凝膠成像及Quantity-One中文操作說明

1、第一章簡介凝膠電泳是每個做分子生物學(xué)的研究者天天都耍打交道的根本技術(shù)。電泳之后的信息處理與電泳本身同樣重要。目前有大量軟件可以用于分析電泳結(jié)果，要向大家介紹的是 Bio-Rad公司的1D凝膠分析軟件Quantity One ( Bio-Rad還有一個做2D凝膠分析的軟件PDQuest)。Quantity One軟件是常用1D凝膠分 析軟件中功能最強(qiáng)大，自動化程度最高的軟件。這個軟件的最新版本可以在Bio-Rad的網(wǎng)()免費(fèi)下載，以供試用或用戶升級之用。Quantity One軟件的主要功能包括定量分析 (Volumes Quick Guide)，電泳條帶分析(Band Analysis) 差顯

2、分析(Differential Display Analysis)，克隆計數(shù)(Colony Counting Analysis) 等，此外，還可以直接控制Bio-Rad公司的各類圖像儀和 ExQuest自動切膠儀，使您的凝膠分析工作變得極為輕松。Quantity One 軟件擁有與windows操作系統(tǒng)下絕大多數(shù)應(yīng)用軟件相同的友好界面。til* &da Jfi« la«4t Liaifudi Vii»» AhAjriM 備騎計加如血Mtil簞血t fkiie Qai山仏血 tnptjng Qwivk 4uid«fimdk GnitI f

3、it&d. iaedjrin Qiicfc 施J 血 C»l«ny Cwtic ck 缸皿心乳桃致Qoj EID SS?r!匚 Critenor. HE iButeJUdi CMIfMi t*d IultiEtyVvvd Ltnrijrlapjntlic Jrtt仇Mt托H 弟idsTrWSlWfr2 ZixMiB&xDafftrinud Oi fiitdi fm-dlikuiAti tf 4m|t(ilttr89VqimeRed Twt VAmerieelHnj lodVflMncCcntfti T«l 占如t TooT'CjWSfl 1

4、«1網(wǎng)兇1；V -ckk com a mT tan M2 Mb s Me&k插入密碼狗，翻開 Quantity One軟件，可以看到最上緣藍(lán)色橫條幅是標(biāo)題欄，往下依次是菜單欄和 工具欄。File圖像翻開、保存、引入、打印Ma分子量估算、條帶匹配分析等操作tchEdit圖像普通編輯操作Vo定量分析lumnView圖像縮放、三維視圖、看光密An濃度估算、克隆計數(shù)等分析Imag圖像旋轉(zhuǎn)、翻轉(zhuǎn)、裁切等操作Re分析結(jié)果輸岀portsLane泳道分析Wi窗口分析ndowBand條帶分析He幫助、快捷菜單、軟件注冊Ip等每個菜單的主要功能如下：往下一行是工具欄，上面每個按鈕的功能見下表:翻

5、開立fk圖像顯示控制存條帶分析工具*J保存操作界c顯示條帶！匹配工具a打申圖像、L去除分析標(biāo)記“輪處修改工具,cP看余圖卩圈像工具打印快捷指南J局部放大護(hù)電文字工舟|定量分析快捶指南日拖處am> p定量工具八條帶分析快捶指南門放大并居中HU I1 *灰度分析工斗克隆計數(shù)快捶指南戶縮小并居中護(hù)rmrnw *泳道分析工具誤Quantity One 軟件Help aQuick Guide快捷指南提示如何實(shí)現(xiàn)一個功能，如定量分析(Volumes QuickGuide)，電泳條帶分析(Band Analysis)，差顯分析(Differential Display Analysis)，克隆計數(shù)(C

6、olony Counting Analysis) 等。快捷指南下有1，2，3步驟，根據(jù)提示完成。使用Quantity One軟件進(jìn)行電泳結(jié)果分析，通常包括圖像獲取、圖像預(yù)處理、分析、結(jié)果輸出四部分。圖像獲取就是通過軟件控制掃描儀(GS-800 PharosFX等)或凝膠成像系統(tǒng)(GelDoc、ChemiDoc. VersaDoc等)，圖像預(yù)處理就是將掃描或拍照獲得的原始圖像進(jìn)行初步處理，以便更好地進(jìn)行后續(xù)分析。接下來是分析過程，根據(jù)分析的方法和目的不同，又可以分為定量分析、條帶分析、克隆計數(shù)、差異(聚類)分析 等等。不管如何分析，最終我們都必須通過軟件的輸岀功能，得到我們想要的結(jié)果。Quant

