不同攻毒劑量對評估H9亞型禽流感疫苗免疫效果的影響.docx

1、第39卷第4期2017年4月Vol.39,No.4Apr.2017中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報ChineseJournalofPreventiveVeterinaryMedicinedoi:10.3969/j.issn.1008-0425.2017.04.11不同攻毒劑量對評估H9亞型禽流感疫苗免疫效果的影響石文軍，曾顯營，臧金凱，吳姣姣，白潔，陳化蘭二田國彬(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸房研究所農(nóng)業(yè)部動物流感重點開放實驗室/獸醫(yī)生物技術(shù)國家重點開放實驗室，黑龍江哈爾濱150069)摘要：為了解不同攻毒劑量對評估H9亞型禽流感疫苗免疫效果的影響，本研究選取禽流感病毒(AIV)CK/HuN/174/08和CK/H

2、uB/S4196/09株制備成滅活疫苗免疫21日齡SPF雞，免疫后采血檢測血凝抑制(HI)抗體，免疫后3周時分別采用這兩株親本病毒經(jīng)鼻腔途徑攻毒。H【抗體測定結(jié)果顯示：兩株疫苗免疫21d時，平均HI抗體滴度均可達(dá)10log2以上，表明這兩株病毒均具有良好的免疫原性。測定每0.1mLCK/HuN/174/08株病毒EID50和CID收稿日期：2016-12-12基金項目：現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系專項資金(CARS-42-G08);國家重點研發(fā)計劃(2016YFD0501602)；科技基礎(chǔ)性工作專項(2013FY113300-8)作者簡介：石文軍(1990-),男，山東青島人，碩士研究生，主要從事禽流

3、感疫苗研究.通信作者：E-mail:tgb；chenhualan分別為10總和IO氣CK/HuB/S4196/09株為10*和l05J8o分別以IEIDr、10CID及10?CIDjo劑量攻毒，CK/HuN/174/08株和CK/HuB/S4196/09株疫苗對親本病毒株攻去的保護(hù)率分別為100%和0、100%和80%與60%和0,表明依據(jù)EIDjo和ClDso攻毒，CK/HuN/174/08株疫苗可以得出免疫保護(hù)效果一致的結(jié)論，而CK/HuB/S4196/09株疫苗免疫保護(hù)效果不一致。本研究表明，EID和CID”均可以作為H9亞型禽流感疫苗攻毒劑量的參考依據(jù)，但以C山知為依據(jù)更可靠；10CI

4、D是最佳的攻毒劑量。本研究為科學(xué)評價H9亞型禽流感疫苗的攻毒保護(hù)效果提供了依據(jù)，對于研制疫苗時選擇種毒株以及臨床上選用有效疫苗均具有指導(dǎo)意義。關(guān)鍵詞：攻毒劑量；H9亞型禽流感疫苗；免疫效果；評估中圖分類號：S852.65文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A文章編號：1008-0589(2017)04-0301-05DifferentchallengedosesinfluencetheimmunityefficacyevaluationofH9subtypeavianinfluenzavirusSHIWen-jun,ZENGXian-ying,ZANGJin-kai,WUJiao-jiao,BAIJie,CHENHu

5、a-Ian*,TIANGuo-bin,(AnimalInfluenzaLaboratoryoftheMinistryofAgricultural,StateKeyLaboratoryofVeterinaryBiotechnology,HarbinVeterinaryResearchInstitute,ChineseAcademyofAgriculturalSciences,Harbin150069,China)Abstract:Toinvestigatetheinfluenceofdifferentreferentialchallengedosestoimmunityefficacyevalu

6、ationofH9subtypeavianinfluenzavirus(A1V)vaccines,21-day-oldspecificpathogenfree(SPF)chickenswereintramuscularlyvaccinatedwithinactivatedvaccinespreparedfromAIVsofCK/HuN/174/08andCK/HuB/S4196/09andintranasallychallengedbythetwoviruswithreferentialdoseofE1DWandCID”tocomparetheirinfluencetoefficacyeval

