現(xiàn)代分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)原理與技術(shù)

1、現(xiàn)代分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn) 原理與技術(shù)第一章 緒論第一節(jié) 基因操作技術(shù)1.基因操作技術(shù) 基因操作技術(shù)（重組DNA技術(shù)、基因工程）是在DNA水平上闡明生命現(xiàn)象的技術(shù)，包括DNA的“切”、“連”、“擴(kuò)”等。 “切”指限制性內(nèi)切核酸酶切割DNA。 “連”指用DNA連接酶連接兩個(gè)DNA片段。 “擴(kuò)”是指目的DNA在宿主/載體系統(tǒng)中進(jìn)行擴(kuò)增。2.實(shí)驗(yàn)方案（1）基因操作實(shí)驗(yàn)的主要目的有三個(gè)： 分離目的基因，獲取DNA信息； 分析基因結(jié)構(gòu)； 分析基因功能。（2）試驗(yàn)流程設(shè)計(jì)首先，應(yīng)確定使用怎樣的研究方案；其次，根據(jù)試驗(yàn)規(guī)模和研究室情況；最后，根據(jù)研究人員生活規(guī)律確定試驗(yàn)時(shí)間。3.實(shí)驗(yàn)方法 在設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)方法時(shí)應(yīng)考慮 能

2、否達(dá)到實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?是否符合實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)狀； 是否符合自己的喜好。 實(shí)驗(yàn)方法精度愛(ài)好實(shí)驗(yàn)?zāi)康慕?jīng)費(fèi)預(yù)算實(shí)驗(yàn)周期儀器性能準(zhǔn)確性速度確定實(shí)驗(yàn)方法時(shí)應(yīng)考慮的因素4.實(shí)驗(yàn)遵循的原則忠于實(shí)驗(yàn)流程 設(shè)平行對(duì)照實(shí)驗(yàn)關(guān)注實(shí)驗(yàn)要點(diǎn) 準(zhǔn)確的試劑用量準(zhǔn)備充足的實(shí)驗(yàn)材料 數(shù)據(jù)整理注意：第一次實(shí)驗(yàn)成功，第二次實(shí)驗(yàn)馬虎。實(shí)驗(yàn)精度：必須嚴(yán)格按照實(shí)驗(yàn)流程進(jìn)行的操作； 較嚴(yán)格的實(shí)驗(yàn)操作，允許的變動(dòng)； 允許20%變動(dòng)的實(shí)驗(yàn)操作； 不需要特別注意的實(shí)驗(yàn)操作。酶促反應(yīng)不順利時(shí)，若加入更多的酶或DNA，結(jié)果會(huì) 越來(lái)越糟。不設(shè)平行對(duì)照實(shí)驗(yàn)往往是實(shí)驗(yàn)失敗的原因。樣本標(biāo)記的零亂也往往是實(shí)驗(yàn)失敗的重要原因。5.實(shí)驗(yàn)材料的準(zhǔn)備購(gòu)買(mǎi)利用公共服務(wù)機(jī)構(gòu)接受饋

3、贈(zèng) 寫(xiě)求助信要注意： 你需要什么？ 及時(shí)、真實(shí)的將相關(guān)信息告訴對(duì)方，不能隱瞞。 通常向論文通訊作者尋求幫助。 寫(xiě)信的稿紙是印有單位標(biāo)志、名稱、電話號(hào)碼等信息的公函紙。第二節(jié) 實(shí)驗(yàn)室規(guī)則與安全實(shí)驗(yàn)室規(guī)則 保持肅靜 保持整潔 嚴(yán)格操作 注意節(jié)約 保證安全實(shí)驗(yàn)室常識(shí)使用貴重儀器如分析天平、分光光度劑、離心 機(jī)等倍加愛(ài)護(hù)，使用前熟知使用方法，使用時(shí) 嚴(yán)格遵守操作規(guī)程，發(fā)生故障時(shí)，立即關(guān)機(jī)。凡揮發(fā)性、有煙霧、有毒和有氣味的實(shí)驗(yàn)，均 應(yīng)在通風(fēng)柜內(nèi)進(jìn)行。配制試劑時(shí)，應(yīng)對(duì)試劑純度、結(jié)構(gòu)式、分子質(zhì)量等 特性熟悉，做到“有的放矢”。量瓶是量器，不要用量瓶做容器。洗凈器皿應(yīng)倒置架上，使其自然風(fēng)干。實(shí)驗(yàn)室安全實(shí)驗(yàn)室生

