大電導(dǎo)鈣激活鉀通道β1亞基與子癇前期的相關(guān)性研究

1、描述：目的：探討胎盤組織和子宮平滑肌組織中大電導(dǎo)鈣激活鉀通道1亞基（KCNM 1）的表達(dá)，及其與子癇前期發(fā)病的關(guān)系。方法：輕、重度子癇前期組（研究組）和正常孕婦組（對(duì)照組）孕婦的胎盤組織及子宮平滑肌組織.【摘要】 目的：探討胎盤組織和子宮平滑肌組織中大電導(dǎo)鈣激活鉀通道1亞基（KCNM 1）的表達(dá)，及其與子癇前期發(fā)病的關(guān)系。方法：輕、重度子癇前期組（研究組）和正常孕婦組（對(duì)照組）孕婦的胎盤組織及子宮平滑肌組織中KCNM l mRNA的表達(dá)通過熒光定量PCR技術(shù)檢測。采用ELISA法檢測三組孕婦血清KCNM l濃度變化水平。結(jié)果：各研究組中孕婦血清的KCNM l水平、胎盤組織及子宮平滑肌

2、中KCNM l mRNA表達(dá)水平均明顯低于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；而輕、重度子癇前期組比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。結(jié) 論：孕婦血清中KCNM l表達(dá)降低，胎盤組織和子宮平滑肌中KCNM l mRNA的表達(dá)降低與子癇前期的發(fā)病密切相關(guān)，可能參與了子癇前期的病理生理過程。子癇前期是妊娠期高血壓疾病最常見的類型，其發(fā)病率為5%10%，其導(dǎo)致孕產(chǎn)婦的死亡總數(shù)僅次于產(chǎn)后出血和羊水栓塞。目前妊娠期高血壓疾病 至今病因不明，有研究將高血壓病視為一種細(xì)胞膜疾病，高血壓的產(chǎn)生是由于大電導(dǎo)鈣激活鉀通道（high-conductance calcium activated

3、 potassium channels，BKca）的缺陷，不能反饋相應(yīng)代償作用，而導(dǎo)致動(dòng)脈平滑肌膜電位極化障礙，使血管緊張性增高，促進(jìn)高血壓的產(chǎn)生。大電導(dǎo)鈣激活 鉀通道1亞基（KCNM 1）與子癇前期的相關(guān)性目前國內(nèi)外均無研究，本研究通過孕婦血清中KCNM l的表達(dá)及胎盤組織和子宮平滑肌中KCNM l mRNA的表達(dá)，探討KCNM l與子癇前期發(fā)病的關(guān)系。1 資料與方法1.1 一般資料 選擇2012年2月-2013年2月在本院剖宮產(chǎn)分娩的輕、重度子癇前期孕婦為研究組，輕、重度組各19例；選取同期正常妊娠孕婦20例為對(duì)照組。子癇前 期的診斷標(biāo)準(zhǔn)參照豐有吉主編的第7版8年制婦產(chǎn)科學(xué)。研究組患者均符

4、合以下條件：（1）產(chǎn)婦年齡在2634歲之間；（2）無高血壓病史及家族 史。對(duì)照組患者均符合以下條件：（1）產(chǎn)婦年齡在2434歲之間；（2）無高血壓疾病家族史；（3）妊娠期間血壓監(jiān)測記錄一直保持在正常范圍，即 BP<140/90 mm Hg。本次妊娠均為單胎，研究組的孕婦既往無高血壓病及慢性腎炎病史。兩組孕婦的年齡、分娩孕周比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），具有可比 性。所有孕婦在研究前均簽署知情同意書，并經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)實(shí)施。1.2 試劑和實(shí)驗(yàn)方法1.2.1 主要試劑及儀器 Total RNA提取試劑（Trizol）和熒光定量PCR試劑盒均購自日本Takara公司，DNA

5、Maker購自北京百泰克生物有限公司，GelRed熒光核酸染色試劑（Unired）購自美國 Biotium公司。KCNM l引物由上海生工生物工程有限公司合成，酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA試劑盒）購自青島浩賽科技有限公司，所有標(biāo)本同批測定，批內(nèi)變異<6%。上 海瑞儀公司PCR擴(kuò)增儀。德國Eppendorf公司常溫微量離心機(jī)。 1.2.2 標(biāo)本采集 術(shù)前抽取所有孕婦空腹靜脈血并分離血清保存，以檢測血清中KCNMl的濃度。剖宮產(chǎn)術(shù)中取胎盤組織約2 cm×2 cm×2 cm大小，再取一塊子宮平滑肌各約1 cm×1 cm×1 cm大小，分別置于E