7、uationoftheH9subtypevaccines.TheHIantibodyresultsshowedthatbothvaccinesofCK/HuN/174/08andCK/HuB/S4196/09inducedthehighHIantibodytitersabove101og2inthe3"weekpostvaccination.TheEID”andCID»per0.1mLwereIO"925and10'3®forCK/HuN/174/08andwere10"and10'5MforCK/HuB/S4196/09,wh

8、ichconcludedthatEID”andClDwwerenotaccordance.TheprotectiverateofvaccinesCK/HuN/174/08andCK/HuB/S4196/09were100%and0,100%and80%,60%and0,whenchallengedwith106EIDjo,10CID”，and102CIDm,respectively.TheresultsshowthatthechallengereferentiallywithEIDj,andCIDvaccineCK/HuN/174/08couldcompletelyprotectchicken

9、sfromviruswhilevaccineCK/HuB/S4196/09showeddifferentoutcomes.Inthisstudy,weexplainedthatbothEID50andCIDacouldbethechallengereferenceofH9subtypeavianinfluenzavaccineefficacyevaluation,butCID50isCorrespondingauthormorecrediblethanEID*,andthemostidealchallengedoseis10CIDw.Wcofferedascientificreferencef

10、ortheassessmentofH9subtypeavianinfluenzavaccineimmunizationefficacy,whichhasguidingsignificanceforthechoiceofbothvaccinestrainandeffectivevaccinesinclinicwhenstudyaboutvaccines.Keywords：challengedoses;H9subtypeavianinfluenzavaccine;immuneefficacy;evaluation禽流感病毒(Avianinfluenzavirus,AlV)是具有囊膜、分節(jié)段、單股負(fù)

11、鏈RNA病毒，屬于正黏病毒科，流感病毒屬A型川。根據(jù)病毒表面血凝素(HA)和神經(jīng)氨酸酶(NA)抗原的差異，AIV可以分為16個HA亞型和9個NA亞型。其中H9N2亞型A1V致病性低，主要侵害家禽生殖系統(tǒng)，導(dǎo)致蛋雞產(chǎn)蛋量下降、飼料報酬降低。此外，與其它病原混合感染可以造成較高的死亡率.從而給養(yǎng)禽業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。而且H9N2亞型AIV也在不斷進(jìn)化。我國于1994年首次分離得到H9N2亞型AIV,2004年之前流行的H9N2亞型AIV亞群包括Gl、Y280、Y439和CK/HU/35/01心】。Sun等對2004年2008年的H9N2亞型AIV進(jìn)行的遺傳進(jìn)化分析結(jié)果將該亞型病毒分為BJ/94、

12、Gl、BG、F/98和Aq5個亞群。而Pu等的研究表明，2010年2013流行的優(yōu)勢病毒株主要屬于G57基因型，該基因型與之前的基因型相比，抗原性發(fā)生了變化，病毒復(fù)制能力和致病力均有所增強(qiáng)國。最新的研究顯示，H9亞型AIV為H7N9亞型AIV以及H10N8亞型AIV提供了6個內(nèi)部基因，L同時，H9亞型AIV能夠識別人源受體，感染哺乳動物，在哺乳動物間通過空氣傳播，表明H9亞型A【V也具有重要的公共衛(wèi)生意義。疫苗免疫是預(yù)防禽流感的主動措施、關(guān)鍵環(huán)節(jié)和最后防線，并且已廣泛應(yīng)用于禽流感的防控。目前，國內(nèi)外H9亞型禽流感疫苗評估的攻毒劑量多依據(jù)雞胚半數(shù)感染量(EIDso),如1伊EIDJ0.1mU5】

