種因素引起的凋亡。在大多數(shù)的腫瘤和白血病細(xì)胞中該基因都高表達(dá)，其表達(dá)高低與細(xì)胞的耐藥性形成密切相關(guān)。已知白血病的形成和發(fā)展與bcl-2的表達(dá)密切相關(guān)，我們檢測(cè)了65例AML患者bcl-2基因的表達(dá)水

20、平，觀察到bcl-2 mRNA的平均表達(dá)水平明顯高于正常對(duì)照組，并用直線相關(guān)分析得出MK mRNA表達(dá)與bcl-2基因水平呈正相關(guān)，這說明MK可能是通過上調(diào)bcl-2表達(dá)、抑制白血病細(xì)胞凋亡、降低白血病細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性，使細(xì)胞產(chǎn)生多藥耐藥。深入研究MK在白血病中的作用將有助于我們更全面地了解白血病的發(fā)病機(jī)制?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】 1Tsutsui J，Kadomatsu K，Matsubara S，et al. A new family of heparin-binding growth differentiation factors: increased midkine expression

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22、arcinomas. Hepatogastroenterology，1999; 46: 3189-31964Kato H，Watanabe K，Murari M，et al. Midkine expression in Reed-Sternberg cells of Hodgkins disease. Leuk Lymphoma，2000; 37:415-4245楊天楹.急性非淋巴細(xì)胞白血病的形態(tài)學(xué)分型.見張之南，沈悌主編. 血液病診斷及療效標(biāo)準(zhǔn). 第二版. 北京: 科學(xué)出版社.1999:171-1736Ratovitski EA，Kotzbauer RT，Milbrandt J，et al. Midkine induces tumor cell proliferation and binds to a high affinity signal