7、ity One軟件提供了多種結(jié)果輸岀方式。在接下來的幾章里，我們將按照這個思路，一步步引導(dǎo)您使用這一軟件Acquire ImejeOpting ;e Umag普Lane and Bard Analysis ;o ume Analysis Colony CotntngRepot ResultsRg. 1-2 Quantity One workflow第二章圖像獲取Quantity One 4.4 4.6版本可以控制 Bio-Rad目前幾乎所有的圖像儀，如GelDoc XR ChemiDocXRS等。這些圖像儀采集到的圖像，可以直接保存成軟件可直接分析的圖像，即擴(kuò)展名1sc的原始圖像文件。下面將具

8、體介紹如何通過 Quantity One 軟件從GelDoc XR獲取圖像。GelDoc XR是Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)中最常用，操作最簡便的儀器，它可以用來拍攝EB SYBFGreen等染料染的核酸電泳凝膠；Sypro Ruby、銀染、考馬斯亮藍(lán)等方法染的蛋白電泳凝膠；以及化學(xué)顯色的印記膜等。使用GelDoc XR之前，先接通電源，翻開位于儀器反面右下角的電源開關(guān)；然后根據(jù)具體的應(yīng)用選 擇適宜的照明和濾光片位置。原那么如下：表格形式模式1.如果樣品是通過EB SYBR Green Sypro Ruby等染料通過紫外激發(fā)來顯色，就先將樣品置于紫外 透射平臺(UV Transilluminat

9、or)的中間，關(guān)上暗箱門，然后按下面板上的“Trans UV按鈕，并將濾光片選擇桿置于位置“ I 處。模式2.如果樣品是通過金屬銀、考馬斯亮藍(lán)等染料染色，就先將白光轉(zhuǎn)換屏(White Light ConversionScreen)取下，翻開下部的開關(guān)，放在紫外透射平臺上，樣品置于白光轉(zhuǎn)換屏中間。關(guān)上暗箱門，然后按下 面板上的“ Trans White "按鈕，并將濾光片選擇桿置于位置“I 處。模式3.如果是化學(xué)顯色等非透明可見樣品，那么用模式2中所示方法，將樣品置于白光轉(zhuǎn)換屏中間。關(guān)上暗箱門，然后按下面板上的“ Epi White按鈕，并將濾光片選擇桿置于位置“O處。接下來翻開Qua

10、ntity One 軟件，選擇File?GelDoc XR，按以下順序操作:口抵欝農(nóng)氐1 0*亡 Qomt. it> One ft. 0 (Uiuicll:Lt 411 tiE 址5 Lttv >Uix9 |ktL YgliaM iJlilxiiiLfrd«n Rilpzuaw racusCUV pWhle切母i Aewic6鋼o豁|iBpiv 0mETUi®iw.±1U萌 gm 1 voMwla&0u-=五 o ID qi: (Si bu 1 at i onlQH4HdgK *54ta4Hl PM QfcwOBpiflf 按下Live/Foc

11、us，成像儀進(jìn)入實(shí)時成像； 選擇照明模式，一般核酸膠用UV,蛋白膠用 White模式； 注意，選擇完成后，要按下成像儀面板上相應(yīng)的光源按鈕 此功能有三個上下鍵按鈕：IRIS 光圈，ZOOM縮放，F(xiàn)OCUS聚焦，您可在軟件上直接 調(diào)節(jié)或在儀器面板上手工調(diào)節(jié)調(diào)節(jié)步驟：a調(diào)大IRIS，以看到圖像b點(diǎn)ZOOM備膠適當(dāng)放大c調(diào)節(jié)IRIS至適宜大小一般情況下盡量選擇小光圈，因?yàn)樾」馊吧畲?，圖像更清晰d調(diào)節(jié)FOCUS至圖像最清晰按 按“ Auto Expose ；如是，單擊 Auto Expose,系統(tǒng)將自動選擇曝光時間成像，如不滿意，單擊ManualExpose，并輸入曝光時間秒，圖像滿意后保存，在自動