4、物安全通用要求查看了解電閘、水閥煤氣總閥門(mén)所在處，離開(kāi)實(shí)驗(yàn)室檢 查是否關(guān)好。使用電器設(shè)備時(shí)嚴(yán)防觸電。使用高溫高壓鍋滅菌時(shí)不得離人。使用可燃物，特別是易燃物，應(yīng)特別小心。凡使用腐蝕性試劑，必須謹(jǐn)慎操作，防止濺出。廢液特別是強(qiáng)酸強(qiáng)堿，應(yīng)稀釋后倒入水池。有毒物品應(yīng)按照實(shí)驗(yàn)室規(guī)定辦理審批手續(xù)后方可領(lǐng)取，使用時(shí)嚴(yán)格操作，用后妥善處理。實(shí)驗(yàn)室急救觸電 關(guān)閉電源； 用干木棍將導(dǎo)線與被害者分開(kāi)； 將被害者移至木板上，與地面分離； 急救者必須做好觸電安全措施，手腳必須絕緣?；馂?zāi) 隔絕氧氣 起火物與水相容：水、濕布、沙土、滅火器等 起火物與水不相容：不可用水燙傷 乙醇消毒，涂2%苦味酸或5%鞣酸，防感染玻璃割傷或

5、其他器械損傷 清理傷口，硼酸水洗凈，涂碘酒，包扎灼傷皮膚 強(qiáng)堿：大量清水稀釋，涂5%硼酸或2%乙酸 強(qiáng)酸、溴：大量清水稀釋，5%NaHCO3或5%氨水煤氣中毒 呼吸新鮮空氣思考題：什么是DNA重組技術(shù)？其實(shí)驗(yàn)的主要目的是 什么？答案試分析有些人工作很辛苦，但總得不出理想實(shí)驗(yàn)結(jié) 果的原因。答案如何獲得你需要的實(shí)驗(yàn)材料（特別是未商品化的材 料）？答案什么是實(shí)驗(yàn)室生物安全通用要求（GB 1948 9-2004）？據(jù)此生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室可分幾級(jí)？答案實(shí)驗(yàn)室發(fā)生火災(zāi)時(shí)該如何處理？燙傷、灼傷時(shí)該如 何處理？答案如何處理對(duì)環(huán)境有污染的試劑？答案第二章 儀器操作與溶液配制 第一節(jié) 常用器皿與儀器1、塑料制品Eppe

6、ndrof 管2、微量移液器（槍）使用方法調(diào)節(jié)時(shí)，自大到小。由小值調(diào)到大值時(shí)，應(yīng)多調(diào)1/3圈，再反調(diào)至設(shè)定值。3、恒溫水浴鍋 多用于酶促反應(yīng)，將Eppendrof管插入浮漂中進(jìn)行反應(yīng)。4、小型離心機(jī) 離心甩干是指短時(shí)間（13s）的離心操作，目的是使附著于管壁的液體沉入管底。5、離心干燥機(jī)目的是使DNA樣品快速干燥。6、旋渦混合器利用不對(duì)稱的旋轉(zhuǎn)將管內(nèi)液體混勻。7、振蕩器 攪拌離心管內(nèi)液體，加速難容物溶解，清洗浸泡于溶液中的不潔器皿。8、真空泵 利用真空吸走液體，作用與離心干燥機(jī)或凝膠干燥機(jī)類似。9、紫外發(fā)光裝置防護(hù)板（貼有起保護(hù)作用的保鮮膜）過(guò)濾板 紫外線可分為短波、中波、長(zhǎng)波等類型，短波光線

