第七章親和層析技術(shù)

1、2022-3-31親和色譜親和色譜 利用生物分子間的利用生物分子間的特特異性結(jié)合作用異性結(jié)合作用的原理的原理進(jìn)行生物物質(zhì)分離純進(jìn)行生物物質(zhì)分離純化的技術(shù)稱為化的技術(shù)稱為親和純親和純化技術(shù)化技術(shù)（Affinity Affinity purificationpurification）12022-3-32 2技術(shù)要點(diǎn)技術(shù)要點(diǎn) （1）找與底物）找與底物專一專一可逆結(jié)合可逆結(jié)合的配基；的配基； （2）將配基通過）將配基通過共共價(jià)鍵價(jià)鍵偶聯(lián)到基質(zhì)；偶聯(lián)到基質(zhì)； （3）配基）配基與與底物底物吸吸附附； （4）洗脫目標(biāo)物。）洗脫目標(biāo)物。 2022-3-33 3親和純化技術(shù)親和純化技術(shù) 親和層析親和層析(Aff

2、inity chromatography) (Affinity chromatography) 親和過濾（膜分離）親和過濾（膜分離） 親和分配（雙水相萃?。┯H和分配（雙水相萃?。?親和反膠團(tuán)萃取（反膠團(tuán)萃?。┯H和反膠團(tuán)萃?。ǚ茨z團(tuán)萃?。?親和沉淀（沉淀）親和沉淀（沉淀） 親和電泳（電泳）親和電泳（電泳）2022-3-34 4親和層析親和層析(affinity Chromatography) 利用生物大分子物質(zhì)具有與某些相應(yīng)利用生物大分子物質(zhì)具有與某些相應(yīng)的分子的分子專一性可逆結(jié)合專一性可逆結(jié)合的特性而建立的特性而建立的層析技術(shù)。的層析技術(shù)。 適用于從成份復(fù)雜且雜質(zhì)含量遠(yuǎn)大于適用于從成份復(fù)雜且雜

3、質(zhì)含量遠(yuǎn)大于目標(biāo)物的混合物中提純目標(biāo)物。目標(biāo)物的混合物中提純目標(biāo)物。2022-3-35 5特點(diǎn)特點(diǎn)(p145) 經(jīng)過一次處理可得到經(jīng)過一次處理可得到高純度活性高純度活性物質(zhì)物質(zhì) ； 設(shè)備要求不高、操作簡便、設(shè)備要求不高、操作簡便、特異性強(qiáng)特異性強(qiáng)、分離速度、分離速度快、分離效果好、分離條件溫和快、分離效果好、分離條件溫和； 親和吸附劑通用性較差，親和吸附劑通用性較差，專用的吸附劑專用的吸附劑。2022-3-36 6親和吸附劑：載體親和吸附劑：載體配基配基 在親和層析中起在親和層析中起可逆結(jié)合的特異可逆結(jié)合的特異性物質(zhì)稱為性物質(zhì)稱為配基配基（Ligand）。）。 與配基結(jié)合的層與配基結(jié)合的層析介

4、質(zhì)稱為析介質(zhì)稱為載體載體（Matrix）。）。2022-3-37 7一、親和層析的原理一、親和層析的原理 （1）配基固定化配基固定化：配基：配基與與載體載體偶聯(lián)，結(jié)合成具有偶聯(lián)，結(jié)合成具有特異親和性的分離介質(zhì)。特異親和性的分離介質(zhì)。 （2）吸附樣品吸附樣品：親和層：親和層析介質(zhì)選擇性吸附生物活析介質(zhì)選擇性吸附生物活性物質(zhì)性物質(zhì).（3）樣品解吸樣品解吸：選擇適宜：選擇適宜的條件使被吸附物活性物的條件使被吸附物活性物質(zhì)解吸。質(zhì)解吸。2022-3-38 8二、親和層析載體二、親和層析載體（一）、親和層析對載體的要求：（一）、親和層析對載體的要求： （1）充分）充分功能化功能化，與配基進(jìn)行共價(jià)連接。，

5、與配基進(jìn)行共價(jià)連接。 （2）有較好的）有較好的理化穩(wěn)定性和生物惰性理化穩(wěn)定性和生物惰性。 （3）具有高度的）具有高度的水不溶性和親水性水不溶性和親水性。 （4）具有）具有多孔的立體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)多孔的立體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。 （5）應(yīng)為）應(yīng)為大小均勻大小均勻的剛性小球。的剛性小球。2022-3-39 9（二）、常用載體（二）、常用載體 纖維素纖維素 (cellulose) 瓊脂糖凝膠瓊脂糖凝膠 葡聚糖凝膠葡聚糖凝膠 聚丙烯酰胺凝膠聚丙烯酰胺凝膠 多孔玻璃珠（多孔玻璃珠（Bio-Glass） 其它載體其它載體Ultrogels ACA、 magnogels ACA442022-3-310101 1、纖維素、纖維

