lumine技術(shù)原理及應(yīng)用

1、Luminex 的基本原理及應(yīng)用傳統(tǒng)的蛋白質(zhì)分析主要采用雙抗體夾心 ELISA 法。此法長期以來被視為蛋白 質(zhì)定量分析的“標(biāo)準(zhǔn)方法”。 ELISA 可以用來準(zhǔn)確測定大批量生物樣品，但每次 實驗只能分析一個目標(biāo)分子，而不具備同時分析多種目標(biāo)分子的能力。在 ELISA 基礎(chǔ)上發(fā)展出的 luminex 技術(shù)，不僅同樣通過雙抗體選擇而具有高特異性，同 時也具有ELISA的高通量、操作簡便、測量準(zhǔn)確等優(yōu)點，而且可以在一次實驗中 完成對多種目標(biāo)分子的分析， 從而改變了過去的分析模式， 建立了更加高效快速 的分析平臺。Luminex技術(shù)原理，在近年發(fā)表的文章中已有過詳細(xì)的介紹和說明。 Luminex 技術(shù)應(yīng)

2、用微球和流式細(xì)胞儀的原理。 微球內(nèi)部含有三種熒光免疫熒光， 通過熒光不同的比例可以區(qū)分 500 種不同的微球。 每種微球可以用來檢測一種不 同的蛋白或基因。 因此，利用微球技術(shù)， 可以同時檢測高達(dá) 500 個蛋白或基因。 該技術(shù)利用熒光編碼的微球共價交聯(lián)單克隆抗體，與被測定的目標(biāo)分子結(jié)合后， 加入熒光素標(biāo)記的檢測抗體，再通過激光掃描熒光編碼來識別單個微球和測量 “檢測熒光”強(qiáng)度來確定被測分子的濃度。 在使用相同抗體對的條件下， luminex 技術(shù)的測量結(jié)果在準(zhǔn)確度、精確度、靈敏度方面與ELISA均可達(dá)到相似的水平。Lumi nex應(yīng)用的熒光編碼微球帶有針對不同目標(biāo)分子的特異性抗體，不同的微球

3、在一定程度上可以自由組合， 這樣在一次實驗中可以同時完成多個目標(biāo)分子的分 析。多目標(biāo)分子的同時測定可以大大減少生物樣品的消耗量， 節(jié)省成本和測定時 間，并且使多種目標(biāo)分子之間相關(guān)性的分析更加準(zhǔn)確。很多公司已經(jīng)開始提供 Luminex試劑盒，用于基礎(chǔ)和臨床醫(yī)學(xué)研究以及臨床檢測。目前，Luminex試劑盒已經(jīng)可以檢測 500 多種蛋白質(zhì)分子，包括細(xì)胞因子、激素、自身抗體、腫瘤標(biāo) 志物等。Luminex 常見問題及解答LUMINEX應(yīng)用于哪些領(lǐng)域 生物醫(yī)學(xué)研究，生物標(biāo)記物開發(fā)，臨床檢測等領(lǐng)域。 Luminex 技術(shù)主要用于蛋白 和核酸檢測分析。LUMINEX敏感性如何靈敏度取決于開頭的質(zhì)量。 對于同

4、樣的抗體對， Luminex 檢測的靈敏度高于 ELISA 技術(shù)。一般檢測靈敏度在 pg 級。對不同類型的樣品制備和樣品量的要求是怎樣的 血清、血漿是常用的樣本，每次檢測需要 10ul ， 每次可以檢測多個蛋白。 從各種細(xì)胞或組織中提取的蛋白也可以用 Luminex 技術(shù)檢測，制備方法與 ELISA、 Western Blot 完全一樣。一般可以檢測到多少基因或蛋白的表達(dá)信息 檢測蛋白和基因的數(shù)目主要取決于試劑盒。 蛋白質(zhì)檢測目前最高可以達(dá)到 50 個左右，基因檢測最高達(dá) 500 個。如何保證檢測結(jié)果的特異性 檢測的特異性取決于抗體高特異性。 試劑幾乎全部來源于美國大公司，產(chǎn)品經(jīng) 過了嚴(yán)格的質(zhì)

