血管內皮細胞體外三維培養(yǎng)方法的比較

1、血管內皮細胞體外三維培養(yǎng)方法的比較         【摘要】  目的比較不同方法進行臍靜脈內皮細胞體外三維培養(yǎng)形成三維血管狀結構的差異。方法采用表面培養(yǎng)法與混合培養(yǎng)法行臍靜脈內皮細胞體外三維培養(yǎng),觀察形成的三維管網狀結構。結果表面培養(yǎng)法:細胞生長快,管狀結構形成多,細胞分支連接形成復雜的三維網狀結構;混合培養(yǎng)法:細胞生長緩慢,管狀結構形成少,出現(xiàn)細胞連接形成的細胞索與三維網狀結構數量較少。兩種培養(yǎng)方法形成的血管樣結構的數量與長度明顯不同。結論表面培養(yǎng)法體外血管三維培養(yǎng),具有操作簡便、細胞生長快、三維血管結

2、構形成數量多、血管網絡結構復雜等特點,適用于血管生成影響因素的實驗研究。 【關鍵詞】  內皮細胞 內皮 血管 細胞 培養(yǎng)的 臍靜脈 新生血管化 病理性   血管生成即由原有血管出芽生長形成新生血管的過程。對于許多生理性過程(如胚胎發(fā)育、創(chuàng)傷修復)以及病理性過程(如動脈硬化、腫瘤發(fā)生),尤其是在腫瘤的發(fā)生發(fā)展與侵襲轉移等的一系列病理過程中,新生血管起了相當重要的作用1。新生的毛細血管既為腫瘤生長提供營養(yǎng),又為腫瘤轉移準備條件。體外血管三維培養(yǎng)方法可使細胞呈立體生長,更接近于體內生長模式,為血管生長模擬了類似于體內的三維空間,誘導細胞出芽、增生、遷移或分化等一系列變化

3、,對于評估各種因素對血管生成的影響具有實際應用價值。筆者采用表面培養(yǎng)法和混合培養(yǎng)法,在三維凝膠培養(yǎng)基中進行臍靜脈內皮細胞的體外三維培養(yǎng),比較二種體外培養(yǎng)方法在形成三維血管結構的長度和數量,以及形成血管網的復雜性等方面的差異,為針對腫瘤性血管生成的腫瘤治療方法提供實驗方法學方面的依據。   1材料與方法   1.1材料主要試劑:DMEM高糖培養(yǎng)基、PBS緩沖液與0.25%胰蛋白酶(美國 Gibco公司),克隆胎牛血清(FBS,奧地利 PAA公司),支原體抗生素Plasmocin(美國 Invivogen公司),內皮生長支持物(ECGS,美國 Sigma公司

4、),抗第因子抗體、抗CD31抗體、抗CD34抗體及相關抗原免疫染色試劑(美國 Santa Cruz公司),三維細胞培養(yǎng)基試劑盒(美國 Chemicon公司),青霉素、鏈霉素、兩性霉素(華北制藥集團)。主要儀器:水套式CO2培養(yǎng)箱(3110型,美國 Thermo Forma公司),倒置相差顯微鏡(71型,日本 Olympus公司),低速冷凍大容量離心機(DL4000B型,上海安亭科學儀器廠),垂直流超凈工作臺(江蘇蘇凈集團安泰公司)。   1.2方法   1.2.1人臍靜脈內皮細胞分離、培養(yǎng)與鑒定酶灌注法分離人臍靜脈內皮細胞:健康產婦分娩后立即無菌操作取新

5、生兒臍帶20 cm左右,以含有適量青霉素、鏈霉素、兩性霉素的PBS沖洗臍靜脈腔,向臍靜脈腔內灌注0.25%胰酶,至臍靜脈充盈,以血管鉗夾閉臍靜脈腔,37 孵育7 min。PBS沖洗臍靜脈腔并收集流出液,FBS終止胰蛋白酶的消化作用,離心收集細胞,加入含20%FBS及適量青霉素、鏈霉素、兩性霉素的DMEM培養(yǎng)基,37 培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng),24 h后更換培養(yǎng)基,去除未貼壁的懸浮細胞。隔天更換培養(yǎng)基,至貼壁細胞70%80%融合時,消化傳代,取34代用于三維培養(yǎng)。   1.2.2三維培養(yǎng)膠原溶液制備按照試劑盒說明書,在無菌EP管中加入膠原溶液2 mL,然后加入5×DMEM