6、素 纖維素纖維素結(jié)構(gòu)緊密結(jié)構(gòu)緊密、均一性差，不利于大、均一性差，不利于大分子的滲入。分子的滲入。 非特異性吸附力較強(qiáng)，非特異性吸附力較強(qiáng)，空間位阻空間位阻。 主要用于主要用于分離與核酸有關(guān)的物質(zhì)分離與核酸有關(guān)的物質(zhì)。 2022-3-311112 2、瓊脂糖凝膠瓊脂糖凝膠 瓊脂糖濃度有瓊脂糖濃度有2%、4%、6%，商品為，商品為Sepharose 2B、4B和和6B（Pharmacia）。）。 保持吸附物質(zhì)活性，能迅速活化并接上各種保持吸附物質(zhì)活性，能迅速活化并接上各種功能基團(tuán)，結(jié)構(gòu)疏松功能基團(tuán)，結(jié)構(gòu)疏松孔徑大，流速快孔徑大，流速快。 Sepharose CL, ,穩(wěn)定性明顯增加，能在穩(wěn)定性明顯

7、增加，能在pH314中應(yīng)用。中應(yīng)用。 2022-3-31212 3 3、葡聚糖凝膠：葡聚糖凝膠： 葡聚糖凝膠孔徑太小葡聚糖凝膠孔徑太小，偶聯(lián)配基后，孔徑更小，偶聯(lián)配基后，孔徑更小，應(yīng)用受到限制。應(yīng)用受到限制。 4 4、聚丙烯酰胺凝膠：聚丙烯酰胺凝膠： Bio-gel P 有供化學(xué)反應(yīng)的有供化學(xué)反應(yīng)的酰胺基酰胺基，能制得配基含量較能制得配基含量較高的親和柱高的親和柱，適用于親和勢比較低的系統(tǒng)。，適用于親和勢比較低的系統(tǒng)。 pH過高或過低的溶液中酰胺基易水解。過高或過低的溶液中酰胺基易水解。2022-3-31313 5 5、多孔玻璃珠：多孔玻璃珠： 化學(xué)與物理穩(wěn)定性化學(xué)與物理穩(wěn)定性較好，機(jī)械強(qiáng)度高

8、。較好，機(jī)械強(qiáng)度高。 缺點(diǎn)：親水性不強(qiáng)，對蛋白質(zhì)尤其是堿缺點(diǎn)：親水性不強(qiáng)，對蛋白質(zhì)尤其是堿性蛋白質(zhì)有性蛋白質(zhì)有非特異性吸附非特異性吸附，化學(xué)活性基，化學(xué)活性基團(tuán)少。團(tuán)少。 6 6、其它載體、其它載體(p147)2022-3-31414三三 、 親和配基親和配基 理想配基理想配基的特點(diǎn)的特點(diǎn)(p149)(p149)* * 配基的選擇配基的選擇 配基的配基的濃度濃度 配基偶聯(lián)的配基偶聯(lián)的位置位置 配基分子的配基分子的大小大小 配基的配基的類型類型2022-3-31515（一）、配基的選擇（一）、配基的選擇 親和層析配基的選用主要取決于分離親和層析配基的選用主要取決于分離對象。對象。 1 1、配基與

9、配體有足夠大的親和力、配基與配體有足夠大的親和力 （親（親和勢），和勢），K KL L 在在10-410-8之間之間。 2 2、配基與配體的結(jié)合應(yīng)是專一的、配基與配體的結(jié)合應(yīng)是專一的 。 3 3、配基應(yīng)具有化學(xué)活性、配基應(yīng)具有化學(xué)活性 。2022-3-31616（二）、配基的濃度（二）、配基的濃度 對親和勢比較低的時(shí)候（對親和勢比較低的時(shí)候（KL10-4mol/L），增加），增加配基濃度配基濃度有利于吸有利于吸附。附。 增加增加親和柱的長度親和柱的長度來提高吸附率。來提高吸附率。 配基濃度太高使吸附力太強(qiáng)，洗脫配基濃度太高使吸附力太強(qiáng)，洗脫困難。困難。 理想的配基濃度為理想的配基濃度為1-10

10、mol/L。2022-3-31717（三）、配基偶聯(lián)的位置（三）、配基偶聯(lián)的位置 配基固定化時(shí)，其配基固定化時(shí)，其不參與親和不參與親和結(jié)合的部位與載體進(jìn)行偶聯(lián)結(jié)合的部位與載體進(jìn)行偶聯(lián)。 AMP-Sepharose親和柱親和柱 腺嘌呤腺嘌呤N6-氨基氨基接到載體上，對接到載體上，對脫氫酶和甘油激酶有吸附力。脫氫酶和甘油激酶有吸附力。 磷酸基磷酸基接到載體上，對甘油醛接到載體上，對甘油醛-3-磷酸脫氫酶有吸附力。磷酸脫氫酶有吸附力。2022-3-31818（四）、配基分子的大?。ㄋ模?、配基分子的大小 選用選用大分子配基大分子配基。 甘氨酸甘氨酸 小分子物質(zhì)作為配基，小分子物質(zhì)作為配基，載體和配基間