13、。本研究室對7個病毒株的H9亞型禽流感疫苗免疫效果評價時發(fā)現(xiàn)，以106EIDjo劑量攻毒，疫苗間的免疫效果存在很大差別，因此EID©是否是評價H9疫苗攻毒保護(hù)效果時所用劑量最佳參考依據(jù)有待于深入研究。本研究在前期研究的基礎(chǔ)上，選擇2株H9N2亞型AIV,測定E1D”和雞半數(shù)感染量(C1D%)，比較分別以EID和CID”作為參考依據(jù)攻毒后禽流感疫苗的免疫效果，確定H9亞型禽流感疫苗攻毒保護(hù)的最佳攻毒劑量。1材料與方法病毒株、抗原及血清A/ChickerVHunan/S12174/08(CK/HuN/174/08)和A/Chicken/Hubei/S4196/09(CK/HuB/S419

14、6/09)由國家禽流感參考實驗室分離鑒定。HI試驗用H9N2亞型禽流感HI試驗抗原及相應(yīng)的陽性和陰性血清均由本實驗室制備。1.1 SPF雞及雞胚1日齡SPF雞、10日齡SPF雞胚均購自中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所實驗動物中心；10日齡非免疫雞胚購自哈爾濱維科生物技術(shù)開發(fā)公司。1.2 病毒增殖將CK/HuN/174/08和CK/HuB/S4196/09株病毒以10、10,和10,稀釋度分別經(jīng)尿囊腔接種15枚10日齡SPF雞胚，0.15mU胚，接種后以石蠟封孔，放置于37C中培養(yǎng)72h后.測定每個雞胚尿囊液的血凝價，混收血凝價較高雞肌尿囊液后再次測定血凝價作為病毒原液分裝于凍存管中，置于-80C

15、保存?zhèn)溆谩?.3 EIDjo和CIDso的測定將病毒原液以10【O'稀釋度分別經(jīng)尿囊腔接種5枚10日齡非免疫雞胚，0.10mL/胚，接種后以石蠟封孔，放置于37C中培養(yǎng)48h后測定每個雞胚血凝價陽性數(shù)(HA41og2判為陽性)，利用Reed-Muench法計算病毒的EIDo將病毒原液以1010稀釋度分別經(jīng)鼻腔感染5只42日齡SPF雞，100L/只，感染后3d、5d、7d采集喉頭和泄殖腔拭子接胚滴定病毒，判定排毒陽性數(shù)。利用Reed-Muench法計算病毒的CIDg1.5全病毒滅活疫苗的制備將兩株病毒用滅南生理鹽水以10稀釋，0.1mL/胚，尿囊腔接種15枚10日齡非免疫雞胚，24h后死

16、亡的雞胚隨時取出，72h后無菌收集尿囊液，測定其血凝價后以0.2%甲醛37°C滅活24h,滅活的尿囊液接種10日齡非免疫雞胚，每胚O.lmL,37C培養(yǎng)48h測定血凝價為0證明滅活完全。然后按照滅活疫苗制備的常規(guī)程序制備油乳劑滅活疫苗。1.6實驗設(shè)計將120只1日齡SPF雞隨機(jī)分成12組，每組10Ho具體免疫攻毒方案見表1。表1試驗設(shè)計Table1Experimentaldesign日齡/處理/Days/Administration1.7HI抗體檢測組1、組3、組5、組7、組9和組11實驗雞于免疫后7d、14d、21d翅靜脈采血分離血清，采用H9N2亞型禽流感H1試驗抗原根據(jù)國標(biāo)方法

17、(GB1.18936-2003)檢測HI抗體效價。紜1如Groups21日齡/免疫21days/Vaccinalion42日齡/攻毒42days/Chanllenge攻毒劑屋ChanllengedoseGroup1KilledCK/HuN/174/08CICHuN/174/08iocmGroup2ControlCK/HuN/174/0810CIDrGroup3KilledCK/HuN/174/08CK/HuN/174/0810*EID»Group4ControlCK/HuN/174/08106EID勤Group5KilledCK/HuN/174/08CK/HuN/174/08102C