6、0.5 mL,小心混勻,避免產生氣泡,加入平衡液25 L,混勻,并將配制好的膠原溶液置于冰上備用。   1.2.3臍靜脈內皮細胞體外三維培養(yǎng)   1.2.3.1表面培養(yǎng)法向96孔培養(yǎng)板的每一個培養(yǎng)孔內加入配制好的膠原凝膠溶液100 L,立即將培養(yǎng)板置37 培養(yǎng)箱溫育60 min,使膠原溶液聚合形成固體凝膠。將培養(yǎng)傳代34代的臍靜脈內皮細胞自培養(yǎng)瓶壁消化,并反復吹打形成單細胞懸液。將臍靜脈內皮細胞以每孔約5×104的密度接種于膠原凝膠表面。1 h后倒置相差顯微鏡下觀察凝膠表面的細胞生長狀況,待細胞貼壁達到70%80%融合時,更換培養(yǎng)基為DMEM+

7、20%FBS+ECGS 200 g/mL。培養(yǎng)24 h后,倒置相差顯微鏡下每個培養(yǎng)孔隨機選擇若干個視野,記錄每個視野   A:表面培養(yǎng)法; B:混合培養(yǎng)法; 1:接種12 h(×200); 2:接種24 h(×200); 3:接種24 h凝膠垂直切片(HE×100).   A1:內皮細胞遷移連接,形成細胞索樣結構,數量較多,出現(xiàn)連接溝通; A2:細胞索樣結構趨復雜,細胞索分支溝通連接形成復雜的網狀結構; A3:,內皮細胞索形成管網狀結構. B1:細胞索樣結構數量較少; B2:細胞索數量與網絡分支較少; B3:少量細胞索結構,

8、罕見血管網結構.   下生長的內皮細胞管的長度和管狀結構數目;而后將膠原凝膠進行4甲醛固定、脫水、石蠟包埋、切片等一系列處理,顯微鏡下觀察臍靜脈內皮細胞在膠原凝膠中的生長情況。   1.2.3.2混合培養(yǎng)法將培養(yǎng)傳代34代的臍靜脈內皮細胞自培養(yǎng)瓶壁消化,吹打形成單細胞懸液。將臍靜脈內皮細胞以1×106 mL-1的濃度與膠原溶液混合,小心吹打,形成單細胞懸液,避免產生氣泡。向96孔培養(yǎng)板的每個孔內滴加臍靜脈內皮細胞膠原溶液混合液100 L,避免產生氣泡。立即將培養(yǎng)板置37 培養(yǎng)箱60 min,使膠原溶液聚合形成固體凝膠。向凝膠表面添加培養(yǎng)基DME

9、M+20%FBS+ECGS 200 g/mL。后續(xù)步驟同1.2.3.1。   1.2.4統(tǒng)計學處理數據以x±s表示,采用PEMS 3.1統(tǒng)計軟件進行兩獨立樣本均數比較。            2結果   2.1細胞鑒定取少許貼壁生長細胞作免疫組織化學染色鑒定,CD31、CD34、因子染色均為陽性,證實該細胞為臍靜脈內皮細胞(圖1)。   2.2形態(tài)學觀察   2.2.1表面培養(yǎng)法接種1 h后臍靜脈內皮細胞在

10、膠原凝膠表面發(fā)生融合生長,逐漸從凝膠表面向凝膠內遷移,最早于接種6 h后即可觀察到少量由細胞遷移連接形成的細胞索結構,12 h后細胞索結構數量增多,并且相互之間出現(xiàn)連接溝通,隨著時間推移,細胞索結構越趨復雜,24 h左右細胞索的分支之間相互溝通連接形成復雜的網狀結構,3 d后凝膠內細胞仍生長旺盛。將培養(yǎng)24 h膠原凝膠固定包埋切片,光學顯微鏡下可見內皮細胞索形成的血管狀結構。   2.2.2混合培養(yǎng)法細胞在凝膠內生長,12 h后可觀察到由內皮細胞連接形成的細胞索結構,但數量較少,24 h左右細胞索分支間相互溝通連接形成網絡狀結構,與表面培養(yǎng)法形成的網絡狀結構相比,細胞索數量