11、插入一載體和配基間插入一個(gè)個(gè)“手臂手臂”以消除空以消除空間障礙。間障礙。2022-3-31919（五）、配基的類型（五）、配基的類型 較小的有機(jī)分子或天然生物活性物質(zhì)較小的有機(jī)分子或天然生物活性物質(zhì)。 根據(jù)配基應(yīng)用和性質(zhì)根據(jù)配基應(yīng)用和性質(zhì):特殊配基和通用配特殊配基和通用配基基。 特殊配基特殊配基（special ligandspecial ligand） 2022-3-32020通用配基（通用配基（general ligand） 用于一類物質(zhì)的分離提純。用于一類物質(zhì)的分離提純。 用用NADH作作脫氫酶脫氫酶類親和層析的通用配類親和層析的通用配基；基； 用用ATP作激酶類親和層析的通用配基；作激

12、酶類親和層析的通用配基； 用用外源性凝集素外源性凝集素作作糖蛋白類糖蛋白類親和層析時(shí)親和層析時(shí)的通用配基等。的通用配基等。特殊特殊配基（配基（specific ligand）2022-3-32121四、四、 載體的活化與偶聯(lián)載體的活化與偶聯(lián) 糖類載體的活化與偶聯(lián)糖類載體的活化與偶聯(lián) 聚丙烯酰胺凝膠及其它凝膠衍生物聚丙烯酰胺凝膠及其它凝膠衍生物活化與偶聯(lián)活化與偶聯(lián) 用于固定化配基的凝膠衍生物用于固定化配基的凝膠衍生物 2022-3-32222（一）、糖類載體活化與偶聯(lián)（一）、糖類載體活化與偶聯(lián) 溴化氰溴化氰活化法活化法 高碘酸氧化法高碘酸氧化法 環(huán)氧化法環(huán)氧化法 甲苯磺酰氯法甲苯磺酰氯法 雙功能

13、試劑法雙功能試劑法2022-3-32323溴化氰活化法溴化氰活化法 載體如瓊脂糖、葡聚糖等，在堿性條件下載體如瓊脂糖、葡聚糖等，在堿性條件下用用溴化氰溴化氰處理，可引入活潑的處理，可引入活潑的“亞氨基碳亞氨基碳酸酸”中間體。中間體。 在弱堿的條件下直接與在弱堿的條件下直接與含有游離脂肪族氨含有游離脂肪族氨基或芳香族氨基的配基基或芳香族氨基的配基偶聯(lián)。偶聯(lián)。2022-3-32424方法2022-3-32525高碘酸氧化法高碘酸氧化法 多糖載體與多糖載體與0.1mol/L的的高碘酸鈉高碘酸鈉氧化反應(yīng)氧化反應(yīng)24小小時(shí)會產(chǎn)生醛；時(shí)會產(chǎn)生醛； 在溫和條件下，醛與賴氨酸上的在溫和條件下，醛與賴氨酸上的-

14、NH2生成生成希希夫堿夫堿，接著用硼氫化鈉還原，生成穩(wěn)定的，接著用硼氫化鈉還原，生成穩(wěn)定的烷基烷基胺胺。2022-3-32626 環(huán)氧化法環(huán)氧化法 堿性條件下，多糖載體與堿性條件下，多糖載體與環(huán)氧氯丙烷環(huán)氧氯丙烷作用作用生成環(huán)氧化合物；生成環(huán)氧化合物； 環(huán)氧化合物又與環(huán)氧化合物又與氨基酸或蛋白質(zhì)上氨基偶氨基酸或蛋白質(zhì)上氨基偶聯(lián)聯(lián)。2022-3-32727 甲苯磺酰氯法甲苯磺酰氯法 甲苯磺酰氯法甲苯磺酰氯法 在無水丙酮中進(jìn)行。在無水丙酮中進(jìn)行。 優(yōu)點(diǎn)：活化反應(yīng)迅速；優(yōu)點(diǎn)：活化反應(yīng)迅速； 偶聯(lián)條件溫和；偶聯(lián)條件溫和； 偶聯(lián)效率高。偶聯(lián)效率高。 2022-3-32828雙功能試劑法雙功能試劑法 雙功