18、ID#Group6ControlCK/HuN/174/08I02CID®Group7KilledCK/HuB/S4196/09CK/HuB/S4196/0910CIDjoGroup8ControlCK/HuB/S419&0910CID.Group9KilledCICHuB/S4196/09ClCHuB/S4196/09lEIDsGroup10ControlCK/HuB/S4196/09KTEIDx,Group11KilledCICHuB/S4196/09CK/HuB/S4196/09I01CID®Group12ControlCK/HuR/S4196/09KfCID,

19、1.8排毒檢測實驗組1組6試驗雞于免疫后21d通過滴鼻途徑以CICHuN/174/08株攻毒，其中組1、組2攻毒劑量為10CID爐組3、組4攻毒劑量為106EID,組5、組6攻毒劑量為102CID；組7組12實驗雞于免疫后21d通過滴鼻途徑以CKJHuB/S4196/09株攻毒，其中組7、組8攻毒劑量為lOCID”，組9、組10攻毒劑量為10&EID50,組11、組12攻毒劑量為102CIDsoo攻毒后連續(xù)觀察14d,記錄發(fā)病和死亡情況，并于攻毒后第3d、5d、7d采集咽喉和泄殖腔拭子，分別使用非免疫雞胚進(jìn)行病毒滴定，分析排毒情況。2結(jié)果2.1EIDa和CIDa測定ElDso和CIDj

20、o的測定結(jié)果見表2。EIDjo結(jié)果顯示，病毒株CK/HuN/174/08比CK/HUB/S4196/09高0.57。CID”結(jié)果顯示，病毒株CK/HuN/174/08比CK/HuB/S4196/09低1.5,表明H9亞型AIV,有時可能會出現(xiàn)一個病毒株的EIDjo高于另一個病毒株，而CID如卻遠(yuǎn)低于另一個病毒株的現(xiàn)象C表2EIDjo和CIDso測定結(jié)果Table2ThedeterminatioiiofEID*andCIDe病毒株Virus雞胚半數(shù)感染量EIDJO.1mL雞半數(shù)感染量CIDx/0.1mLCK/HuN/174/0810*io”CK/HuB/S4196/09104WIO4M2.2HI

21、抗體滴度檢測將組1、組3、組5、組7、組9、蛆11實驗雞于免疫后不同時間采集的血清樣品進(jìn)行HI抗體滴度檢測。結(jié)果顯示，CK/HuN/174/08和CK/HuB/S4196/09株疫苗免疫后7d抗體水平分別為4.2log2和2.4log2;14d抗體水平分別為10.5Iog2和9.6log2；21d抗體水平分別為10.8log2和10.2log2(圖1),表明這兩株滅活病毒均具有較強(qiáng)的免疫原性，而且免疫后14d即可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生高水平的抗體。圖1免疫雞的HI抗體滴度檢測Fig.1HIantibodytitenintiieimmimiredchickens2.3排毒檢測試驗本研究采用的攻毒劑量分別以

22、病毒株的EIDjo和C1D#為依據(jù)。按106ElDtt的劑量攻毒，CK/HuN/174/08株和CK/HuB/S4196/09株病毒的稀釋倍數(shù)分別為10讓和1。2氣對于相同批次的這兩株病毒雞胚液，以10ClDso劑量攻毒，稀釋倍數(shù)分別為。齡和10心，以102CIDjo劑量攻毒，稀釋倍數(shù)分別為IO88和10*。結(jié)果顯示：106EIDjo.IOCIDjo和102CID攻毒劑量下的對照組全部排毒，表明對照雞對病毒攻擊均無保護(hù)力。以106EIDjo劑量攻毒，CK/HuN/174/08株和CK/HuB/S4196/09株疫苗對親本病毒攻擊的保護(hù)率分別為100%和0;以10CIDjo劑量攻毒，CICHuN