7、強(qiáng)，對(duì)DNA損傷大。實(shí)驗(yàn)室一般使用中波，使用時(shí)應(yīng)戴上防護(hù)眼鏡。因燈管和過(guò)濾板有使用壽命，用完后及時(shí)關(guān)閉。10、一次性手套11、紙巾防止危險(xiǎn)試劑沾到手上。防止試劑受到污染。 吸走殘余液體，一般衛(wèi)生紙就可以。 擦拭實(shí)驗(yàn)用品（如玻璃板）時(shí)，要用專用、不帶毛屑的面巾紙。第二節(jié) 溶液1、實(shí)驗(yàn)用水一蒸水：多用于大腸桿菌培養(yǎng)基的制備、電泳緩沖液的配制、器皿的漂洗的實(shí)驗(yàn)。二蒸水：用于生物化學(xué)及組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)。2、儲(chǔ)液3、試劑稱量精度一般稱量精度為3位有效數(shù)字。 4、試劑滅菌 不可高溫高壓滅菌的試劑有： 遇熱易分解的試劑 易揮發(fā)的試劑 有機(jī)溶劑 腐蝕性、刺激性強(qiáng)的試劑。問(wèn)題：1、如何正確使用微量移液器？使用中應(yīng)特

8、別注意哪些事項(xiàng)？2、如何改變微量移液器的移液量？應(yīng)自大調(diào)到小，還是自小調(diào)到大？為什么？答案3、哪些試劑需要高溫高壓滅菌？哪些試劑不能采用高溫高壓滅菌？對(duì)于不能采用高溫高壓方式滅菌的試劑如何滅菌？滅菌后試劑如何保存？是否需要分裝？答案4、分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中，哪些簡(jiǎn)易儀器或裝置可以替代真空泵的作用？答案5、分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中，哪些溶液可以用旋渦混合器混勻？為什么？6、配制培養(yǎng)基時(shí)，通常使用哪種級(jí)別的水？為什么？答案第三章 大腸桿菌培養(yǎng)與保存準(zhǔn)備1）制作平板（稱試劑、溶解、滅菌）2）清潔超凈工作臺(tái)3）配制液體培養(yǎng)基培養(yǎng)平板培養(yǎng)保存穿刺培養(yǎng) 液體小量培養(yǎng)（制作初始菌）DNA擴(kuò)增甘油保存液體大量培養(yǎng)蛋白質(zhì)表

9、達(dá)第一節(jié) 培養(yǎng)前準(zhǔn)備1、大腸桿菌菌株 主要來(lái)自K12，根據(jù)菌體表面糖蛋白成分（O抗原、H抗原、K抗原等）分類。2、培養(yǎng)大腸桿菌所需的物品微量移液器液體培養(yǎng)基槍尖盒1）操作臺(tái)油性記號(hào)筆、小木棒、70%乙醇、涂布棒、接種環(huán)、煤氣燈、牙簽抗生素（-20保存）平板（蓋子朝上），保持干燥2）滅菌方法 高溫高壓滅菌（培養(yǎng)基、試劑、槍尖、小木棒、 牙簽等） 干熱滅菌（玻璃器皿及金屬器皿） 火焰滅菌（試管瓶口、接種環(huán)等） 紫外線滅菌（器械及培養(yǎng)基） 乙醇滅菌（實(shí)驗(yàn)人員手、器械、操作臺(tái)）3）接種工具接種環(huán)用于液體培養(yǎng)基的接種及平板劃線。小木棒用于從平板向液體轉(zhuǎn)接細(xì)菌。牙簽用于從菌落中挑選需要的單菌落。涂布棒用于

