美國及歐洲藥典系統(tǒng)適應(yīng)性要求

1、系統(tǒng)適應(yīng)性美國藥典系統(tǒng)適應(yīng)性是氣相和液相色譜分析方法的重要組成部分，用于證明色譜系統(tǒng)的分離度和重現(xiàn)性能滿足樣品的分析要求。測試基于這樣的原理：儀器、電路、方法和樣品組成一個整體系統(tǒng)，我們可以對這個系統(tǒng)進行測試評估。影響色譜系統(tǒng)的因素包括：l 流動相的組成、離子強度、溫度和pH值l 柱子大小、流速、柱溫和壓力l 固定相特點，包括填料類型，載體形狀、粒徑、孔徑、表面積等。l 常用固定相為反相硅膠，以十八碳烷基健合硅膠最常用，其它經(jīng)過化學(xué)修飾的硅膠也有使用。分離度Rs是理論塔板數(shù)n的函數(shù)（也叫柱效），是分離因子，k是容量因子（所有符號的意義見前文“色譜定義和說明”部分）。在規(guī)定的色譜條件下，n表示洗

2、脫物中相鄰化合物的分離程度，可作為衡量色譜系統(tǒng)柱效能的指標(biāo)，但是不如直接測試的結(jié)果可靠。峰的尖銳程度部分反映柱效，這個參數(shù)對檢查微量物質(zhì)至關(guān)重要。標(biāo)準(zhǔn)品或者標(biāo)準(zhǔn)溶液需要重復(fù)進樣以確保精密度。除非個論中有規(guī)定, 系統(tǒng)適用性五針的數(shù)據(jù)的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差不超過2.0%, 如果超過2.0%的話, 需要進樣六針。在含量測定中，如果純品含量100%，則相對標(biāo)準(zhǔn)偏差沒有最大值限制，這個值可根據(jù)多次進樣對照溶液來計算：%RSD=KBn/t90%，n-1K為常數(shù)0.349，由公式k=(0.6/)×(t90%,5/6)計算得來，0.62表示B=1.0時六次進樣的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差。B是個案中規(guī)定的上限。n是對照溶

3、液的進樣次數(shù)（3n6），t90%,n-1是自由度為n-1、置信水平為90%，雙側(cè)檢驗時的t值。除非另有規(guī)定，RSD不能超過下表中的值。此規(guī)定不適用于相關(guān)物質(zhì)檢測。Relative Standard Deviation Requirents進樣次數(shù)3456B%RSD上限2.00.410.590.730.852.50.520.740.921.063.00.620.891.101.27對稱因子AS，用于衡量峰的對稱性，完全對稱時值為1。拖尾越嚴(yán)重，AS的值越大（見圖4）。偶爾也會有值小于1的情況。如果對稱因子與1的差值越大，則積分的精密度越差。信噪比（S/N）是系統(tǒng)適應(yīng)性的一個重要參數(shù)，計算公式如下

4、（圖5）：S/N = 2H/hH是峰高，即峰最高點到基線的距離；h是噪音最大值和最小值之間的差值。系統(tǒng)適應(yīng)性測試的數(shù)據(jù)通過重復(fù)進樣標(biāo)準(zhǔn)品或者特定文件中規(guī)定的對照溶液而得到，此文件中對相關(guān)參數(shù)的定義同樣適用于其它操作條件，以下情況可做相應(yīng)調(diào)整：l 標(biāo)準(zhǔn)品（包括參考物質(zhì)）對適應(yīng)性測試中的所有化合物均適用l 在系統(tǒng)適應(yīng)性測試中為改進色譜系統(tǒng)性能而作適當(dāng)調(diào)整對色譜系統(tǒng)的調(diào)整不能彌補柱子和系統(tǒng)本身的缺陷。為滿足系統(tǒng)適應(yīng)性要求而對分析方法調(diào)整時，除非另有規(guī)定，以下每個變量的最大值都應(yīng)考慮；這些調(diào)整需要附加有效數(shù)據(jù)。為驗證新方法的系統(tǒng)適應(yīng)性，需要對改變條件后的分析方法重新評價。多處改動會對系統(tǒng)性能產(chǎn)生積累效

