蛋白質(zhì)定量的五種方法

1、蛋白質(zhì)定量的五種方法方法一 雙縮脲法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度 目的把握雙縮脲法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度的原理和標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制。 原理 雙縮脲(NH2CONHCONH2)在堿性溶液中與硫酸銅反應(yīng)生成紫紅色化合物，稱為雙縮脲反應(yīng)，蛋白質(zhì)分子中含有很多肽鍵(-CONH-)在堿性溶液中也能與Cu2+反應(yīng)產(chǎn)生紫紅色化合物。在肯定范圍內(nèi)，其顏色的深淺與蛋白質(zhì)濃度成正比。因此，可以利用比色法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。 雙縮脲法是測(cè)定蛋白質(zhì)濃度的常用方法之一。操作簡(jiǎn)便、快速、受蛋白質(zhì)種類性質(zhì)的影響較小，但靈敏度較差，而且特異性不高。除-CONH-有此反應(yīng)外，-CONH2、-CH2NH2、-CS-NH2等基團(tuán)也有此反應(yīng)。 操作 取中試管7支

2、，按下表操作。 各管混勻、放置37水浴中保溫20分鐘。用540nm比色，以空白管調(diào)零點(diǎn)，讀取各管光密度值。 計(jì)算 (一)在座標(biāo)紙上以光密度為縱座標(biāo)，以蛋白質(zhì)濃度為橫座標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。 (二)從標(biāo)準(zhǔn)曲線中查出待測(cè)血清樣本的蛋白質(zhì)濃度(gL)，并求出人血清樣本的蛋白質(zhì)濃度。 (三)再?gòu)臉?biāo)準(zhǔn)管中選擇一管與測(cè)定管光密度相接近者，求出人血清樣本的蛋白質(zhì)濃度(gL)。 器材 中試管7支，l毫升刻度吸管3支，10毫升刻度吸管1支，水浴箱，721型分光光度計(jì)、坐標(biāo)紙。 試劑 ()6N NaOH：稱取240g氫氧化鈉溶于1000ml水中。 (二)雙縮脲試劑：稱取CuS04·5H2O 3.0克，酒石酸鉀

3、9.0 克和碘化鉀5.0克，分別溶解后混勻，加6N NaOH l00ml，最終加水至1000ml，貯于棕色瓶中，避光，可長(zhǎng)期保存。如有暗紅色沉淀消滅，即不能使用。 (三)0.9NaCl。 (四)蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)液(10mgm1)，稱取干燥的牛血清蛋白100.0mg，以少量生理鹽水溶解后倒入l0ml容量瓶中，淋洗稱量瓶數(shù)次，一并倒入容量瓶中，最終加生理鹽水至刻度線，或用凱氏定氮法測(cè)定血清蛋白質(zhì)含量，然后稀釋成l0mgm1作為蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)液。 (五)待測(cè)血清樣本：將人血清或動(dòng)物血清用生理鹽水稀釋10倍后再測(cè)定。方案二 Folin-酚試劑法(Lowry法)測(cè)定蛋白質(zhì)濃度 目的把握Lowry法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度的

4、原理。 原理 蛋白質(zhì)在堿性溶液中其肽鍵與Cu2+螯合，形成蛋白質(zhì)一銅復(fù)合物，此復(fù)合物使酚試劑的磷鉬酸還原，產(chǎn)生藍(lán)色化合物，在肯定條件下，利用藍(lán)色深淺與蛋白質(zhì)濃度的線性關(guān)系作標(biāo)準(zhǔn)曲線并測(cè)定樣品中蛋白質(zhì)的濃度。 操作 取試管7支、編號(hào)、按下表操作：生理鹽水生理鹽水馬上混勻，在2025水浴保溫30分鐘。用660nm比色，測(cè)定光密度值。操作留意事項(xiàng)：1 按挨次添加試劑2 試劑乙在酸性條件下穩(wěn)定，堿性條件下（試劑甲）易被破壞，因此加試劑乙后要馬上混勻，加一管混勻一管，使試劑乙（磷目酸）在破壞前即被還原。 計(jì)算 (一)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。以濃度為橫坐標(biāo)，光密度值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。 (二)以測(cè)定管光密度值，查

5、找標(biāo)準(zhǔn)曲線，求出待測(cè)血清中蛋白質(zhì)濃度(gL)。 (三)再?gòu)臉?biāo)準(zhǔn)管中選擇管與測(cè)定管光密度相接近者，求出待測(cè)血清中蛋白質(zhì)濃度(gL)。 器材 (一)721型分光光度計(jì) (-)恒溫水浴箱 (三)中試管7支 (四)刻度吸管：1. 0ml二支；0.5ml一支；5.0ml一支。 試劑 (一)試劑甲 (1)4碳酸鈉(Na2CO3)溶液 (2)0.2N氫氧化鈉溶液 (3)1硫酸銅溶液(CuSO4·5H2O) (4)2酒石酸鉀鈉溶液(或酒石酸鉀或鈉) 在使用前(1)與(2)、(3)與(4)等體積混合，再將兩混合液按50：1比例混合，即為試劑甲。該試劑只能用一天，過期失效。(一)試劑乙： (1)市售酚試

