植物基因克隆實驗總結

1、精選優(yōu)質文檔-傾情為你奉上2015-2016第二學期生物科學實驗（植物基因克?。嶒灴偨Y班級：13級生物科學2班 學號： 姓名：鄧偉強 日期：2016年6月10日一、 實驗原理及方法：實驗原理：基因的克隆就是利用體外重組技術，將特定的基因和其它DNA順序插入到載體分子中?；蚩寺〉闹饕繕耸亲R別、分離特異基因并獲得基因的完整的全序列，確定染色體定位，闡明基因的生化功能，明確其對特定性狀的遺傳控制關系。通過幾十年的努力由于植物發(fā)育，生理生化，分子遺傳等學科的迅速發(fā)展，使人們掌握了大量有關植物優(yōu)良性狀基因的生物學和遺傳學知識，再運用先進的酶學和生物學技術已經克隆出了與植物抗病、抗蟲、抗除草劑、抗逆

2、，育性、高蛋白質及與植物發(fā)育有關的許多基因。實驗方法及過程：1. CTAB法提取水稻基因組DNA配制CTAB溶液：(2g CTAB ,3.17g Nacl,1mol/L TrisHcl 10ml(PH 8.0),EDTA 4ml,最后定容至100ml.)配制TBE溶液：（24gTrisHcl, 1.488gNa2EDTA.2H2O,11g 硼酸，最后定容至200ml.）2. 配置瓊脂糖緩沖液：10×TBE Buffer配制方法：每組需要：稱量下列試劑，置于1 L燒杯中Tris：108 gNa2EDTA·2H2O：7.44 g硼酸：55 g向燒杯中加入約800 ml的無菌水，

3、充分攪拌溶解。加無菌水將溶液定容至1 L后，室溫保存。用時稀釋。3. 開發(fā)設計引物LOC_Os02g42310 OsSCP8 - Putative Serine Carboxypeptidase homologue, expressedOryza sativa Japonica GCATATGTCAACATCTCATCTCCGTGTTTCTCTTTAGAAAAAAATCAGAACGAGAGTAACAAAACACAACTAGAGGACACATACATATGTAGCTGCTCTGAGGCGCCGTCCCAGTCGAAAOryza sativa Indica GCATATGTCAACATCTCATC

4、TCCGTGTTTCTCTTTAGAAAAAAATCAGAACGAGAGTAACAAAACACAACTAGAGGACACATACATATGTAGCTGCTCTGAGGCGCCGTCCCAGTCGAAAOryza sativa Japonica GCGCCGGAGACGAAGAGTTGGAAAATTGAAGGGTTGGAAAGTAACTAGCTAGTTTGTTCTCTTTAGGAGAAAGTTTGCACGGTCCAGAGTATAATTTGTGGTGCCTCAGTTTTTTGCTATOryza sativa Indica GCGCCGGAGACGAAGA-ATTGAAGGGTTGGAAAGTAAC

5、TAGCTAGTTTGTTCTCTTTAGGAGAAAGTTTGCACGGTCCAGAGTATAATTTGTGGTGCCTCAGTTTTTTGCTATOLIGO LEFT PRIMER 9 22 59.60 45.45 4.00 0.00 AACATCTCATCTCCGTGTTTCRIGHT PRIMER 168 20 59.77 50.00 5.00 3.00 ACTCTGGACCGTGCAAACTT Length： 201 japonica, 193 Indica 4. PCR反應體系10×擴增緩沖液：每管：2 ul 共需：24uldNTP混合物：每管：0.8 ul 共需：9.6

6、ul模板DNA ：每管3 ul，共需36ulTaq DNA聚合酶：每管0.3 ul，共需3.6ul引物 1、2 ：每管：2 ul（前引物1ul、后引物1ul）共需24ul。兩種引物各6管。引物1、2代表的體系分別加滅菌水71.4ul 至120 ul， 分裝6個ep管。5. PCR反應程序95 預加熱5分鐘，95 30秒鐘56 30秒鐘 35循環(huán)72 30秒鐘 72 10分鐘16 5分鐘總時長：1小時35分鐘6.瓊脂糖凝膠電泳制膠：稱取1.6g瓊脂糖于配好的160mlCTAB溶液（稀釋10倍后的）中，在微波爐中加熱溶解，冷卻后，加入3ul的核酸染色劑（BE）。倒膠：插入梳子，搖勻之后倒膠（1LT

7、BE緩沖液，淹沒瓊脂），避光靜置大概20min。點膠：垂直拔掉梳子，把凝好的膠取出來放在有與制膠同濃度TBE緩沖液的電泳槽中。在第一個膠孔中加入maker，作對比。上樣：取2ulLoadingBffuer（一種沉淀劑，使點膠后樣品沉到膠孔底部不浮上來）混勻10ul的DNA樣品。用移液槍打入膠孔。電泳：電壓電流(100V、100mA)跑40min。7紫外燈下觀察條帶條帶清晰一段說明含DNA多。8. 切膠回收（1）切膠，然后加入膠的三倍體積的Buffer GA（若小于300bp ，按1：5） 本組切下的三份膠均為0.15g，分別加入了450ul的Buffer GA（2）55度水浴10分鐘，期間搖晃