10、向平板上涂布液體菌體。固體液體涂布棒小木棒牙簽3、培養(yǎng)基種類1）液體培養(yǎng)基 用于大量繁殖菌株以提取質(zhì)粒DNA或表達(dá)的目的蛋白質(zhì)。2）固體培養(yǎng)基 目的是使菌落增殖到一定大小，以獲取質(zhì)粒斑或分離出單菌落。3）抗生素 配制：A無(wú)菌水溶解抗生素，吸入注射器針筒內(nèi)。 B注射器嘴上安裝微量過(guò)濾器（過(guò)濾滅菌）。 C按每份1ml量分裝到Eppendorf管中， 保存于-20冰箱。使用：在接種前加入到液體培養(yǎng)基中，在配制固體 培養(yǎng)基時(shí)，待滅菌后加入抗生素。4、培養(yǎng)基的配制 1)液體培養(yǎng)基的配制小體積LB培養(yǎng)基的配制（2ml為例） 材料： 試管及瓶塞 藥匙 1L燒杯 攪拌器及攪拌轉(zhuǎn)子 試劑 步驟：胰蛋白酶10g

11、酵母提取物5g 1L燒杯 NaCl 10g加雙蒸水至刻度，用攪拌器混合均勻。用分裝器分裝至試管，每份2ml。高溫高壓滅菌，室溫保存。大體積LB培養(yǎng)基的配制（800ml為例） 材料：藥匙 2L三角瓶 鋁箔紙 電動(dòng)攪拌器及攪拌轉(zhuǎn)子 試劑 步驟：胰蛋白酶8g 酵母提取物4g 三角瓶 NaCl 8g加雙蒸水至800ml，混合均勻。高溫高壓滅菌，室溫保存。2)制作平板 材料：煤氣燈或酒精燈 水平臺(tái)面 1L三角瓶 鋁箔紙 直徑9cm的培養(yǎng)基 藥匙 試劑 瓊脂粉 步驟：胰蛋白酶8g 酵母提取物4g 三角瓶 NaCl 8g 瓊脂粉鋁箔紙封口，混勻，滅菌。待冷卻至60左右，分裝至培養(yǎng)皿。水平臺(tái)上凝固。倒置塑料袋

12、中4保存。注意：1、若需要加入抗生素，待冷卻至60 ，分裝前加入。2、直徑9cm的平皿，每皿25ml為宜。3、盡量縮短平皿開(kāi)蓋時(shí)間，分裝的培養(yǎng)基很快凝固，因此操作要快。4、凝結(jié)在蓋上的水珠可能至污染，故倒轉(zhuǎn)存放。5、氨芐青霉素易失活，添加后的平皿應(yīng)在數(shù)周內(nèi)使用。第二節(jié) 大腸桿菌培養(yǎng) 無(wú)菌操作前用70%乙醇消毒臺(tái)面。 離酒精燈較近距離進(jìn)行無(wú)菌操作。 開(kāi)蓋前和開(kāi)蓋后用酒精燈灼燒瓶口2至3次。 瓶口傾斜，不得垂直向上。 使用平皿時(shí)盡量去除凝結(jié)在蓋子上的水珠，并不 得混淆蓋子。1、培養(yǎng) 1）小量液體培養(yǎng) 材料：接種針或小木棒 煤氣燈 搖床 2mlLB液體培養(yǎng)基 長(zhǎng)有細(xì)菌的平皿 步驟：用接種針接種 燒紅