15、能試劑雙功能試劑是同一分子中具有是同一分子中具有兩個(gè)反應(yīng)活性基團(tuán)兩個(gè)反應(yīng)活性基團(tuán)的的化學(xué)試劑，常作為連接兩個(gè)分子的化學(xué)試劑，常作為連接兩個(gè)分子的“橋梁橋梁”。 二乙烯砜、戊二醛、琥珀酸酐二乙烯砜、戊二醛、琥珀酸酐 優(yōu)點(diǎn)：反應(yīng)速度快、條件溫和，能與氨基、糖類、優(yōu)點(diǎn)：反應(yīng)速度快、條件溫和，能與氨基、糖類、酚、醇類等偶聯(lián)。酚、醇類等偶聯(lián)。 2022-3-32929（二）、（二）、聚丙烯酰胺凝膠及聚丙烯酰胺凝膠及 其它凝膠衍生物活化與偶聯(lián)其它凝膠衍生物活化與偶聯(lián) 疊氮化法疊氮化法 重氮化法重氮化法 ( (含氨基載體含氨基載體) ) 碳二亞胺縮合法（含羧基載體）碳二亞胺縮合法（含羧基載體）2022-3-

16、33030聚丙烯酰胺凝膠載體的活化法聚丙烯酰胺凝膠載體的活化法 有大量可修飾的有大量可修飾的酰胺基酰胺基。 酰胺基能被酰胺基能被含氮化合物含氮化合物置換制備多種衍生物。置換制備多種衍生物。 2022-3-33131疊氮化法疊氮化法 聚丙烯酰胺的聚丙烯酰胺的酰肼衍生物酰肼衍生物，加，加1mol/L的亞的亞硝酸，反應(yīng)液攪硝酸，反應(yīng)液攪90s； 加入加入脂肪胺類配基脂肪胺類配基，制得親和吸附劑。，制得親和吸附劑。 2022-3-33232重氮化法重氮化法 -氨基烷基瓊脂糖衍生物，對硝基苯甲酰氯反應(yīng)，制得氨基烷基瓊脂糖衍生物，對硝基苯甲酰氯反應(yīng)，制得對硝基苯甲酰胺烷基瓊脂糖衍生物對硝基苯甲酰胺烷基瓊脂

17、糖衍生物。 用連二亞硫酸鈉還原，亞硝酸鈉處理，得用連二亞硫酸鈉還原，亞硝酸鈉處理，得重氮鹽衍生物重氮鹽衍生物。 配基與重氮鹽衍生物偶聯(lián)配基與重氮鹽衍生物偶聯(lián)，制得親和層析柱。，制得親和層析柱。2022-3-33333碳二亞胺縮合法碳二亞胺縮合法 碳二亞胺為碳二亞胺為羧基活化劑羧基活化劑。 反應(yīng)中的脲反應(yīng)中的脲衍生物可用衍生物可用有機(jī)溶劑洗有機(jī)溶劑洗滌除去。滌除去。2022-3-33434（三）、用于固定化配基的凝膠衍生物（三）、用于固定化配基的凝膠衍生物 1、CNBr活化的活化的Sepharose 4B Sepharose 4B經(jīng)經(jīng)CNBr活化，可偶聯(lián)蛋白和核活化，可偶聯(lián)蛋白和核酸類配基。酸類

18、配基。2、AH-Sepharose 4B和和CH-Sepharose 4B含有含有6個(gè)碳原子的個(gè)碳原子的”手臂手臂”的瓊脂糖衍生物的瓊脂糖衍生物 AH-Sepharose 4B用于含有羧基的一類配基用于含有羧基的一類配基。 CH-Sepharose 4B能與含有一級氨基的配基偶聯(lián)。能與含有一級氨基的配基偶聯(lián)。2022-3-33535 2022-3-336363、環(huán)氧活化型、環(huán)氧活化型Sepharose 6B 由親水由親水“手臂手臂”與與Sepharose 6B載體通過載體通過醚鏈形成的衍生物。醚鏈形成的衍生物。 用于用于小分子配基的固定化小分子配基的固定化。 用于偶聯(lián)脂多糖、蛋白等大分子配基。

19、用于偶聯(lián)脂多糖、蛋白等大分子配基。2022-3-337374、活化型親和膠、活化型親和膠10和和15 由由N-羥琥珀酰亞胺羥琥珀酰亞胺與瓊脂糖衍生物形成的活化與瓊脂糖衍生物形成的活化酯。酯。 Affi-Gel10的的“手臂手臂”長為長為10個(gè)碳原子，產(chǎn)生一些個(gè)碳原子，產(chǎn)生一些負(fù)電荷，負(fù)電荷，有利于堿性或中性蛋白偶聯(lián)有利于堿性或中性蛋白偶聯(lián)； Affi-Gel15為為15個(gè)碳原子的個(gè)碳原子的“手臂手臂”，產(chǎn)生一些正，產(chǎn)生一些正電荷，故電荷，故有利于酸性蛋白的偶聯(lián)有利于酸性蛋白的偶聯(lián)。 2022-3-338385、CM-生物膠生物膠A、親和膠、親和膠202和親和膠和親和膠102 CM Bio-Ge