5、果，在分析之前能仔細考慮。在梯度洗脫中不推薦改變流動性組成，如果必須改變，則只對溶劑體積或滯后體積改變。流動相pH（HPLC）：在配備流動相時，水相緩沖液的pH波動范圍在正負(fù)0.2個單位緩沖液鹽濃度（HPLC）：在滿足pH值條件下，緩沖液中鹽的濃度波動范圍在±10%。流動相的組成（HPLC）：以下調(diào)整限度適用于流動相中的小組分（比例小于等于50%）。這些組分的量可在正負(fù)30%范圍內(nèi)調(diào)整。但是不能超過總流動相的10%。下面是兩相體系和三相體系組分的調(diào)整范圍。兩相體系：溶劑比為50:50時，50的30%是15%，超過了10%的限度，因此流動相比例只能在40:60到60：40范圍內(nèi)調(diào)整。容

6、積比為2：98時，2的30%時0.6%，因此改變范圍在1.4：98.6到2.6:97.4三相體系：溶劑比為60:35:5時，第二組分35的30%時10.5%，超過10%的限度，只能在25%到45%的范圍內(nèi)改變。第三組分5的30%是1.5%。加上組分一共同構(gòu)成洗脫體系。因此三相體系的比例變化范圍是50:45:5到70:25:5或者58.5:35:6.5到61.5:35：3.5。紫外-可見光檢測器的波長：操作過程中不允許波長有誤差，廠家或者其它機構(gòu)對檢測器波長的校正誤差不超過3nm。固定相:柱長：可變范圍為原柱長的±70%柱內(nèi)徑（HPLC）：如果線速度恒定可做適當(dāng)調(diào)節(jié)，見流速項（HPLC

7、）下.柱內(nèi)徑（GC）：調(diào)整范圍為原柱內(nèi)徑的±50%薄膜厚度（毛細管GC）：調(diào)整范圍為-50%到100%粒徑（HPLC）：填料顆粒尺寸可以減小50%，但是不能增大。粒徑（GC）：在滿足色譜系統(tǒng)適應(yīng)性要求的情況下，粒徑由大換小或者由小換大都可以，調(diào)料的粒徑比率由最大顆粒的直徑除以最小顆粒的直徑而來。流速（GC）：流速可調(diào)范圍在±50%流速（HPLC）；柱子尺寸改變時，流速可由下式計算：F2=F1l2d22/l1d12F1是文件中規(guī)定的流速，單位是mL/min，F(xiàn)2是調(diào)整后的流速；l1是文件中規(guī)定的柱長，l2是使用柱長；d1為文件中規(guī)定的柱內(nèi)徑，d2為使用柱內(nèi)徑。流速可變范圍是&

8、#177;50%。進樣體積（HPLC）：只要滿足精密度和檢測限，進樣體積可以適當(dāng)減少，但不能增加。進樣體積和分流體積（GC）：檢測器和重現(xiàn)性較好時可做適當(dāng)調(diào)整。柱溫（HPLC）：柱溫波動范圍在±10º進樣口溫度（GC）：可調(diào)范圍±10º程序升溫（GC）：溫度可做適當(dāng)改變，需要保持一定溫度或者改變到另一溫度值時，溫度變化做大容許范圍是±20º。除非另有規(guī)定，系統(tǒng)適應(yīng)性參數(shù)由待測物峰的數(shù)據(jù)計算、樣品的Rr，RF，tR實測值應(yīng)與對照品的實測值一致，文件中給的相對保留時間值是為了方便峰的指認(rèn)，對于相對保留時間沒有評判標(biāo)準(zhǔn)。適應(yīng)性測試時為了確保