8、23次（3）加入200ul Buffer BL于離心柱，12000rpm離心30秒，棄上清（4）將第2步得到的溶液中加到離心柱中，靜置2分鐘，12000rpm離心30秒，棄上清（5）往離心柱加入500ul的rash Buffer ，靜置2分鐘，12000rpm離心30秒，棄上清。（6）重復（5）（7）12000rpm 離心1分鐘（空管離心去乙醇）（8）將離心柱轉移到一干凈的1.5毫升離心管中，保持離心管開放狀態(tài)510分鐘（揮發(fā)乙醇）（9）加2060ul的Elution(洗脫液)，65度預熱，靜置2分鐘(10)12000rpm離心2分鐘，保存在-20度冰箱9. LB培養(yǎng)基（用于培養(yǎng)大腸桿菌）：

9、酵母提取物 5 g/L 胰蛋白胨 10 g/LNaCl 10 g/L瓊脂 15g（固體）Amp：100ug/ml10. T-載體連接： （1）將回收PCR產物與T-載體連接 PMD 18-T Vector 0.5ul Solution I 2.5ulPCR 回收產物 2ul總 5ul（2）離心至底部（3）PCR 儀中16度反應90分鐘。（或者4度過夜連接）11. 大腸桿菌感受態(tài)的熱激轉化：取出感受態(tài)細胞于冰上化凍后，加入T載體連接產物，輕輕搖勻后在冰上放置30 min。移至42水浴中熱激90 sec，再迅速放回冰上冷卻5 min。加入600 l不含抗生素的LB液體培養(yǎng)基于37振蕩培養(yǎng)1 h?；?/p>

10、化后的菌液涂布于含相應抗生素的篩選平板上，37培養(yǎng)過夜。提取單克?。涸诤Y選平板上選取單個稍大的白色菌落。在超凈工作臺上，吸取500ul液體加Amp 的LB 培養(yǎng)基于EP管中，用最小的槍頭挑取平板上的選取一個白色菌落，伸入LB 液體中抽吸混勻，搖菌培養(yǎng)5h。 12. 檢測：利用PCR引物進行菌液PCR檢查，再次進行電泳，紫外燈觀察條帶（觀察結果見實驗結果），陽性克隆送測序公司測序。二、 實驗結果與分析： 實驗結果：實驗成功，如圖： 實驗結果分析：本組實驗的DNA使用的是上一組提取保存?zhèn)溆玫?。最后得到的實驗結果如圖，在紫外燈下觀察到了清晰的條帶說明實驗達到了預期的效果，實驗成功。實驗最后由于上一大

11、組的已經測過序了，所以我們大組并沒有拿去生物公司測序。三、討論：由于本次實驗是分為兩組，按照加引物1為一組，引物2為一組，每組反應體系為6ep管。實驗過程由全部人員一起操作完成，在配置試劑，配反應體系等時，小組成員進行了分工合作，由于每步上并不能保證絕對無誤，所以在實驗過程中有很多需要注意的地方，并進行如下討論：1、本大組直接從第三步進行了實驗，沒有進行第一步提取DNA，本組直接使用的上一組保存?zhèn)溆肈NA的。 2、第四步中，加反應體系時，由于兩個人進行操作，一人負責引物1、一人負責引物2，在使用移液槍時由于使用不規(guī)范（比如量度沒有調節(jié)準確，槍頭沒有固定好等），可能會導致誤差，以致在紫外燈下觀察

12、時得到的不是清晰的條帶，擴增得到的DNA不多，就會影響后續(xù)過程比如T-載體的連接。因為反應體系中所加的量很少，以微升來計， 所以操作時要特別注意。3、第六步中，在進行瓊脂糖凝膠電泳時，插入梳子是在靠近負極（黑頭），上樣時要注意，在將樣品加入到膠孔中時，可以先在一次性手套上混勻，用移液槍將樣品打入時，要看清膠孔，不能讓樣品溢出，也不能插得太深而把膠孔弄破。4、第七步中，將跑完電泳的瓊脂糖凝膠在紫外光燈下觀察，觀察到只有前六個孔跑出的條帶清晰，后六孔條帶沒有明顯清晰的一條，所以切膠時只切了前六孔跑出的一條條帶，因為清晰條帶擴增的DNA多。后六條孔沒有跑出一條清晰的條帶這可能跟反應體系時加料不準確以

13、及點樣時操作不當有關?？傊瑢嶒炦^程是環(huán)環(huán)相扣的，上一步的操作失誤會影響下一步的操作，所以我們應該要求自己每一步都要細致認真。5、第九步中，配培養(yǎng)基需要配固液兩種，試劑和材料見第九步，液體培養(yǎng)基不加瓊脂。6、第十一步中，有的操作比如熱擊90秒，需要精確計時，這就要求小組成員之間一人操作，一人計時。而有些操作需要在超凈工作臺上完成（消毒工作要做好），在操作前要先將超凈工作臺開紫外燈滅菌（至少10分鐘），紫外燈有輻射，不能靠太近?；罨蟮木河诔瑑艄ぷ髋_涂布時要靠近酒精燈操作，如果操作不當染菌了，會對后續(xù)的實驗造成影響。得不到白色大腸桿菌菌落，就不能提取單克隆。4、 個人實驗體會：(與別人類似的實驗比較，你的實驗方法與結果的優(yōu)點與缺點)實驗操作一定要細心謹慎，比如在進行電泳的時候，稍不留神可能會溢出或插的太深。因前期實