20、l A，無，無“手臂手臂” 的的羧基衍生物羧基衍生物； Affi-Gel 102具有具有6個(gè)原子個(gè)原子“手臂手臂”，未端為氨基。，未端為氨基。 Affi-Gel202具有具有10個(gè)原子的個(gè)原子的“手臂手臂”，未端具有，未端具有羧基；羧基；2022-3-33939五、五、 親和層析的影響因素親和層析的影響因素 配基濃度配基濃度對親和力的影響對親和力的影響 空間障礙空間障礙的影響的影響 配基與載體的配基與載體的結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合位點(diǎn)的影響的影響 載體孔徑載體孔徑的影響的影響 微環(huán)境微環(huán)境的影響的影響2022-3-34040（一）、配基濃度對親和力的影響（一）、配基濃度對親和力的影響 為將親和配體與其它物

21、質(zhì)分開，需要為將親和配體與其它物質(zhì)分開，需要阻留值阻留值10。 配基濃度配基濃度與與親和對解離常數(shù)親和對解離常數(shù)相關(guān)。相關(guān)。 對于低親和力系統(tǒng)，對于低親和力系統(tǒng)，配基濃度配基濃度。 2022-3-34141（二）、空間障礙的影響（二）、空間障礙的影響 空間位阻。空間位阻。 對于對于分子大的配體分子大的配體以及以及小小分子配基分子配基更明顯。更明顯。 “手臂手臂”，增加與載體相，增加與載體相連配基的活動度，減輕載連配基的活動度，減輕載體的立體障礙。體的立體障礙。 常用的常用的“手臂手臂”多為烴鏈多為烴鏈。 2022-3-34242（三）、配基與載體的結(jié)合位點(diǎn)的影響（三）、配基與載體的結(jié)合位點(diǎn)的影

22、響 多肽或蛋白質(zhì)等大分子配基多肽或蛋白質(zhì)等大分子配基 須須控制偶聯(lián)控制偶聯(lián)反應(yīng)反應(yīng)條件條件，使它以，使它以最少的功能最少的功能基團(tuán)與載體連接基團(tuán)與載體連接。 保持蛋白質(zhì)原有的保持蛋白質(zhì)原有的高級結(jié)構(gòu)高級結(jié)構(gòu)，使親和吸附，使親和吸附劑具有較大的親和力。劑具有較大的親和力。 2022-3-34343 （四）、載體孔徑的影響（四）、載體孔徑的影響 載體孔隙是配體向配基接近的通道。載體孔隙是配體向配基接近的通道。 孔徑大小孔徑大小對吸附劑親和能力有影響。對吸附劑親和能力有影響。 （五）、微環(huán)境的影響（五）、微環(huán)境的影響 載體及載體及“手臂手臂”的的電性、極性電性、極性對親和力的影響。對親和力的影響。

23、避免引入離子鍵的基團(tuán)避免引入離子鍵的基團(tuán)。 疏水作用疏水作用的存在，會引起的存在，會引起非特異性吸附非特異性吸附作用。作用。2022-3-34444六、六、 配基與間隔臂的連接配基與間隔臂的連接(p153)(p153) （一）、含氮配基的連接（一）、含氮配基的連接 （二）、含羧基配基的連接（二）、含羧基配基的連接 （三）、含巰基配基的連接（三）、含巰基配基的連接 （四）、含醛基、酮基、羥基（四）、含醛基、酮基、羥基 配基的連接配基的連接2022-3-34545七、七、 親和層析的吸附和洗脫親和層析的吸附和洗脫 影響影響吸附吸附的條件的條件 親和層析的親和層析的洗脫洗脫 親和吸附劑的再生親和吸附

24、劑的再生2022-3-34646（一）、影響吸附的條件（一）、影響吸附的條件 親和吸附劑及配體的性質(zhì)親和吸附劑及配體的性質(zhì) 緩沖液的種類、離子強(qiáng)度、緩沖液的種類、離子強(qiáng)度、pH、溫度和層析、溫度和層析流速有關(guān)。流速有關(guān)。 溫度溫度升高會使吸附作用減弱。升高會使吸附作用減弱。 流速流速每小時(shí)低于每小時(shí)低于10 ml/cm2。 層析柱用前必須充分平衡。層析柱用前必須充分平衡。 上樣體積上樣體積為柱床體積的為柱床體積的5%。2022-3-34747非專一性吸附非專一性吸附 親和層析中的非專一性吸附。親和層析中的非專一性吸附。 離子效應(yīng)離子效應(yīng) 疏水基團(tuán)疏水基團(tuán) 復(fù)合親和力復(fù)合親和力2022-3-34