9、最終操作結(jié)果的有效性。實驗過程中為確保系統(tǒng)適應(yīng)性，進樣前應(yīng)做適當(dāng)?shù)臏?zhǔn)備工作。配置待測溶液時，溶液中包括一定量的待測物和一些其它物質(zhì)（如藥品輔料或者雜質(zhì)）。當(dāng)色譜系統(tǒng)有顯著變化時，或者要用特殊試劑，則要重新做系統(tǒng)適應(yīng)性實驗，否則不能進行樣品分析。色譜分離技術(shù)色譜分離技術(shù)是一種多級分離方法，樣品在固定相和流動相之間多次分配，達到動態(tài)平衡。固定相一般是附在硅膠或者其它固體載體上的固體或液體，可填充在層析柱上或鋪在薄層版/薄膜上，流動相可以是氣體、液體或者超臨界流體。分離原理包括吸附色譜、分配色譜、離子交換色譜、分子排阻色譜等，也可根據(jù)樣品分子的大小、空間體積、質(zhì)量等物理化學(xué)性質(zhì)來分離。本章介紹了系統(tǒng)

10、適應(yīng)性測試涉及的參數(shù)定義及計算方法，分析方法和儀器介紹等已分別在以下章節(jié)做了介紹:l 紙色譜l 薄層色譜l 氣相色譜l 液相色譜l 排阻色譜l 超臨界流體色譜定義下面分別介紹系統(tǒng)適應(yīng)性和驗收標(biāo)準(zhǔn)的相關(guān)參數(shù)定義。有些儀器的軟件系統(tǒng)包含了一些特定參數(shù)的計算方法（例如性噪比、分離度）。操作人員有責(zé)任確認(rèn)該計算方法是否符合歐洲藥典要求，如果有差別，應(yīng)對該方法做適當(dāng)調(diào)整以符合藥典規(guī)定。色譜圖反應(yīng)檢測器的響應(yīng)信號、洗脫劑濃度或體積與時間的關(guān)系等。理想的色譜圖是在平穩(wěn)的基線上各色譜峰彼此分離，呈高斯分布。色譜峰色譜柱中洗脫的單個組分或者未分離的多個組分在檢測器上的響應(yīng)信號，是色譜圖的一部分。一般用峰面積、峰

11、高h和半高峰寬wh、峰高h和峰寬wi等參數(shù)來描述色譜峰。高斯峰有如下關(guān)系(圖2.2.46-1)：wh = 1.18wi保留時間tR組分從進樣到出現(xiàn)最大峰所需時間保留體積VR組分從進樣到出現(xiàn)最大峰所需的流動相體積，可用保留時間乘以流速F。VR = tR × F死時間tM不被固定相滯留的組分，從進樣到出現(xiàn)最大峰所需時間死體積VM不被固定相滯留的組分，從進樣到出現(xiàn)最大峰所需流動相體積。VM = tM × F排阻色譜中用Vo表示（見下面）。保留因子k有時用容量因子k或者分配比Dm表示，計算公式如下：K = 固定相中的組分量流動相中的組分量 = kcVSVMKc表示分配常數(shù)，也叫平衡

12、分配系數(shù)Vs表示固定相體積VM表示流動相體積在色譜系統(tǒng)中某組分的保留因子也可按下式計算：K = tR-tMtM流動相總時間tt，當(dāng)組分粒徑小于固定相膠體孔徑的最小尺寸時，該組分從進樣到出現(xiàn)最大峰所需時間（圖）流動相總體積Vt，當(dāng)組分粒徑小于固定相膠體孔徑的最小尺寸時，該組分從進樣到出現(xiàn)最大峰所需流動相體積，可按下式計算Vt = tt×F滯留時間t0：當(dāng)組分粒徑大于固定相膠體孔徑的最大尺寸時，該組分從進樣到出現(xiàn)最大峰所需時間滯留體積V0：當(dāng)組分粒徑大于固定相膠體孔徑的最大尺寸時，該組分從進樣到出現(xiàn)最大峰所需體積，可按下式計算V0 = t0×F分配常數(shù)k0：表示排阻色譜中某一組