6、P管中，冷凍保存以提取RNA。1.2.3 實(shí)驗(yàn)方法 （1）血清KCNM l測定：采用ELISIA法，于回歸方程上計(jì)算所測樣本的OD值所對(duì)應(yīng)的樣品濃度。所有標(biāo)本同批測定，批內(nèi)變異<6%。（2）子宮平滑肌組織和胎 盤組織中的KCNMl mRNA的提取及測定：所取到的組織通過熒光定量PCR法測定總RNA，嚴(yán)格按照試劑盒操作進(jìn)行檢測。取波長260 nm及280 nm的紫外分光光度計(jì)檢測總RNA樣品的純度及濃度，并稀釋后經(jīng)l.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，紫外線下得到完整的5S、18S及28S三條RNA條帶。 （3）熒光定量PCR：PCR引物參考國內(nèi)外的相關(guān)文獻(xiàn)，設(shè)計(jì)KCNM l的PCR引物序列，并與G

7、ene Bank中的基因譜一一核對(duì)無誤。PCR引物序列及長度見表1。引物稀釋至濃度為20 ?mol/L，在Microtube管中配制反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液（詳見表2），并在PCR儀上進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。按表1.4配制PCR反應(yīng)液，進(jìn)行熒光定量PCR 反應(yīng)。熒光定量PCR反應(yīng)體系：SYBR Primix Ex TaqTM 10 L、上下游引物各0.8 L，超純水6.4 L，cDNA產(chǎn)物2.0 L；PCR擴(kuò)增條件為：（1）預(yù)變性95 、30 s，1個(gè)循環(huán)；（2）95 、5 s，60 、20 s，40個(gè)循環(huán)；（3）95 、0 s，65 、15 s，95 、0 s。熒光定量PCR檢測得到各基因引物的標(biāo)準(zhǔn)曲線和擴(kuò)增效

8、率。電泳結(jié)果用紫外線凝膠自動(dòng)成像分析儀進(jìn)行掃描、分析擴(kuò)增產(chǎn)物的長度和序列，以及擴(kuò)增的特異 性。熒光定量PCR檢測得到各基因引物的標(biāo)準(zhǔn)曲線和擴(kuò)增效率。1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 用SPSS 17.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以（x±s）表示，比較采用t檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。各組織中KCNM l表達(dá)水平采用直線相關(guān)分析法。2 結(jié)果2.1 三組孕婦血清中KCNM l水平的比較 輕度子癇前期組血清KCNMl為（85.02±55.67）pg/mL，重度子癇前期組為（72.32±49.92）pg/mL，對(duì)照組為 （150.13±76.17）pg/

9、mL。輕、重度子癇前期組血清血清KCNM l的表達(dá)結(jié)果與對(duì)照組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=1.51，P<0.05；t=0.43，P<0.05），前兩組間差異也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P<0.05）。2.2 三組孕婦胎盤組織中KCNM l mRNA表達(dá)水平的比較 輕、重度子癇前期組胎盤組織中KCNM l mRNA表達(dá)水平均低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=3.69、17.11，P<0.05）；但輕、重度子癇前期組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （t=2.73，P>0.05），見表3。2.3 三組孕婦子宮平滑肌組織中KCNM l mRNA表達(dá)水平的比較 輕、重度子癇前期組子宮平滑肌中

10、期刊 論文KCNM l mRNA表達(dá)水平均低于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=4.75、t=7.40，P<0.05）；但輕、重度子癇前期組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （t=2.70，P>0.05），見表3。2.4 同組孕婦胎盤與子宮平滑肌組織中KCNM l表達(dá)水平的比較 子宮平滑肌及胎盤組織中血清KCNM l表達(dá)水平采用直線相關(guān)分析法，得出r=0.2。提示各組組織中血清KCNM l表達(dá)水平不相關(guān)。3 討論子癇前期是以妊娠期高血壓和蛋白尿?yàn)橹饕R床特征，其基本病理生理變化是全身小動(dòng)脈痙攣，但其發(fā)病機(jī)制尚未完全明確。血管平滑肌細(xì)胞膜上有很 多密度不同的鉀通道，其中，鈣激活的鉀通道（KCa）