25、848離子效應(yīng)離子效應(yīng) 配基與配基與載體載體-間隔臂間隔臂的不的不完全結(jié)合，將無關(guān)完全結(jié)合，將無關(guān)離子離子基團(tuán)引入基團(tuán)引入吸附劑。吸附劑。 具有具有離子基團(tuán)離子基團(tuán)的親和吸的親和吸附劑會影響蛋白質(zhì)的洗附劑會影響蛋白質(zhì)的洗脫行為。脫行為。2022-3-34949疏水基團(tuán)疏水基團(tuán) 吸附劑疏水性基團(tuán)與蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中吸附劑疏水性基團(tuán)與蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中的疏水區(qū)相互吸引，形成的疏水區(qū)相互吸引，形成非專一性非專一性吸附。吸附。 疏水基團(tuán)：疏水基團(tuán)： （1）長的烴鏈結(jié)構(gòu)的）長的烴鏈結(jié)構(gòu)的“手臂手臂”： （2）疏水性配基：）疏水性配基：2022-3-35050復(fù)合親和力復(fù)合親和力 離子效應(yīng)離子效應(yīng)作用，又有作用，又有

26、疏水作用疏水作用。 配體與配基有較強(qiáng)生物特異性。配體與配基有較強(qiáng)生物特異性。 用用高濃度的鹽高濃度的鹽和和有機(jī)溶劑，有機(jī)溶劑，以提高以提高選擇性。選擇性。2022-3-35151（二）、親和層析的洗脫（二）、親和層析的洗脫 洗脫洗脫 洗脫方法主要有三種：洗脫方法主要有三種： 非專一性洗脫非專一性洗脫 特殊洗脫特殊洗脫 專一性洗脫專一性洗脫2022-3-35252非專一性洗脫非專一性洗脫 改變改變洗脫劑的洗脫劑的pH。 離子強(qiáng)度的離子強(qiáng)度的分步和梯度變化分步和梯度變化. 親和勢很高，親和勢很高，促溶離子促溶離子，其洗脫能力的強(qiáng)弱順序，其洗脫能力的強(qiáng)弱順序ClICF3COOSCN CCl3COO。

27、 用蛋白質(zhì)變性劑（如脲或用蛋白質(zhì)變性劑（如脲或鹽酸胍鹽酸胍）。）。2022-3-35353特殊洗脫特殊洗脫 裂解配基與載體的連接鍵裂解配基與載體的連接鍵。 斷裂方法有：斷裂方法有： 硫酯鍵硫酯鍵用羥胺處理用羥胺處理30分鐘；分鐘； 偶氮鍵偶氮鍵用用連二亞硫酸鈉連二亞硫酸鈉硼酸緩沖液處理；硼酸緩沖液處理； 二硫鍵二硫鍵用巰基乙醇、半胱氨酸、二硫蘇糖用巰基乙醇、半胱氨酸、二硫蘇糖醇醇等處理。等處理。2022-3-35454專一性洗脫專一性洗脫 S（固定化配基），（固定化配基），E（酶），（酶），I（游離配基）（游離配基） （1）競爭性效應(yīng)）競爭性效應(yīng)，即，即ESI不如不如EI穩(wěn)定，穩(wěn)定，增加增加洗

28、脫劑中洗脫劑中I，會使，會使E洗脫下來洗脫下來（正洗脫）。（正洗脫）。 （2）當(dāng)）當(dāng)ESI穩(wěn)定性與穩(wěn)定性與EI相同時(shí)，相同時(shí)，I的存在并不的存在并不影響影響E對對S的結(jié)合，非競爭性效應(yīng)。的結(jié)合，非競爭性效應(yīng)。 （3 3）反競爭性效應(yīng)）反競爭性效應(yīng)，即，即ESI比比EI穩(wěn)定，穩(wěn)定，I使使E與與S結(jié)合更緊密結(jié)合更緊密（負(fù)洗脫）（負(fù)洗脫） 。2022-3-35555反競爭性效應(yīng)反競爭性效應(yīng)2022-3-35656親和層析中配基的選擇和洗脫條件親和層析中配基的選擇和洗脫條件 2022-3-35757（三）、親和吸附劑的再生（三）、親和吸附劑的再生 用緩沖液充分用緩沖液充分平衡平衡后即可重復(fù)使用。后即可

29、重復(fù)使用。 親和力下降，非特異吸附增加，大多由親和力下降，非特異吸附增加，大多由變變性蛋白性蛋白沉積造成，用沉積造成，用6mol/L脲脲洗柱。洗柱。2022-3-35858八、其他親和層析八、其他親和層析 金屬離子親和層析金屬離子親和層析 有機(jī)染料親和層析有機(jī)染料親和層析 擬生物親和層析（擬生物親和層析（BAC） 多多肽親和層析肽親和層析 2022-3-35959（一）、金屬螯合親和層析（一）、金屬螯合親和層析 將環(huán)氧活化型將環(huán)氧活化型Sepharose-6B與金屬螯合劑與金屬螯合劑偶聯(lián)，再用金屬離子溶液處理制成金屬螯偶聯(lián)，再用金屬離子溶液處理制成金屬螯合親和層析柱。合親和層析柱。 金屬螯合劑