23、/174/08株和CK/HuB/S4196/09株疫苗對親本病毒攻擊的保護(hù)率分別為100%和80%;以0CIDjo劑量攻毒CK/HuN/174/08株和CK/HuB/S4196/09株疫苗對親本病毒攻擊的保護(hù)率分別是60%和0。對于CICHuN/174/08株疫苗，依據(jù)EID”和CID”進(jìn)行攻毒，均可以得出該疫苗對親本病毒攻擊具有良好免疫保護(hù)效果的結(jié)論；攻毒，得出的結(jié)論則大相徑庭（表3）。而CK/HuB/S4196/09株疫苗依據(jù)EIDso和CID進(jìn)行表3病毒排毒結(jié)果Table3Virussheddingresult疫苗Vaccine攻毒株Virus攻毒劑量Challengedose攻毒后排毒

24、情況(排毒數(shù)，總數(shù))(loglOEIDx,)Vimsisolationpostchallenged(Positive/Tota!)(loglOEID撮3喉Throatd泄殖腔Cloacal5d排毒數(shù)/總數(shù)Positive/total喉Throat泄殖腔CloacalCK/HuN/174/08CK/HuN/174/0810*EID«0/100/100/100/100/10ControlCK/HuN/174/0810。EID«10/10(2.4±0.4)7/10(1.5)9/10(2.5±0.6)8/10(1.4±0.1)10/10CK/HuB/S

25、4196/09CK/HuB/S4196/0910。EIDw9/10(3.6±0.8)7/10(1.9±1.2)9/10(2.4±0.9)9/10(2.8土0.4)10/10ControlCK/HuB/S4196/09I06EIDn9/10(3.l±0.8)5/10(1.4±0.1)9/10(3.1±0.6)4/10(l.2±0.1)10/10CICHuN/174/08CK/HuN/174/0810CIDjo0/100/100/100/100/10ControlCK/HuN/174/0810CIDx,10/10(4.3

26、7;0.8)0/1010/10(3.5±0.2)1/10(2.5)10/10CK/HuB/S4196/09CK/HuB/S4196/0910CIDW2/10(3.5)0/100/100/102/10ControlCK/IIuB/S4196/0910CID»9/10(3.8±0.4)0/1010/10(3.8±0.3)2/10(3.5)10/10CK/IiuN/174/08ClCHuN/174/08102CIDjo4/10(3±0.6)0/103/10(2.4±0.5)0/104/10ControlCK/HuN/174/08102CID

27、w10/10(4.2±0.4)1/10(1.5)10/10(3.2±0.8)0/1010/10CK/HuB/S4196/09CK/HuB/S4196/09102CIDW10/10(2.4±0.5)3/10(1.5)8/10(2.3±0.2)0/1010/10ControlCK/HuB/S4196/09102CID®10/10(4.5)0/1010/10(4.3±0.4)0/1010/103討論H9N2亞型AIV呈世界性分布，疫苗可以預(yù)防該病的發(fā)生，但科學(xué)的評價方法是確定疫苗是否有效的前提和基礎(chǔ)。檢測疫苗免疫抗體和攻毒保護(hù)情況是常見的評

28、價疫苗免疫效果的方法。本研究中CK/HuN/174/08和CK/HuB/S4196/09株疫苗免疫后21d,平均HI抗體均達(dá)101og2以上，遠(yuǎn)高于一般H9亞型禽流感疫苗的規(guī)程標(biāo)準(zhǔn)，表明兩株病毒均具有良好的免疫原性，疫苗具有良好的免疫效果。家禽免疫疫苗后，用病毒攻擊是最有說服力的評價疫苗保護(hù)效果的方法。H9亞型AIV等低致病性病毒，在實驗室中感染雞一般無明顯的臨床癥狀，更不出現(xiàn)死亡情況，因此常根據(jù)對免疫雞和對照雞攻毒后的排毒情況來評價疫苗的保護(hù)效果。攻毒劑量是評價疫苗保護(hù)效果的關(guān)鍵，疫苗免疫雞所能承受的攻毒劑量是有一定的限制的，攻毒劑量過大則會表現(xiàn)出免疫雞不能獲得有效保護(hù)的現(xiàn)象，而且用可能遠(yuǎn)高