6、劑在使用前用NaOH滴定，以酚肽為指標(biāo)劑，依據(jù)試劑酸度將其稀釋，使最終酸度為1N。 (2)或取Na2WoO42H2O l00g和Na2MOO3 25g。溶于蒸餾水700ml中，再加85 H3PO4 50ml和HCl(濃)100ml，將上物混合后，置1000ml圓底燒瓶中溫存地回流十小時(shí)，再加硫酸鋰(Li2SO4H2O)150g，水50ml及溴水?dāng)?shù)滴。連續(xù)沸騰15分鐘后以除去剩余的溴，冷卻后稀釋至1000ml然后過濾，溶液應(yīng)呈黃色或金黃色(如帶綠色者不能用)，置于棕色瓶中保存，使用時(shí)用標(biāo)準(zhǔn)NaOH滴定，以酚酞為指示劑，而后稀釋約一倍，使最終酸度為1N。 (三)標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液 用結(jié)晶牛血清白蛋白，

7、依據(jù)其純度用蒸餾水配制成0.25mgml的蛋白質(zhì)溶液。(純度可經(jīng)凱氏定氮法測(cè)定蛋白質(zhì)含量而確定)。 (四)待測(cè)樣品：精確取血清0.1ml，置于50ml容量瓶中，再加0.9NaCl溶液至刻度，充分混勻，也可以用尿液為樣品。方案三 紫外分光光度法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度目的：把握紫外分光光度法測(cè)定蛋白質(zhì)含量的原理，生疏紫外分光光度計(jì)的使用。原理 蛋白質(zhì)分子中含有共軛雙鍵的酪氨酸、色氨酸等芳香族氨基酸。它們具有吸取紫外光的性質(zhì)，其吸取高峰在280nm波特長(zhǎng)，且在此波長(zhǎng)內(nèi)吸取峰的光密度值與其濃度成正比關(guān)系，故可作為蛋白質(zhì)定量測(cè)定的依據(jù)，但由于各種蛋白質(zhì)的酪氨酸和色氨酸的含量不同，故要精確定量，必需要有待測(cè)蛋白質(zhì)

8、的純品作為標(biāo)準(zhǔn)來比較，或且已經(jīng)知道其消光系數(shù)作為參考。另外，不少雜質(zhì)在280nm波長(zhǎng)下也有定吸取力量，可能發(fā)生干擾。其中尤以核酸(嘌呤和嘧啶堿)的影響更為嚴(yán)峻。然而核酸的最大吸取峰是在260nm。因此溶液中同時(shí)存在核酸時(shí)，必需同時(shí)測(cè)定OD260nm，與OD280nm。，然后依據(jù)兩種波長(zhǎng)的吸取度的比值，通過閱歷公式校正，以消退核酸的影響而推算出蛋白質(zhì)的真實(shí)含量。 本法操作簡(jiǎn)便快速，且不消耗樣品(可以回收)，多用于純化之蛋白質(zhì)的微量測(cè)定。主要缺點(diǎn)：當(dāng)待測(cè)的蛋白質(zhì)與標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)中的酪氨酸和色氨酸含量差異較大時(shí)，則產(chǎn)生定誤差，混有核酸時(shí)必需分別測(cè)定280nm和260nm兩處的OD值，再按公式推算蛋白質(zhì)含

9、量。操作 取試管7支，按下表操作：0.43.6 各管混勻，盛于石英杯中，用紫外分光光度計(jì)，以空白管調(diào)整零點(diǎn)，分別于280nm、260nm波長(zhǎng)下測(cè)定各管光密度，計(jì)算(一) 直接依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)液與待測(cè)液的光密度值(OD280nm)，或從標(biāo)準(zhǔn)曲線，求得樣本蛋白質(zhì)含量。以標(biāo)準(zhǔn)管各管光密度值為縱坐標(biāo)，以蛋白質(zhì)濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，然后依據(jù)測(cè)定管光密度值，直接查標(biāo)準(zhǔn)曲線求得樣本中蛋白質(zhì)的含量。1 選一種與待測(cè)樣本蛋白質(zhì)氨基酸組成相近似的蛋白質(zhì)純品，用生理鹽水稀釋至濃度為 lmgm1，作為稀釋標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液。2用生理鹽水稀釋待測(cè)樣本蛋白質(zhì)至濃度約為lmgm1，即為稀釋樣本蛋白質(zhì)溶液。(二)利用閱歷公式直接計(jì)算

10、樣本蛋白質(zhì)含量， 精確吸取血清樣本0.1ml，置于50ml容量瓶中，用生理鹽水稀釋至刻度，即500倍稀釋，在280nm和260nm兩處波長(zhǎng)分別測(cè)得光密度值、再按下列公式計(jì)算。 1、OD2800D2601.5時(shí)，用Lowry-Kalokar公式： 樣本蛋白質(zhì)含量(mgm1)1.45OD280一0.74OD2602、OD280OD2601.5時(shí)，用Lamber-Beer定律計(jì)算：樣本蛋白質(zhì)含量(mgm1) = OD280K×L（OD2806.3×1）×10gL本試驗(yàn)樣品：牛血清白蛋白E1%cm6.3（100mlcm.g）K：克分子消光系數(shù)；E1%cm：百分比吸光度的吸