13、分的洗脫能力，也叫分配系數(shù)，可用下式計算：K0 = tR-t0tt-t0滯留因子RF：在平面色譜中也叫保留因子Rf，表示組分在板上的點到原點之間的距離與溶劑前沿到原點的距離的比值（圖）。Rf=baB是分析物的移動距離A是溶劑前沿的移動距離塔板數(shù)N：可反映柱效，又叫理論塔板數(shù)，計算公式如下：N = 5.54(tRwh)2tR是組分的保留時間，wh是該物質(zhì)的半高峰寬色譜柱類型、柱溫、流動相以及化合物類型都會影響理論塔板數(shù)的值滯后體積D：也叫梯度延遲體積，指從流動相混合點至柱頭的系統(tǒng)體積，可用以下方法計算：色譜柱：用適當(dāng)?shù)拿毠埽ㄈ? m×0.12 mm）代替流動相：A相是水，B相是0.1

14、%（V/V）的丙酮水流速F：能達到足夠的反壓為準(zhǔn)（如2ml/min）時間minA相體積百分比B相體積百分比0-201000010020-300100檢測器：檢測波長265 nm記錄吸光度到達最大值的50%時的時間t0.5（圖）D = tD×FtD = t0.5-tG，tG預(yù)設(shè)為20 minF為流速，單位為ml/min對稱因子A色譜峰的對稱因子（圖）按下式計算As = w0.052dW0.05表示在二十分之一峰高處峰寬d表示二十分之一峰高處到峰頂點投射到水平線之間的距離As值為1表示峰絕對對稱，大于1則為拖尾峰，小于1則為前置峰分離度Rs兩組分之間的分離度（）計算公式如下Rs = 1.

15、18tR2-tR1wh1+wh2tR2 > tR1tR1和tR2是色譜峰的保留時間wh1和wh2是半高峰寬在定量平面色譜中，用移動距離代替保留時間來計算兩組分之間的分離度，計算公式如下：Rs = 1.18aRF2-RF1wh1+wh2RF1和RF2是色譜峰的阻滯因子wh1和wh2是半高峰寬a是溶劑前沿到基線的距離峰谷比（p/v）做有關(guān)物質(zhì)的系統(tǒng)適應(yīng)性測試時，如果兩峰之間的基線分離效果不好，可以用峰谷比作為評價依據(jù)（圖）。p/v = p/vHpHvHp表示基線以上最小峰的最高點到基線的距離Hv表示基線以上最小峰和主峰之間的最低點到基線的距離相對保留因子r相對保留因子的計算公式如下：r =

16、tRi-tMtRst+tMtRi表示待測峰的保留時間tRst表示參照峰的保留時間tM表示滯留時間未調(diào)整相對保留因子rG計算公式如下：rG = tRitRst除非另有規(guī)定，相對保留因子和未調(diào)整的相對保留因子的值基本一致在平面色譜中，用滯留因子RFst和RFi代替保留時間tRst和tRi信噪比（S/N）小的噪音峰會影響定量分析的精密度。信噪比計算公式如下：S/N = 2HhH表示組分的峰高，在參比溶液的色譜圖中，測量從信號峰的最高點到基線之間的距離。該信號峰的峰寬至少大于半高峰寬的5倍（圖）。h表示色譜圖中噪音峰的最高點到最低點之間的距離系統(tǒng)重現(xiàn)性系統(tǒng)重復(fù)性表示至少連續(xù)進樣三次后，所得相對標(biāo)準(zhǔn)偏差

17、的百分?jǐn)?shù)。計算公式如下：sr（%）= 100y(yi-y)2n-1yi表示內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)方法中的峰面積、峰高或者面積比的值y表示平均值n表示值的個數(shù)系統(tǒng)適應(yīng)性用于測試的成分應(yīng)該明確，能滿足系統(tǒng)性能和含量測定的要求。系統(tǒng)適應(yīng)性測試反映了色譜系統(tǒng)的性能，是建立分析方法不可或缺的一部分。柱效、保留因子、分離度、相對保留因子和對稱因子等參數(shù)用來描述柱子的性能。這些參數(shù)可能從以下方面影響色譜行為：­ 流動相的組成、離子強度、溫度和pH值­ 流速、色譜柱尺寸、柱溫和柱壓­ 固定相特性，包括填充劑類型、填充劑粒徑、孔徑、比表面積­ 反相材料類型或者對固定相表面進行其它的結(jié)構(gòu)