13、接種針的鉑金絲 輕觸平皿邊緣 挑起一個(gè)菌落 灼燒試管口，開(kāi)蓋 將鉑金絲伸進(jìn)液體培養(yǎng)基 37震蕩過(guò)夜 用小木棒接種 灼燒瓶口，取一根木棒 木棒挑起單菌落 同上2)大量液體培養(yǎng)基材料：煤氣燈 搖床 少量初始菌 8mlLB液體培養(yǎng)基步驟：小量培養(yǎng)數(shù)小時(shí)至過(guò)夜。 稍微打開(kāi)盛有大體積培養(yǎng)液的三角瓶瓶蓋，灼燒瓶口。 打開(kāi)有初始培養(yǎng)菌的試管口，灼燒，將初始培養(yǎng)菌轉(zhuǎn)入大量培養(yǎng)基中，蓋上蓋子，再灼燒瓶口。 37震蕩過(guò)夜。3）菌落測(cè)定在煤氣燈旁用微量移液器吸培養(yǎng)液，轉(zhuǎn)至Eppendrof管。打開(kāi)分光光度計(jì)，調(diào)整波長(zhǎng)至600nm。吸取未接菌的培養(yǎng)基至比色杯中，調(diào)整光吸收值為零。取Eppendrof管內(nèi)的菌液于比色杯

14、中，測(cè)A600值。4）平板培養(yǎng) 劃線培養(yǎng) 材料：接種針、煤氣燈或酒精燈、新的LA平板、菌誘導(dǎo)期對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期平臺(tái)期死亡期結(jié)果：A =0.21.0時(shí)為指數(shù)生長(zhǎng)期，A 1.0為平臺(tái)期。A =1.0為10 個(gè)/ml。8600600600步驟：用煤氣燈將接種針燒紅，輕觸平板一側(cè)，冷卻。用鉑金絲挑去平板上的單菌落，在培養(yǎng)基表面劃線。再灼燒鉑金絲，冷卻。與前面所劃線的一部分交叉劃線，以減少菌數(shù)。重復(fù)上步驟。37倒置培養(yǎng)過(guò)夜。第三節(jié) 大腸桿菌菌株保存1、平板保存 材料：新平板、圓形標(biāo)簽紙、牙簽、封口膜或膠帶、長(zhǎng)有大腸桿菌的初始平皿 步驟：在平板底部貼標(biāo)簽，做標(biāo)記。 用牙簽挑單菌落，接種到平板。 37過(guò)夜后4保存

15、。涂布培養(yǎng) 材料：涂布棒、新的平板、酒精燈或煤氣燈、菌液 步驟：將平板翻轉(zhuǎn)過(guò)來(lái)，置于蓋上，50干燥20至 30分鐘。 取100ul菌液，滴于平板上。 用涂布棒涂布均勻。 37倒置過(guò)夜。3、穿刺保存 材料：含0.7%瓊脂的LB培養(yǎng)基、鉑金絲、封口膜、玻璃瓶。 步驟：玻璃瓶?jī)?nèi)裝2/3培養(yǎng)基，滅菌，冷卻。 接種針火焰滅菌，在培養(yǎng)基中冷卻。 挑取單菌落后刺入培養(yǎng)基底部。 37度下培養(yǎng)12至18小時(shí)。 蓋緊瓶蓋，封口膜封口，室溫避光保存。2、甘油管保存 材料：2ml凍存管、滅菌的80%甘油、封口膜、菌液 步驟：過(guò)夜培養(yǎng)2ml菌液后，取1ml至凍存管。 加入200ul 80%甘油，混勻。 擰緊管帽，用封口

16、膜封口，保存于-70 或-20 。問(wèn)題：1、用于基因克隆的大腸桿菌菌株主要有哪些？它們各自有什么主要特征？2、配制氨芐青霉素等抗生素時(shí)是否需要滅菌？如何滅菌?3、在進(jìn)行大腸桿菌培養(yǎng)時(shí)，何時(shí)需要大量培養(yǎng)？何時(shí)需要小量培養(yǎng)？4、在大腸桿菌培養(yǎng)過(guò)程中，應(yīng)注意哪些問(wèn)題？5、當(dāng)用平板培養(yǎng)大腸桿菌時(shí)，培養(yǎng)皿必須倒置，為什么？6、大腸桿菌的保存方法主要有哪些？第四章 基因操作中的酶學(xué)反應(yīng)第一節(jié) 常用酶的保存注意：1、常規(guī)儲(chǔ)存于-20 ，也有4或8 。2、儲(chǔ)存的冰箱不能選用自動(dòng)除霜類。3、不與通常樣品保存在同一冰箱。4、盡可能在短時(shí)間內(nèi)完成全部操作。5、直接在冰箱內(nèi)吸取需要的酶量。6、可用冰盒或金屬制的冰空盛