11、廣泛分布于血管平滑肌細(xì)胞，大電導(dǎo)鈣激活鉀通道（BKca）又稱為Maxi-K channel，是其中的一個(gè)亞類。BKCa通道由結(jié)構(gòu)亞單位和調(diào)節(jié)亞單位組成，-亞單位跨膜區(qū)的片段中包含感受細(xì)胞內(nèi)Ca2+變化的胞漿域 （the cytosolic domain，CTD），而CTD其中之一的K+電導(dǎo)調(diào)節(jié)元件（regulator of K conductance，RCK）即RCK1，因其具有高親和力的Ca2+傳感器，與Ca2+結(jié)合后CTD的構(gòu)型重新排列，是人體BKCa通道 Ca2+依賴性激活的基本階段。-亞單位特別是1-亞單位因可調(diào)控通道，而增強(qiáng)-亞單位的功能。BKCa通道功能可因不同組織中1和亞單位表達(dá)

12、 量的不同而表現(xiàn)出組織的特質(zhì)性。相關(guān)研究表明，大腦中的1和亞單位的比例高于身體其他部位，同時(shí)腦血管BKCa通道具有更高的通道開放概率和Ca2+ 敏感性。而當(dāng)1-亞單位下調(diào)時(shí)，BKCa通道的開放概率降低，同時(shí)對(duì)Ca2+的敏感性也降低，動(dòng)脈舒張功能受限，成為高血壓等疾病的病理基礎(chǔ)。平滑肌BKCa通道多表達(dá)1亞基，提高了平滑肌組織的BKCa對(duì)Ca2+的敏感性，是構(gòu)成細(xì)胞復(fù)極化電流的重要鉀離子通道之一。在正常機(jī)體 的生理狀態(tài)下，BKca可因血壓升高而激活，負(fù)反饋調(diào)節(jié)平滑肌收縮，而BKca的超極化可引起血管平滑肌的舒張，微血管的這種舒縮使微循環(huán)血流不會(huì) 隨血管內(nèi)壓變化而有太大的改變。有報(bào)道在KCNM 1

13、基因敲除的小鼠中，其平均動(dòng)脈壓遠(yuǎn)比正常小鼠和亞基因敲除的小鼠高，而且高血壓表現(xiàn)為進(jìn)行性。提示1亞單位在調(diào)節(jié)血壓占主導(dǎo)作用，缺失易產(chǎn)生中度 高血壓。國內(nèi)賀同強(qiáng)等報(bào)道，實(shí)驗(yàn)組妊娠期高血壓病疾病孕婦的胎盤血管平滑肌細(xì)胞的鉀電流密度比正常孕婦組減小，提示胎盤細(xì)胞膜上的鉀通道的改 變與妊高癥的產(chǎn)生具有密不可分的關(guān)聯(lián)。關(guān)于子癇前期孕婦血清及胎盤組織中KCNM l水平變化與高血壓的相關(guān)性尚未明確，本研究發(fā)現(xiàn)子癇前期孕婦血清及胎盤組織中KCNM l表達(dá)均明顯低于正常孕婦，推測血清中KCNM l可能通過上述機(jī)制參與子癇前期高血壓的發(fā)生發(fā)展。胎盤組織可能通過胎盤血管參與這一機(jī)制從而參與子癇前期高血壓的發(fā)生發(fā)展。

14、                           在平滑肌細(xì)胞中，如血管平滑肌、子宮平滑肌等，BKCa通道通過參與膜電位和肌緊張等生理過程而調(diào)節(jié)平滑肌運(yùn)動(dòng)。而子宮平滑肌細(xì)胞的 BKCa通道結(jié)構(gòu)中僅含1亞基，蛋白激酶G（PKG）的磷酸化部位位于1亞單位上，在妊娠期BKCa通道的1亞基隨著分布密度、電壓激活及鈣的敏感 性的改變來調(diào)節(jié)平滑肌的收縮。當(dāng)1亞單位減少，PKG磷酸化減少，而抑制BKCa通道活性，促進(jìn)平滑肌收縮。劉芬等研究結(jié)果表明，敲除1亞單 位進(jìn)行基因，不但BKCa通道的鈣敏感性降低，而且子宮動(dòng)脈的平滑肌張力增加，血壓隨之升高。同時(shí)在孕期由于雌二醇（E2）濃度的不斷增加，子宮平滑肌組 織中的1亞單位的表達(dá)降低。因此可以推測，子宮平滑肌中KCNM l水平的降低，可能導(dǎo)致孕婦高血壓的產(chǎn)生。本研究顯示子癇前期孕婦子宮平滑肌中KCNM l表達(dá)明顯低于正常孕婦，推測子宮平滑肌中KCNM l水平降低是通過以上機(jī)制參