12、曝光期間，圖象會持續(xù)的輸入到CCD中，直到達(dá)到一定比例的飽和象素值，此比例在Options dialog box 中設(shè)定默認(rèn)值=0.15 %。AlxcClick on Autobutton aopers depessrc：Sxi III A.xpi« Inmj*rffcivartdEnriiue Tini h »1Car see 于pou ne _ime iiTLomaticaily changingO Frsuef kpMlf# 1 FT* (SM)SfeOl I AtUUntsI laJtfJ_±C ick cc Freeze to stop te eitpo

13、sLire processFig. &*6. Freezing trie exposure.一旦圖象質(zhì)量到達(dá)要求，點(diǎn)擊Freeze button 來終止曝光。 如是蛋白凝膠，接第 6步直接將清晰的圖像保存即可 按下“ Analyze ；這將會翻開一個新的窗口來顯示捕獲的圖象，該圖象具有默認(rèn)名稱，具有日 期、時間及用戶名如果的話等信息。按下“ Save鍵，保存圖像。第三章圖像分析Quantity One的圖像分析功能相當(dāng)強(qiáng)大，根據(jù)不同的需要，可以分為定量分析、條帶分析、相似性 分析以及克隆計數(shù)用于藍(lán)白斑篩選等等，而且每種分析法都有獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)和輸岀方式。本章重點(diǎn)介紹常 用的定量分析和條帶分

14、析方法，其余更細(xì)更深的功能請參考軟件自帶的用戶手冊。一.定量分析 Volumn Analysis 定量分析是計算選定區(qū)域內(nèi)信號強(qiáng)度的總和，是Quantity One最方便的定量工具。這種分析方式考慮選定區(qū)域的真實(shí)形狀，可用于電泳條帶、斑點(diǎn)、大型芯片等圖像的定量。這種定量的方法可以扣除背景， 可以按照用戶的標(biāo)準(zhǔn)曲線計算岀條帶或斑點(diǎn)的濃度，但它不能計算分子量，也不能進(jìn)行條帶匹配和相似性 分析。Quantity One軟件稱這類定量的結(jié)果為 Volume。Volume =選定區(qū)域內(nèi)所有像素信號強(qiáng)度的總和x像素面積Volume 的單位：int x mrh快捷指南Volumes Quick Guide，

15、能夠指導(dǎo)您對任意所選區(qū)域進(jìn)行定量分析，此分析可以報告多種結(jié)果，常用的結(jié)果是相對濃度和絕對濃度須提供標(biāo)準(zhǔn)品。具體的操作方法如下："：J 3 T rnskicnL''5 Vofc/neFiee htfwi Tool& VofejieCortour Ido)? Ssfect fooJ;'S PrW .''§RewxtCwcfck awwiru IxwShJlsMi nlihfr 4 raluna hat1選擇成像系統(tǒng)或翻開已保存的文件軟件可以控制Bio-Rad所有的成像系統(tǒng)如GelDoc,ChemiDoc,VersaDoc,GS-8

16、00,FX,如不是Bio-Rad成像系統(tǒng)所攝取的圖象，將圖象保存為Tiff 1文件格式，軟件也可進(jìn)行分析處理2. Zoom Box，縮放，對圖象進(jìn)行放大觀察3. Transform轉(zhuǎn)化，調(diào)節(jié)圖象的比照度黑白4. 選擇待分析區(qū)域：Volumn Contour Tool等高線勾勒區(qū)域，自動連接濃度相同的點(diǎn)，如U1Volume Free hand Tool自由畫筆選擇區(qū)域，可以勾勒出無規(guī)那么形狀，如U2Volume Rect Tool矩形區(qū)域選擇，如 U3Volumn Circle Tool圓形選擇區(qū)域，如 U4按上面4種方法選擇需要定量的區(qū)域。5. 雙擊所選區(qū)域，岀現(xiàn)如下窗口，定義樣品類型，如未知

17、樣品景BackgroundB1,B2，軟件在算濃度時會將此區(qū)域的濃度自動扣除 如果該樣品是濃度標(biāo)準(zhǔn)樣品，即定量標(biāo)準(zhǔn)，需在濃度concentrationUnkonwnU1,U2即待計算樣品，背或標(biāo)準(zhǔn)樣品 Standard Std1,Std2,一欄輸入該樣品的濃度。6. Select Tool 選擇不同區(qū)域7. Print Image 打印圖像8. Volume Analysis Report定量報告結(jié)果，翻開出現(xiàn)如下窗口，選擇要報告的參數(shù)，主要有2個參數(shù) Volume、adj. Vol.( 即 adjusted volume) 和 Concentration 。Volume 為定量值，adj.