30、金屬螯合劑:亞氨二醋酸、氨基水楊酸、亞氨二醋酸、氨基水楊酸、8-羥基喹啉、羧甲基氨基酸等羥基喹啉、羧甲基氨基酸等 .2022-3-36060 蛋白質(zhì)上的氨基酸殘基，如蛋白質(zhì)上的氨基酸殘基，如組氨酸的咪組氨酸的咪唑基唑基、半胱氨酸的巰基半胱氨酸的巰基和和色氨酸的吲哚色氨酸的吲哚基基，利于蛋白質(zhì)與固定化金屬離子結(jié)合。，利于蛋白質(zhì)與固定化金屬離子結(jié)合。 金屬離子如金屬離子如鋅和銅鋅和銅。2022-3-36161 吸附：吸附：pH在在68。 洗脫：降低洗脫：降低pH值、增加離子強(qiáng)度、或在緩沖液值、增加離子強(qiáng)度、或在緩沖液中加中加5mmol/L EDTA(乙二胺四乙酸乙二胺四乙酸)等方法。等方法。特點(diǎn)：

31、特點(diǎn)： 蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)吸附容量吸附容量大；大； 價(jià)格便宜；價(jià)格便宜； 具有普遍適用性。具有普遍適用性。2022-3-36262（二）、有機(jī)染料親和層析（二）、有機(jī)染料親和層析 有機(jī)染料具有類似于有機(jī)染料具有類似于NAD+ (煙煙酰胺腺嘌呤二核苷酸酰胺腺嘌呤二核苷酸) 的結(jié)的結(jié)構(gòu)。構(gòu)。 需核苷酸類物質(zhì)為輔酶的酶，需核苷酸類物質(zhì)為輔酶的酶，對染料具有一定親和力。對染料具有一定親和力。 染料共價(jià)偶聯(lián)到瓊脂糖染料共價(jià)偶聯(lián)到瓊脂糖載體上，載體上，能制得親和層析柱。能制得親和層析柱。 染料親和層析已成功的分離純?nèi)玖嫌H和層析已成功的分離純化了多種酶。化了多種酶。2022-3-36363其他親和純化技術(shù)其他親和

32、純化技術(shù) 一、親和過濾（膜分離）一、親和過濾（膜分離） 二、親和分配（雙水相萃?。┒?、親和分配（雙水相萃取） 三、親和反膠團(tuán)萃取（反膠團(tuán)萃?。┤?、親和反膠團(tuán)萃?。ǚ茨z團(tuán)萃?。?四、親和沉淀（沉淀分級）四、親和沉淀（沉淀分級） 五、親和電泳（電泳）五、親和電泳（電泳）2022-3-36464一、一、 親和過濾親和過濾（Affinity FiltrationAffinity Filtration） 將親和層析和膜過濾技術(shù)結(jié)合運(yùn)用，包括將親和層析和膜過濾技術(shù)結(jié)合運(yùn)用，包括親和錯流過濾親和錯流過濾和和親和膜分離親和膜分離。 親和錯流過濾親和錯流過濾（affinity Cross Flow affini

33、ty Cross Flow Filtration,ACFFFiltration,ACFF）: : 是將是將親和層析與超親和層析與超濾技術(shù)濾技術(shù)結(jié)合，高分子底物經(jīng)專一可逆的親結(jié)合，高分子底物經(jīng)專一可逆的親和反應(yīng)后，用膜進(jìn)行錯流過濾，兼有親和和反應(yīng)后，用膜進(jìn)行錯流過濾，兼有親和層析與膜過濾的優(yōu)點(diǎn)。層析與膜過濾的優(yōu)點(diǎn)。2022-3-36565親和錯流過濾親和錯流過濾（affinity Cross Flow Filtrationaffinity Cross Flow Filtration） 基質(zhì)基質(zhì)及及大分子親和配基大分子親和配基 基質(zhì)是聚合物組成的內(nèi)核，親和配基連接在內(nèi)基質(zhì)是聚合物組成的內(nèi)核，親和配

34、基連接在內(nèi)核表面。配基對提取的目標(biāo)物進(jìn)行核表面。配基對提取的目標(biāo)物進(jìn)行專一可逆專一可逆的的吸附，形成吸附，形成復(fù)合體復(fù)合體； 用膜對混合液進(jìn)行錯流過濾，用膜對混合液進(jìn)行錯流過濾，復(fù)合體因分子巨復(fù)合體因分子巨大可被保留大可被保留，雜質(zhì)隨液體透過膜，目標(biāo)物與其，雜質(zhì)隨液體透過膜，目標(biāo)物與其它成分分離。它成分分離。 2022-3-36666基質(zhì)基質(zhì) 聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺 菌類的完整細(xì)胞菌類的完整細(xì)胞 （酵母酵母、芽胞桿菌、芽胞桿菌、鏈球菌等細(xì)胞）鏈球菌等細(xì)胞） 瓊脂糖、脂質(zhì)體等瓊脂糖、脂質(zhì)體等 酵母細(xì)胞純化伴刀豆球蛋白酵母細(xì)胞純化伴刀豆球蛋白A2022-3-36767親和膜親和膜 （affinity