29、于環(huán)境中存在的病毒量來攻毒也不具有實際指導(dǎo)意義；攻毒劑量過小，則對照雞不出現(xiàn)排毒或發(fā)病等現(xiàn)象，從而無法體現(xiàn)免疫和非免疫禽攻毒后的差別。攻毒時，需要將病毒液適當(dāng)稀釋，一般來講，具體稀釋倍數(shù)可依據(jù)測得的雞半數(shù)致死量（CLXM、EIDjo或ClDso,對于低致病性H9亞型AIV來講，只能選擇后兩者作為稀釋病毒的參考依據(jù)。EIDso測起來簡單，本實驗室曾主要參照EID”測定結(jié)果稀釋病毒，用106EID知的劑量攻毒，大部分病毒株疫苗免疫組排毒率較高表現(xiàn)為疫苗不能有效保護(hù)，然而將攻毒劑址降為10'EID對后又出現(xiàn)部分病毒株對照組不完全排毒的情況，因此有必要探究EID”是否是最合適的攻毒劑量參考依據(jù)

30、。本研究室測定了7株H9N2亞型AIV的EID”和Cid并進(jìn)行了比較，結(jié)果表明EID”為ICT03/。mLWk/O.ImL,而CID”為10'388/0.1mLlOWO.lmL（數(shù)據(jù)未發(fā)表）；即以EIDs為依據(jù)，攻毒劑量最大差不到10倍，而以相同的CID知為依據(jù)，攻密劑量最大相差1000倍。本研究中CK/HuN/174/08株疫苗用親本病毒攻擊，以EIDso和CIDjo為依據(jù)攻毒后，對于疫苗的有效性評價是一致的；而對CK/HuB/S4196/09株疫苗免疫效果的評價卻得出截然不同的結(jié)論。分析原因，EID”體現(xiàn)的是病毒在雞胚內(nèi)的復(fù)制和感染能力，而CIDso體現(xiàn)的是病毒在雞體內(nèi)的復(fù)制和感染

31、能力，對于某些H9病毒來講，在雞胚和在雞體內(nèi)的復(fù)制能力并不一致，因而出現(xiàn)了EID.高而CID”卻低的現(xiàn)象。免疫疫苗的目的是為了使免疫雞能夠有效抵抗病毒感染，進(jìn)而阻止或減少病毒的復(fù)制和排泄，因此與EIDso相比，CID”是更適合免疫效果評價時攻毒劑量的參考依據(jù)。本研究比較了以10CIDjo和KFCIDjo劑量攻毒時疫苗的免疫效果，表明攻毒劑量越大，免疫效果越不好?？紤]到自然界可能存在的病毒數(shù)量以及空白對照雞攻毒后的排毒情況等多種因素，認(rèn)為10CID5O是H9亞型AIV免疫效果評估最佳參考劑量。本研究闡明，EIDjo和CID”均可以作為H9亞型禽流感疫苗攻毒劑量:的參考依據(jù)，但以CID”作為依據(jù)更

32、可靠，更能準(zhǔn)確評價疫苗的免疫效果，10CID#是最佳的攻毒劑量。本研究為科學(xué)評價H9亞型禽流感疫苗的攻毒保護(hù)效果提供了依據(jù).對于研制疫苗時選擇種毒株以及臨床上選用有效疫苗均具有指導(dǎo)意義。參考文獻(xiàn)：1 TaubcnbcrgerJK,KashJC.Influenzavirusevolution,hostadaptation,andpandemicformationJ.CellHostMicrobe,20J0,7(6):440-451.2 MurtiKG,WebsterRG.Distributionofhemagglutininandneuraminidaseoninfluenzavirionsas

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