18、Vol. 為扣除 背景后的定量值，如有濃度標(biāo)準(zhǔn)樣品( Std)，軟件可報告Concentration 絕對濃度。參數(shù)選好后，按下按 鈕“ done。txt文件，按左側(cè)打印按鈕，可將報告9. 軟件報告如下列圖所示：按右側(cè)輸岀按鈕，可將表格保存成打印岀來二.條帶分析(Band Analysis )條帶分析是Quantity One最根本的分析工具，它可以自動識別電泳泳道和識別條帶，依據(jù)泳道的平 均光密度和條帶寬度對每個條帶進(jìn)行模式化定量。這種分析方式雖然不如定量分析來得方便，但這樣可以 實(shí)現(xiàn)非常復(fù)雜的電泳分析，滿足各種不同的結(jié)果需要。這種方式的最大優(yōu)點(diǎn)在于它可以完全拋棄人為主觀 因素而進(jìn)行全自動定

19、量。用條帶分析的方法進(jìn)行定量的結(jié)果叫Trace Quantity ( Trace Qty )，計算方法是：首先軟件自動計算條帶上每一橫排像素的平均光密度和平均光密度分布曲線，然后每個具體條帶的定量值是平均光密度曲線的 線下面積的積分，即：Trace Quantity =平均光密度x條帶上下邊界的距離Trace Quantity的單位：OD*mmruxrLrLTLnruxrLrLTLnLane Sampling AictnSanaHehtLane Sampling AictnLane TraceLane TraceAverage interisityP«akBand Prolile&#

20、169;劉購e pH>el i“t的 $itycro$5 $snpfe width -integrate under curve (o selin« for bard quantitatm (和即對 x mm J.條帶分析中的條帶定星鯉下面介紹用此功能對泳道內(nèi)的所有條帶進(jìn)行分子量確定，相對濃度分析述 IldnsfCKITL. Frerns Lanaa.5l Strdch Frame6 Add/diurt Anehcti ? Lin# Bdckotound 0- Detect Band.9lIQ R陰加比*一11 Match12 Pkinl Image.* 勻 Al LantJ

21、Retwl.1翻開已保存的文件(如不是Bio-Rad成像系統(tǒng)所攝取的圖象，將圖象保存為Tiff 1文件格式,軟件也可進(jìn)行分析處理)2. Zoom Box，縮放，對圖象進(jìn)行放大觀察3. Transform轉(zhuǎn)化，調(diào)節(jié)圖象的比照度黑白4. 確定泳道(lane),并對泳道進(jìn)行各種調(diào)整(實(shí)際實(shí)驗(yàn)中泳道往往不是垂直的而出現(xiàn)各種變形)按下列圖所示在軟件的工具欄中有一Lane Tool圖標(biāo)，包含有更多泳道編輯工具。Lane T00I+1汙道編輯工具包RsN T«wl %Lu# 1*41 «組匸一二土總匕二上.上±3:&-FFMWLWWt .SiretchFiarieAdW

22、Adfu 科 Aik bn &Re«W4-AnclMartCr«*e LwAdfjti LaceU 論*it LdWRftmfivt LamLane-V/idth .Ln & 4dwvwdPfalLare匚Lihti .- -? M 孑 一 -* 一 ?" « -7 7 - 一 « 7 一 ? « _? - - 丁. - a1!-翕一Fantwe EjndPh* BandV' Vii1. - nljrwLendAlritM?：Afkrf EjndBand TooIp條帶編輯工具邑心5. 選擇Frame Lane