5、量控制。同時，我們檢測公司也有近 15 年的經(jīng)驗、嚴(yán)格的操作程 序和質(zhì)量控制體系?？蛻糇约禾峁┛贵w，是否可以進(jìn)行 LUMINEX僉測Luminex和ELISA檢測試劑都需要兩個配套的特異性抗體。我們公司具有開發(fā)Lumi nex試劑盒的經(jīng)驗。但是，需要一系列的開發(fā)工作才能保證結(jié)果的特異性、 重復(fù)性和可靠性。除了蛋白，LUMINEX技術(shù)是否還可以用于其它指標(biāo)的檢測可以用于基因表達(dá)，基因多態(tài)性和 HLA配型分析。檢測周期多久 視待測蛋白的種類、數(shù)量和標(biāo)本數(shù)量定。一般來說，檢測一組蛋白（ 1-50 個， 視蛋白種類定）和一組標(biāo)本（多達(dá) 360個標(biāo)）需要 3-4 小時的操作時間及基本數(shù) 據(jù)分析。但是，檢

6、測周期也取決于公司當(dāng)時的工作量。 一般來說， 從標(biāo)本收到起， 檢測應(yīng)在 1-2 周完成；但是部分蛋白試劑盒需要收到訂單后從美國進(jìn)口， 檢測周 期可能會延長到 4-5 周。如何判定LUMINEX數(shù)據(jù)表達(dá)水平差異有無意義 表達(dá)差異主要取決于標(biāo)本的性質(zhì)和數(shù)量， 我們公司為客戶提供專業(yè)的數(shù)據(jù)統(tǒng)計服 務(wù)。LUMINEX實驗和流式細(xì)胞儀的優(yōu)劣比較Luminex 技術(shù)是流式細(xì)胞儀和微球相結(jié)合的蛋白、核酸檢測技術(shù)，檢測對象是蛋白質(zhì)、DNA等大分子。普通流式細(xì)胞儀主要用于檢測整體細(xì)胞表面或細(xì)胞內(nèi)的 蛋白表達(dá)情況。Lumi nex檢測蛋白和標(biāo)本數(shù)目大，是一種高通量檢測技術(shù)。普通 流式細(xì)胞儀每次只能檢測幾種蛋白分子

7、， 而且檢測速度較慢，不適合高通量分析。 由此可見，兩種方法應(yīng)用方向有很大差別。報告的格式如何報告以 xcel 表格形式，包括每種蛋白在每個標(biāo)本中的表達(dá)量。公司也可以為客 戶提供數(shù)理統(tǒng)計分析結(jié)果。完成一個LUMINEX勺實驗,需要的細(xì)胞的量是多少至少 10ul 的血清、血漿，蛋白提取物， 或 50-100 萬細(xì)胞。如何控制LUMINEXi測的質(zhì)量我們對每一次檢測都設(shè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線， 并設(shè)定內(nèi)參進(jìn)行校正。 我們會定期做儀器校 正，檢測精密度和重復(fù)性實驗以確保檢測結(jié)果的可靠性。實驗失敗有幾種原因從實驗室角度看， 成敗原因包括試劑盒的質(zhì)量， 待測樣品稀釋倍數(shù)； 待測蛋白質(zhì) 低于儀器檢測底限，實驗操作程序

8、。從客戶角度看， 成敗取決于樣品制備， 保存和運輸是否恰當(dāng)。 我們公司可以提供 規(guī)范操作程序，供客戶參考。得到實驗的結(jié)果后 , 可以進(jìn)行那些研究的工作可進(jìn)行多方面的研究， 例如： 觀察不同實驗條件對待測蛋白含量的影響， 可進(jìn)行 藥物作用靶點研究，不同人群血樣生物標(biāo)記物的研究，健康評估，疾病診斷，指 導(dǎo)治療等。經(jīng)過分析后，若得到幾百個感興趣的基因或蛋白，如何對這些基因做功能分類 或者 Pathway 相關(guān)分析呢分析方法與其它技術(shù)平臺一樣，我們公司可以提供全套有償服務(wù)。如何考慮LUMINE）重復(fù)實驗的問題 我們每次都會對使用的標(biāo)準(zhǔn)品和內(nèi)參做重復(fù)性測定， 同時也建議對每份樣本進(jìn)行 重復(fù) 2 次測定。