17、裝Eppendrof管，以便在冰箱之外吸取酶液。第二節(jié) 限制性內(nèi)切核酸酶1、定義：是一類識(shí)別DNA上38個(gè)特異核苷酸序列，并產(chǎn)生切割反應(yīng)的內(nèi)切核酸酶的總稱。2、修飾酶：與限制性內(nèi)切核酸酶識(shí)別的DNA序列相同，產(chǎn)生修飾反應(yīng)的酶叫修飾酶，主要是甲基化酶。3、限制-修飾系統(tǒng)：限制性內(nèi)切核酸酶對(duì)病毒等外來(lái)DNA起切割反應(yīng)，但自身基因組DNA因修飾酶的修飾作用而不能被切割，這種防御機(jī)制叫1、識(shí)別序列 型限制性內(nèi)切核酸酶的識(shí)別序列長(zhǎng)度通常為48個(gè)核苷酸，對(duì)數(shù)具有對(duì)稱的回文結(jié)構(gòu)。識(shí)別序列越長(zhǎng)，其序列在DNA中出現(xiàn)的概率就越低。4、限制性內(nèi)切酶的命名 EcoR E代表Escherichia屬 co代表coli

18、 種 R代表RY13株 用羅馬數(shù)字區(qū)別不同特異性的酶2、DNA片段的末端結(jié)構(gòu)如如EcoR切割后產(chǎn)生切割后產(chǎn)生5粘性末端：粘性末端：Pst切割后產(chǎn)生切割后產(chǎn)生3粘性末端：粘性末端： 有一些酶沿對(duì)稱軸切斷有一些酶沿對(duì)稱軸切斷DNA，產(chǎn)生平，產(chǎn)生平端或鈍端（端或鈍端（Blunt end）, 如如Sma：3、反應(yīng)條件添加緩沖液濃度：10儲(chǔ)液反應(yīng)最適溫度：37 第三節(jié) 限制性內(nèi)切核酸酶消化DNA實(shí)驗(yàn)1、單個(gè)酶的切割反應(yīng)材料: 37恒溫水浴箱 pBlueScriptSK （DNA） 雙蒸水 EcoR 10H添加緩沖液步驟：按以下順序混合試劑： 雙蒸水 13uL DNA 4uL 10H緩沖液 2uL EcoR 1uL 混勻。 37保溫1小時(shí)。+確認(rèn)酶是否切完全（取14uL進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳）。剩余的反應(yīng)液用于以后的實(shí)驗(yàn)。本實(shí)驗(yàn)中注意：1、酶較昂貴，注意節(jié)約，加樣中可能會(huì)失敗，故最 后添加酶。2、反應(yīng)體系中加入的酶量不能超過(guò)總體積的1/10。（否則將導(dǎo)致第二活力）。3、酶試劑中添加有甘油，應(yīng)適當(dāng)離心后混勻，切忌用旋渦混合器等劇烈震蕩，否則可致酶失活。2、酶切反應(yīng)的注意事項(xiàng)：（1）、DNA純度 混有RNA，不影響酶的反應(yīng)速率，但可減少酶的有效濃度，并在電泳中干擾DNA的觀察。 雜有核酸酶等蛋白質(zhì)，會(huì)干擾酶切反應(yīng)，并影響酶解