23、s，輸入圖像頭際泳道(lane)數(shù)并確認(rèn)。此時圖像上泳道的位置上會出現(xiàn)一條條 紅線，每條紅線就代表一根泳道。6. 選擇Add/Adjust Anchors，此時泳道紅線上會出現(xiàn)一些小圓圈。這些小圓圈稱為錨定點(diǎn)(anchor)， 錨定點(diǎn)規(guī)定了泳道走向。當(dāng)泳道不直時，點(diǎn)擊岀現(xiàn)彎曲的泳道部位，就可以增加錨定點(diǎn)。鼠標(biāo)按住錨定點(diǎn)， 可以拖動錨定點(diǎn)，讓每根紅線始終位于泳道的中間線上。7. Lane Background去除泳道背景。點(diǎn)擊該按鈕，選擇一條適當(dāng)?shù)挠镜傈c(diǎn)擊之，然后在彈岀的對話框中選“ All Lane On "，在“ Rolling Disk Size 中填入適當(dāng)?shù)臄?shù)值18. Dete

24、ct Band，檢測泳道內(nèi)的條帶，翻開出現(xiàn)如下窗口。通過調(diào)節(jié)sensitivity 靈敏度可調(diào)節(jié)檢測岀的條帶數(shù)，調(diào)節(jié)Lane Width使代表表帶的紅色橫線與條帶寬度差不多寬。中間一行人工編輯按鈕可以 用來增加/減少條帶、調(diào)節(jié)條帶的上、下邊界等。翻開工具欄中Band Tool條帶編輯工具包可看到更多編輯工具如上圖匚 U tlErt Vu-fxi - Pr4ii=«ibv!* .Ri-attawGAiPOneOfW忖曲朗rWarvitg層trffYrirniShodv*:(S'Aw cut廣合 circJEm窯airiii*人工編輯按鈕 割圜到SemiMly 10.000s r

25、*314 >1 Dm 即 I t.iXiHauFior 4 CM$JfiAHScrv | 1 .OQ創(chuàng)*1±I*J*1+J 創(chuàng)±Jd±創(chuàng)*|Meet?i»Swie s-9. Standard輸入分子量標(biāo)準(zhǔn)，軟件自帶有許多Bio-Rad的分子量標(biāo)準(zhǔn)，如你用的是自己的標(biāo)準(zhǔn)，進(jìn)入New Standard建立新的分子量標(biāo)準(zhǔn)，軟件可以選擇標(biāo)準(zhǔn)單位是MW蛋白質(zhì)還是 BP 核酸等左下列圖。在Protein-Standard對話框中輸入分子量數(shù)值，完成后單擊賦值圖標(biāo)右下列圖，回到圖象文件上單擊標(biāo)準(zhǔn)樣品的泳道，軟件自動將所輸?shù)姆肿恿繑?shù)值和泳道內(nèi)的條帶一一對應(yīng)。匚 Q

26、ikAti *蕈UtSefeeiUiMsBase Furs- AsceadlngIQCleqtiq Point-AscendingIso«leccEic Folh-t-D電日匚電ndxntjUTaleculaE ITeighc.- AscendingMaraLaliEfd Rt-DtaccndinEdt I HewCarKd|賦值?。?告訴時盹彩SMviifd ?ba4 珂 I£<wwr/gg r1IWt血血型墨I(xiàn) id找1010. Band Attribute條帶屬性，在完成第9步以后，軟件已自動計算出了其他未知條帶的分子量扌丁開band attribute選擇要報

27、告的參數(shù)，這里我們選擇 Molecular Weight分子量紅顏色標(biāo)記，標(biāo)準(zhǔn)分子量為藍(lán)色標(biāo)記。圖象上可以看到所有條帶的a ¥ 占 口 r % 4 3" -霑盂 7二？1 _ 忙 r a kD戶 41m廣1 nd; IhJrtbii廠IINWIe爐35廣J &«W廣Ji 理嚴(yán) TfdvO.L*廣 0«#1< fw*. 5". f* t4M T *P 舛 r w*hp務(wù) 廠fww 廣 Dvil jpi r 士rtThpCgrtwJRRp ritaMdMVr r EmtHsM L211. Print Image 打印圖象DbWIhMhftl LdIHMI Hmm?1Z1L va 尸mlAM荷12. All Lane Report所有泳道條帶結(jié)果報告。翻開窗口，選擇要報告的參數(shù)，如.分子量，如左下列圖，軟件將報告結(jié)果右下列圖，在報告的右下腳有一報告輸出工具，點(diǎn)擊可將報告結(jié)果輸出成.txt文本格式或輸出至剪貼板，可粘貼到 EXCEL WOR等文件下。LtaM 1OaM*1。躺敬1匸帰3聲啊口常10.PPrioriWHI WTfJ* Li忖FCwnv-"