9、在進(jìn)行LUMINE）實驗時，由于經(jīng)費的限制，是否可以把多個樣品進(jìn)行混合以消 除樣品的個體差異后再上LUMINEX僉測不建議這么做。 多個樣品做檢測， 計算平均值和誤差才有統(tǒng)計學(xué)意義。 如果多個 樣品混合后測定只能算 1 份樣品?？蛻羰墙M織的樣品，準(zhǔn)備自己提取樣品，請問樣品提取方面有沒什么技術(shù)要求 需要采用對抗原抗體反應(yīng)，或者蛋白質(zhì)抗原性沒有抑制作用的提取液進(jìn)行提取， 避免采用會造成蛋白質(zhì)變性的試劑，如高濃度的尿素或者鹽酸胍等。需要能完全提取待測蛋白質(zhì)，否則對結(jié)果會造成誤判。提取以后需要怎么保存，怎么運輸建議保存于-80度。避免反復(fù)凍融。可用干冰或者至少用冰袋運輸。LUMINEX勺假陽性率是多少

10、技術(shù)性的假陽性率非常低，小于1%生物假陽性率取決于每個蛋白的生物學(xué)特 征。可開展此項目的臨床科室有哪些目前我公司擁有的世界最先進(jìn)的高通量液相芯片檢測技術(shù)，在國內(nèi)僅有3臺是否可以將同一癥狀的病例混合后抽提，看共性表達(dá)可以?；旌虾蟮臉悠穼⒈灰曌鲉我粯悠愤M(jìn)行檢測。服務(wù)流程如何幫助客戶制定檢測方案一樣品檢測-結(jié)果分析一報告出具一可為客戶提供更深 層次的服務(wù)（實驗設(shè)計、數(shù)據(jù)分析、論文撰寫與發(fā)表）如何訂購您們的服務(wù)通過咨詢，協(xié)商檢測方案，然后付費或簽訂合同。LUMINEX蛋白檢測平臺服務(wù)項目、細(xì)胞因子、化學(xué)因子類:6Cki ne/CCL2BCA-1/CXCL13ENA-78/CXCL5中性粒細(xì)胞激Eota

11、xin 嗜酸細(xì)胞活化趨化CTACK/CCL2皮膚T細(xì)胞虜獲EGF表皮生長因子趨化因子Eotaxi n-2/CCL24/MPIF-2 嗜Eotaxi n-3/CCL26 嗜酸細(xì)胞活活蛋白-78因子酸細(xì)胞活化趨化因子-2化趨化因子-3FGF-2成纖維細(xì)胞生長因子Flt-3 liga nd FMS羊酪氨酸激Fractalkine 人神經(jīng) 趨化 因GCP2/CXCL6人中性粒細(xì)胞趨-2酶3配體子化蛋白2G-CSF粒系集落刺激因子GM-CSF粒-單系集落刺激因GROfe長相關(guān)基因蛋白HCC1/3/CCL14a/ B子I-309/CCL1IFN a2干擾素a2IFNy干擾素yIL-10白介素-10IL-1

12、1白介素-11IL-12 (p40)白介素-12IL-12 (p70)白介素-12IL-13白介素-13IL-15白介素-15IL-16白介素-16IL-17白介素-17IL-1ra 白介素-1raIL- 1a白介素1aIL- 1 B白介素-1 BIL-2白介素-2IL-20白介素-20IL-21白介素-21IL-23白介素-23IL-28a 白介素-28aIL-29白介素-29IL-3白介素-3IL-33/NF-HEV (mature)白介IL-4白介素-4IL-5白介素-5素-33IL-6白介素-6IL-7白介素-7IL-8白介素-8IL-9白介素-9IP-10干擾素誘導(dǎo)蛋白-10I-TA

13、C/CXCL11干擾素誘導(dǎo) TLIF白血病抑制因子Lymphotactin淋巴細(xì)胞趨化細(xì)胞趨化因子蛋白MCP-1(MCAF單核細(xì)胞趨化蛋MCP-2單核細(xì)胞趨化蛋白2MCP-3/CCL7單核細(xì)胞趨化蛋MCP-4單核細(xì)胞趨化蛋白4白1白3M-CSF巨噬細(xì)胞集落刺激因子MDC/CCL22巨噬細(xì)胞來源的MIG/CXCL9趨化因子9MIP-1D (MIP-5/CCL15)巨噬細(xì)趨化因子胞炎性蛋白-1DMIP-1a巨噬細(xì)胞炎性蛋白MIP-1B巨噬細(xì)胞炎性蛋白MIP-3B/CCL19巨噬細(xì)胞炎性MIP-3a/CCL20巨噬細(xì)胞炎性-1a-1B蛋白3B蛋白3aMMP -1基質(zhì)金屬蛋白酶-1MMP -2基質(zhì)金屬