35、 membrane） 親和膜利用親和膜利用親和配基親和配基修飾的修飾的微濾膜微濾膜為親和吸附介質(zhì)為親和吸附介質(zhì)親和純化目標(biāo)蛋白質(zhì)，是親和純化目標(biāo)蛋白質(zhì)，是固定床親和層析固定床親和層析的變型。的變型。 將一張微濾膜比喻為一個(gè)固定床，膜厚為床層高度。將一張微濾膜比喻為一個(gè)固定床，膜厚為床層高度。 2022-3-36868親和膜優(yōu)點(diǎn)親和膜優(yōu)點(diǎn) 傳質(zhì)阻力小傳質(zhì)阻力小，達(dá)到吸附平衡的時(shí)間短；，達(dá)到吸附平衡的時(shí)間短； 配基利用率高，配基利用率高，配基用量低配基用量低； 壓降小，流速快；壓降小，流速快； 設(shè)備體積小。設(shè)備體積小。2022-3-36969二、親和萃取二、親和萃取 （Affinity extra

36、ction） 定義：利用定義：利用偶聯(lián)親和配基的偶聯(lián)親和配基的PEG為成相聚為成相聚合物進(jìn)行的合物進(jìn)行的雙水相萃取雙水相萃取，在親和配基的親，在親和配基的親和結(jié)合作用下促進(jìn)目標(biāo)產(chǎn)物在和結(jié)合作用下促進(jìn)目標(biāo)產(chǎn)物在PEG相（上相（上相）的分配，提高目標(biāo)產(chǎn)物的相）的分配，提高目標(biāo)產(chǎn)物的分配系數(shù)和分配系數(shù)和選擇性選擇性。 PEG/Dextran, PEG/無機(jī)鹽無機(jī)鹽2022-3-37070親和萃取純化過程親和萃取純化過程 親和分配（進(jìn)親和分配（進(jìn)料），料）， 雜蛋白反萃取雜蛋白反萃?。ㄇ逑矗ㄇ逑矗?目標(biāo)產(chǎn)物反萃取目標(biāo)產(chǎn)物反萃取（洗脫）（洗脫）。 2022-3-37171三、親和反膠團(tuán)萃取三、親和反膠

37、團(tuán)萃?。ˋffinity-based reversed micellar extraction） 定義：指在定義：指在反膠團(tuán)反膠團(tuán)相中除通相中除通常的表面活性劑以外，添加常的表面活性劑以外，添加另一種親水另一種親水頭部為親和配基頭部為親和配基的的助表面活性劑助表面活性劑（cosurfactant）；）； 通過通過親和配基親和配基與與目標(biāo)分子目標(biāo)分子的的親和結(jié)合作用，促進(jìn)目標(biāo)產(chǎn)親和結(jié)合作用，促進(jìn)目標(biāo)產(chǎn)物在反膠團(tuán)相的分配。物在反膠團(tuán)相的分配。2022-3-37272親和反膠團(tuán)萃取過程親和反膠團(tuán)萃取過程2022-3-37373反萃取反萃取2022-3-37474四、親和沉淀四、親和沉淀 （Affin

38、ity precipitation） 親和沉淀親和沉淀: :是是生物親和相互作用生物親和相互作用與與沉淀分離沉淀分離相結(jié)合的生物大分子的分離純化技術(shù)。相結(jié)合的生物大分子的分離純化技術(shù)。 一次作用親和沉淀一次作用親和沉淀 二次作用親和沉淀二次作用親和沉淀2022-3-37575一次作用親和沉淀一次作用親和沉淀 水溶性化合物分子水溶性化合物分子上偶聯(lián)有兩個(gè)或兩個(gè)以上的上偶聯(lián)有兩個(gè)或兩個(gè)以上的親親和配基和配基 雙配基（雙配基（bis-ligand）；多配基（）；多配基（polyligand）。）。 雙配基或多配基雙配基或多配基與含有兩個(gè)以上與含有兩個(gè)以上親和結(jié)合部位親和結(jié)合部位的的多價(jià)蛋白質(zhì)多價(jià)蛋白質(zhì)產(chǎn)生親和交聯(lián)，增大為較大的交聯(lián)網(wǎng)產(chǎn)生親和交聯(lián)，增大為較大的交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)而沉淀。絡(luò)而沉淀。2022-3-37676二次作用親和沉淀二次作用親和沉淀 制備親和沉淀介質(zhì)制備親和沉淀介質(zhì): :利用在利用在物理