18、修飾除非另有規(guī)定，還需滿足以下要求：­ 在相關(guān)物質(zhì)測定或含量測定中，用于定量的參照色譜峰，其對稱因子取值范圍必須在0.8到1.5之間­ 如果某成分的純度為100%，則可容許的參比溶液的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差最大值計算公式如下：sr（%）max = KBnt90%，n-1K是常數(shù)0.349，由公式K = 0.62×t90%,56計算而來，0.62表示當(dāng)B = 1.0時，六次進樣后的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差百分?jǐn)?shù)B表示方法中規(guī)定的含量上限減去100%n表示進樣次數(shù)（3n6）t90%, n-1表示雙側(cè)檢驗、置信度為90%、自由度為n-1時的t值除非另有規(guī)定，可允許的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差最大值不能超過

19、下表（表）的值，此規(guī)定不適用于有關(guān)物質(zhì)測試。表2.2.46-1 重復(fù)性要求進樣次數(shù)3456B（%）最大容許標(biāo)準(zhǔn)偏差2.00.410.590.730.852.50.520.310921.063.00.620.891.101.27測試有關(guān)物質(zhì)時，定量限度與此表相等或小于表中數(shù)值測試員要根據(jù)一些致變因素來選擇合適的方案驗證色譜系統(tǒng)，以保證在測試過程中色譜系統(tǒng)的適應(yīng)性不受影響。色譜條件的調(diào)整為滿足系統(tǒng)適應(yīng)性，在不對分析方法做根本改變的情況下，可對色譜參數(shù)做適當(dāng)調(diào)整。在梯度洗脫時，改變洗脫條件會導(dǎo)致基線漂移，不利于色譜峰的劃分識別，甚至?xí)霈F(xiàn)假峰和延長洗脫時間。因此要改變梯度洗脫的條件時，需重新驗證方法

20、的有效性。系統(tǒng)適應(yīng)性是定性分析或含量測定結(jié)果的有效保障。市售液相色譜柱的固定相材料類型多樣，可滿足不同色譜行為需要，為滿足系統(tǒng)適應(yīng)性要求，可對色譜條件做適當(dāng)調(diào)整。但是在反相色譜系統(tǒng)中，調(diào)整色譜參數(shù)不能總是達到既定要求，這時可選擇替換色譜柱。網(wǎng)站EDQM上有各種柱子的性能信息，可根據(jù)分析需要選擇合適的色譜柱。一般文件會明確規(guī)定一些重要參數(shù)以滿足系統(tǒng)適應(yīng)性。薄層色譜和紙色譜展開劑的組成：對其中較少的組分，調(diào)整范圍為相對差值±30%或絕對差值±2%，可選其中較大的一種，但任何組分的絕對差值不得超過±10%。例如含量為10%的組分，按相對差值±30%計算其可調(diào)范

21、圍在7%-13%，按絕對差值±2%計算可調(diào)范圍在8%-12%，固可按相對差值計算的范圍來調(diào)整。假如一組分含量為5%，按相對差值計算其可調(diào)范圍在3.5-6.5%，按絕對差值計算其可調(diào)范圍在3-7%，此時可按絕對差值范圍調(diào)整，但是改變范圍絕對不能超過10%。除非另有規(guī)定，流動相水相pH值可調(diào)范圍在±0.2個單位，非離子溶劑可調(diào)范圍在±1個單位。緩沖溶液中的鹽濃度可調(diào)范圍在±10%。點樣體積：如果薄層板或?qū)游黾埖牧６攘己茫?-10m），點樣體積可為規(guī)定的10-20%液相色譜：等度洗脫流動相組成：對其中較少的組分，調(diào)整范圍為相對差值±30%或絕對差值&

22、#177;2%，可選其中較大的一種，但任何組分的絕對差值不得超過±10%。除非另有規(guī)定，流動相水相pH值可調(diào)范圍在±0.2個單位，非離子溶劑可調(diào)范圍在±1個單位。緩沖溶液中的鹽濃度可調(diào)范圍在±10%。流速：一般可在±50%范圍內(nèi)調(diào)整，如果改用大尺寸的柱子，調(diào)整范圍可適當(dāng)加大。色譜柱參數(shù)固定相：­ 不能改變固定相填料類型（例如不能用C8柱替換C18柱）­ 粒徑：最多可將粒徑減小到原來的50%，但是不能增加填料粒徑色譜柱尺寸：­ 長度：可調(diào)范圍±50%­ 內(nèi)徑：可調(diào)范圍±25%如果色譜柱尺