14、蛋白酶-2MMP -3基質(zhì)金屬蛋白酶-3MMP -7基質(zhì)金屬蛋白酶-7MMP -9基質(zhì)金屬蛋白酶-9MMP -10基質(zhì)金屬蛋白酶-10MMP -12基質(zhì)金屬蛋白酶-12MMP -13基質(zhì)金屬蛋白酶-13NAP-2/CXCL7中性粒細(xì)胞趨化PDGF-AA血小板衍生生長因PDGF-AB/BB血小板衍生生長RANTE分泌趨化因子蛋白2子AA因子AB/BBSCD30可溶性CD30SCD40L可溶性 CD40LSCF干細(xì)胞因子SDF-1 a + B /CXCL12 基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1 a + BsEGFR可溶性表皮生長因子受體sgp130可溶性糖蛋白130SIL-1RI可溶性白細(xì)胞介素-1受體ISIL

15、-1RII可溶性白細(xì)胞介素-1受體IIsIL- 2Ra可溶性白細(xì)胞介素-2受體aSIL-4R 可溶性白細(xì)胞介素-4受體SIL-6R可溶性白細(xì)胞介素-6受體sRAGE可溶性晚期糖基化中產(chǎn)物受體sTNFRI可溶性腫瘤壞死因子受體IsTNF RII可溶性腫瘤壞死因子受體IIsVEGF R2可溶性血管內(nèi)皮生長因子受體2sVEGF R3可溶性血管內(nèi)皮生長因子受體3sVEGF RI可溶性血管內(nèi)皮生長因子受體ITARC/CCL17胸腺活化調(diào)節(jié)趨化因子TGFa轉(zhuǎn)化生長因子aTIMP-1組織金屬蛋白酶抑制劑-1TIMP-2組織金屬蛋白酶抑制劑-2TIMP-3組織金屬蛋白酶抑制劑-3TIMP-4組織金屬蛋白酶抑制

16、劑-4TNF%腫瘤壞死因子aTNFB腫瘤壞死因子BTPO甲狀腺過氧化物酶TRAIL/TNFSF10TSLP人胸腺基質(zhì)淋巴細(xì)胞生 產(chǎn)素VEGF血管內(nèi)皮生長因子、細(xì)胞信號通路類:Active Caspase 3活化半胱Active Cleaved PARP 活化切Akt/PKB (Ser473)磷酸化蛋Akt/PKB仃hr308)磷酸化蛋胺酸蛋白酶3割的多腺苷二磷酸多聚酶白激酶B白激酶BATF2仃hr69/71）活化復(fù)制因BAD (Ser112)CD3e (pan Tyr)c-Jun (Ser73)子2c-Kit (pan Tyr)Cleaved PARPc-Met/HGFR (pan Tyr)C

17、REB (Ser133)EGF Receptor (pan Tyr) 表皮Erb-B2/HER2 (pa n Tyr)第二ERK/MAPKinase1/2GAPDH生長因子受體人體表皮生長因子受體(Thr185/Tyr187)2A (Ser139)HSP27 (Ser 78)IGF1R (pan Tyr)胰島素樣生IRS1 (pan Tyr)長因子1受體I k B優(yōu)(Ser 32)JNK (T hr183/Tyr185)LAT (pan Tyr)Lck (pan Tyr)MEK1 (Ser222)MKK6 (Ser207/Thr211)MSK1 (Ser212)p21p38 (Thr180/T

18、yr182)p53 (Ser15)p53 (Ser46)p70 S6 Kin ase 仃 hr412)PDGF Receptor a (pan Tyr)Rsk1 (Ser380)STAT1 (Tyr701)STAT1 (Tyr707)STAT2 (Tyr690)STAT3 (Ser727)STAT3 (Tyr705)STAT5A/B 仃 yr694/699)STAT6 (Tyr641)Syk (pan Tyr)ZAP-70 (pan Tyr)三、神經(jīng)因子類:CortisolApo AlApo ClllApo EBDNFCathepsin D 組織蛋白酶 DComplement C3Comple