11、較少,網絡分支也較少,48 h左右凝膠內的細胞逐漸出現(xiàn)凋亡現(xiàn)象,血管分支結構漸崩解。將培養(yǎng)24 h的膠原凝膠固定包埋切片,光學顯微鏡下可見由內皮細胞連接形成的細胞索結構,而由細胞索溝通連接形成的血管網結構相對少見(圖2)。   2.3血管樣結構長度和數量表面培養(yǎng)法與混合培養(yǎng)法分別培養(yǎng)24 h后,前者形成的血管樣結構的長度和數量為(2.06±0.29)mm和(11.43±1.43),后者為(1.18±0.11)mm和(5.42±0.77),差別均有統(tǒng)計學意義(P0.05)。   3討論   內皮細

12、胞在三維培養(yǎng)體系與二維培養(yǎng)體系中的生物學行為存在顯著差異,三維培養(yǎng)體系中內皮細胞的生長更類似于體內血管生成。血管生成對于許多生理性過程和病理性過程,尤其是在腫瘤的發(fā)生發(fā)展與侵襲轉移等一系列病理過程中,具有相當重要的作用。內皮細胞體外三維培養(yǎng)方法多種多樣,國內外學者經過20余年的研究,發(fā)展出了表面培養(yǎng)法、混合培養(yǎng)法、微載體培養(yǎng)法以及基質內細胞聚集體侵襲法(RIMAC)、磁標記法等方法37,并且應用這些方法,在血管生成促進因子、抑制因子以及各種血管生成影響因素等方面進行大量的研究。   本研究比較表面培養(yǎng)法與混合培養(yǎng)法臍靜脈內皮細胞體外三維培養(yǎng),兩種培養(yǎng)方法均能在膠原凝膠中觀察

13、到細胞索樣結構以及由細胞索連接形成的復雜管網樣結構,但使用前者最早于培養(yǎng)6 h可以觀察到細胞索結構,同時在膠原凝膠中形成三維管狀結構的數量明顯多于后者,長度明顯大于后者,且所形成的管狀結構的復雜性更甚于后者。在實驗操作方面,表面培養(yǎng)法將內皮細胞接種于已凝固的膠原凝膠表面,操作過程簡便易行,不必將細胞混懸于膠原溶液中,避免了因混懸內皮細胞而出現(xiàn)的凝膠氣泡的現(xiàn)象,同時避免了由于實驗操作機械損傷內皮細胞而降低細胞活力,因此不影響細胞在三維凝膠中的伸展、遷移等一系列生物學過程,不影響實驗結果的觀察,具有操作簡便、方便觀察等特點。   與混合培養(yǎng)法相比較,表面培養(yǎng)法在內皮細胞的體外三

14、維培養(yǎng)方面還具有管狀結構數量多、結構復雜、細胞生存期長等特點,更適用于對血管生成促進因子、抑制因子以及各種血管生成影響因素等方面的研究?！緟⒖嘉墨I】  “1“Ucuzian A A, Greisler H P. In vitro models of angiogenesis“J“. World J Surg, 2007,31(4):654663.“2“Martins G G,Kolega J. Endothelial cell protrusion and migration in threedimensional collagen matrices“J“. Cell Motil C

15、ytoskeleton, 2006,63(2):101115.“3“Cavallaro U,Tenan M,Castelli V,et al Response of bovine endothelial cells to FGF2 and VEGF is dependent on their site of origin: Relevance to the regulation of angiogenesis“J“. J Cell Biochem, 2001,82(4):619633.“4“Satake S,Kuzuya M,Ramos M A,et al. Angiogenic stimul

16、i are essential for survival of vascular endothelial cells in threedimensional collagen lattice“J“. Biochem Biophys Res Commun, 1998,244(3):642646.“5“Sun X T,Ding Y T,Yan X G,et al Angiogenic synergistic effect of basic fibroblast growth factor and vascular endothelial growth factor in an in vitro quantitative microcarrierbased threedimensional fibrin angiogenesis system“J“. World J Gastroenterol, 2004,10(17):25242528.“6“Xue L,Greisler H P. Angiogenic effect of fibroblast growth factor1 and vascular endothelial growth factor and their synergism in a novel in vitro quantitative fib