23、寸改變，流速也需按以下公式做適當(dāng)調(diào)整：F2 = F1l2d22l1d12F1：方法中規(guī)定的流速，單位ml/minF2：改變后的流速，單位ml/minl1：方法中規(guī)定的柱長，單位mml2：改變后的柱長，單位mmd1：方法中規(guī)定的柱內(nèi)徑，單位mmd2：改變后的柱內(nèi)徑，單位mm柱溫：±10，除非另有說明，操作時的柱溫需明確規(guī)定檢測波長：不能改變進樣體積：在滿足檢測限和重現(xiàn)性的情況下可減少進樣體積，但不能增加進樣體積液相色譜：梯度洗脫梯度洗脫不像等度洗脫，要改變洗脫條件的話需要慎重考慮流動相：只有在滿足下列條件時才可對流動相組成做微小調(diào)整：­ 滿足系統(tǒng)適應(yīng)性要求­ 主峰的

24、洗脫時間改變范圍不超過方法中規(guī)定的±15%­ 改變后的流動相洗脫能力不能比方法中規(guī)定的差如果改變條件不能滿足系統(tǒng)適應(yīng)性要求，則需考慮滯留體積和換色譜柱滯留體積：實驗儀器的布局能顯著改變分離度、保留時間和相對保留時間等。如有此情況，可能是滯留體積過大。在開始梯度洗脫程序之前，會有一段等度洗脫過程。考慮到規(guī)定的方法與實際使用方法中的滯留體積有差異，可在等度洗脫時調(diào)整開始梯度洗脫的時間。測試員有責(zé)任使等度洗脫時間適應(yīng)所用的分析儀器。如果方法中規(guī)定了滯留體積，梯度洗脫的開始時間可根據(jù)下面公式換成實際開始時間：tc = t-D-D0FD：滯留體積，單位mlD0：實際滯留體積，單位ml

25、F：流速，單位ml/min如果沒有等度洗脫這個步驟也不影響數(shù)據(jù)的有效性，那么此步驟可以省略流動相pH，不能改變緩沖液鹽濃度：不能改變流速：色譜柱尺寸改變時可改變流速（公式見前面）色譜柱參數(shù)固定相：­ 不能改變填料類型­ 不能改變粒徑大小色譜柱尺寸：­ 長度：可調(diào)范圍±70%­ 內(nèi)徑：可調(diào)范圍±25%如果色譜柱尺寸改變，流速也需按以下公式做適當(dāng)調(diào)整：F2 = F1l2d22l1d12F1：方法中規(guī)定的流速，單位ml/minF2：改變后的流速，單位ml/minl1：方法中規(guī)定的柱長，單位mml2：改變后的柱長，單位mmd1：方法中規(guī)定的柱

26、內(nèi)徑，單位mmd2：改變后的柱內(nèi)徑，單位mm柱溫：±5，除非另有說明，操作時的柱溫需明確規(guī)定檢測波長：不能改變進樣體積：在滿足檢測限和重現(xiàn)性的情況下可減少進樣體積，但不能增加進樣體積氣相色譜色譜柱參數(shù)固定相：­ 粒徑：(填充柱)最多可減少50%，不能增大粒徑尺寸­ 薄膜厚度：(毛細管柱)可調(diào)范圍從-50%到+100%色譜柱尺寸：­ 長度：可調(diào)范圍±70%­ 內(nèi)徑：可調(diào)范圍±50%流速：±50%柱溫：±10%進樣體積和分流體積：在滿足檢測限和重現(xiàn)性的情況下可做適當(dāng)調(diào)整超臨界流體色譜流動相組成：填充色譜中，對其中較少的組分，調(diào)整范圍為相對差值±30%或絕對差值±2%，可選其中較大的一種，但是毛細管色譜系統(tǒng)不能