19、ment C4Complement Factor HC reactive protein (CRP) C-MelatoninMIP-4反應(yīng)蛋白MPONCAMNeurotensinOrexin AOxytocinPAI-1 (total)PDGF-AAPDGF-AB/BBPEDFPrealbuminRANTESSAPsICAM-1Substance PsVCAM-1al -Antitrypsina2-Macroglobulina -MSHB -Endorphin四、骨代謝因子類：RANKLAdiponectin 脂聯(lián)素IL- 1 BACTHIL-6InsulinLeptin瘦素Osteopont

20、in (OPN)骨橋蛋白OsteocalcinOsteoprotegerinPTHTNFa腫瘤壞死因子a五、皮膚生長調(diào)控因子:CortisolFibronectinHSAInvolucrinLPSKeratin-6Keratin - 1Keratin - 10六、凋亡及敗血癥因子：MIF巨噬細(xì)胞移動抑制因子PAI-1 仃 otal)sFassFasLslCAM-1sVCAM-1七、免疫球蛋白分型：IgAIgG1IgG2IgG3IgG4IgM八、腫瘤生物標(biāo)記物：CA-125癌抗原125IGF-II胰島素樣生長因子2Leptin瘦素MIF巨噬細(xì)胞移動抑制因子Osteopontin (OPN)骨橋蛋

21、白Prolact in泌乳刺激素MMP-1基質(zhì)金屬蛋白酶-1MMP-2基質(zhì)金屬蛋白酶-2MMP-9基質(zhì)金屬蛋白酶-9CA 15-3癌抗原檢測15-3Serum amyloid A 血清淀粉樣CA 19-9 癌抗原 19-9蛋白ATGa轉(zhuǎn)化生長因子aCathepsin D 組織蛋白酶 DTNFa腫瘤壞死因子aVEGF血管內(nèi)皮生長因子VEGFR2血管內(nèi)皮生長因子受B -2-MicroglobulinB -2 微CEA癌胚抗原C reactive protein (CRP) C-體2球蛋白反應(yīng)蛋白E-cadheri n 上皮型鈣黏附蛋EGFR表皮生長因子受體Eotaxin嗜酸細(xì)胞活化趨化ER- a雌

22、激素受體a白因子Fas(CD95 or Apo-1) 腫瘤壞Ferritin鐵蛋白Fibri no ge n纖維蛋白原AFP甲胎蛋白死因子受體超家族成員 6Follistatin卵泡素G-CSF集落刺激因子3Haptoglobin結(jié)合珠蛋白HER-2(erbB2)第二人體表皮生長因子受體ICAM-1細(xì)胞間粘附分子-1IGFBP-1胰島素樣生長因子結(jié)IGFBP-2胰島素樣生長因子結(jié)IGFBP-3胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白1合蛋白2合蛋白3Angiopoietin-2血管生成素2LH賴氨酸羥化酶MCP-1(MCAF單核細(xì)胞趨化蛋MIG/CXCL9趨化因子9白1tPSA總前列腺特異性抗原fPSA游離前

23、列腺特異性抗原NSE神經(jīng)元特異性烯醇化酶Free- B -hCG游離血清人絨毛膜促性腺激素EB antibody EB 病毒抗體HE4人附睪分泌蛋白4CA215癌抗原 215CA242癌抗原242CA724癌抗原724CA50癌抗原50Cyfra 21-1角蛋白19片段SCCA鱗狀細(xì)胞癌抗原九、內(nèi)分泌激素類：ACTHAGRPAmylin (Active or Total)BDNFCNTFC-PeptideFSHGHGLP-1 (Active)GlucagonIGF-1IGFBP-1胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白1IGFBP-2胰島素樣生長因子結(jié)IGFBP-3胰島素樣生長因子結(jié)IGFBP-4胰島素樣生長因子結(jié)IGFBP-5胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白2合蛋白3合蛋白4合蛋白5IGFBP-6IGFBP-7InsulinLeptinLH賴氨酸羥化酶Prolact in泌乳刺激素TSHGhrelin (Active)GIP 仃 ota