11、光系數(shù)；注：不同蛋白質(zhì)中的酪氨酸和色氨酸含量有差異，故標(biāo)準(zhǔn)管與測(cè)定管的蛋白質(zhì)氨基酸組成應(yīng)相像，以減小誤差。器材 (一)UV-9200紫外分光光度計(jì) (二)50ml容量瓶試劑(一) 生理鹽水(二) 清蛋白(人或牛)純晶(三) 待測(cè)樣本蛋白質(zhì)：用雙縮脲法測(cè)定蛋白質(zhì)的樣品用生理鹽水稀釋而成。方案四 考馬斯（Comessie)亮蘭結(jié)合法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度 考馬斯亮蘭結(jié)合法是近年來進(jìn)展起來的蛋白質(zhì)定量測(cè)定法。本方法具有操作便利、快速、干擾因素少的特點(diǎn)。 【原理】 考馬斯亮蘭能與蛋白質(zhì)的疏水微區(qū)相結(jié)合，這種結(jié)合具有高敏感性，考馬斯亮蘭G-250 的最大光吸取峰在465nm，當(dāng)它與蛋白質(zhì)結(jié)合形成復(fù)合物時(shí)，其最大

12、吸取峰轉(zhuǎn)變?yōu)?95nm。考馬斯亮蘭G250-蛋白質(zhì)定量測(cè)定的高敏性度。 在肯定范圍內(nèi)，考馬斯亮蘭G250-蛋白質(zhì)復(fù)合物呈青色。在595nm下，光密度與蛋白質(zhì) 含量呈線性關(guān)系。故可以用于蛋白質(zhì)含量的測(cè)定。 【操作】(常量法) (一)標(biāo)準(zhǔn)曲線制備： 配制lmgml的標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液。制備系列稀釋液，其濃度分別為1000gml，500gml， 250gml，125gml ，62.5gml和31.25gml。按下表操作： 搖勻，室溫靜置3分鐘。在第一管為對(duì)比管，在721型分光光度計(jì)于波長(zhǎng)595nm處比色-讀取光密度。以各管光密度為縱座標(biāo)，各標(biāo)準(zhǔn)樣品濃度(gml)作為橫座標(biāo)作圖得標(biāo)準(zhǔn)曲線。 (二)未知樣品測(cè)

13、定： 取血清0.25ml直接置于50ml容量瓶中，加生理鹽水至刻度，搖勻。(此法樣品稀釋200倍)。取試管二只，按下表操作：搖勻，靜置3分鐘，在721型分光光度計(jì)亡波長(zhǎng)595nm比色，讀取光密度，查標(biāo)準(zhǔn)曲線，求得稀釋樣品蛋白質(zhì)濃度?！居?jì)算】 未知樣品蛋白質(zhì)濃度gml稀釋樣品濃度×稀釋倍數(shù) 【優(yōu)缺點(diǎn)】 ()操作簡(jiǎn)便、快速；檢測(cè)靈敏；重復(fù)性好。 (二)顯色快速。約于2分鐘內(nèi)完成染料與蛋白質(zhì)的結(jié)合。所現(xiàn)顏色至少在l小時(shí)內(nèi)是穩(wěn)定的。 (三)與改良Lowry氏法相比，干擾物質(zhì)較少。 (四)當(dāng)樣品中存在較大量的十二烷磺酸鈉(SDS)、TritonX-100等去垢劑時(shí)，顯色反應(yīng)會(huì)受到干擾。如樣品緩

14、沖液呈強(qiáng)堿性時(shí)也會(huì)影響顯色，故必需預(yù)先處理樣品。 (五)考馬斯亮蘭G250染液不宜久存，以1-2月為宜。 (六)微量法測(cè)定蛋白含量范圍為1-10g；常量法測(cè)以檢測(cè)范圍10-100g為宜。 【器材】 (一)試管l0支 (二)吸管10ml、l5ml、lml、O.1ml各1支。 （三）721分光光度法，一般比色杯4只。 【試劑】 (一)O.9NaCl (二)待測(cè)血清 (三)標(biāo)準(zhǔn)血清 (四)染液：考馬斯亮蘭G250 0.1克溶于0.5 m1 95%乙醇。再加入100m1 85(WV)磷酸。然后加蒸餾水定容到1000ml。此時(shí)溶液為0.0l考馬斯亮蘭G2504.7(WV)乙醇8.5%(WV)磷酸。方案五

15、 BCA法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度【目的】：把握BCA法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度的原理?！驹怼浚?BCA(bicinchonininc acid)與二價(jià)銅離子的硫酸銅等其他試劑組成的試劑，混合一起即成為蘋果綠，即BCA工作試劑。在堿性條件下，BCA與蛋白質(zhì)結(jié)合時(shí)，蛋白質(zhì)將Cu2+還原為Cu+，一個(gè)Cu+螯合二個(gè)BCA分子，工作試劑由原來的蘋果綠形成紫色復(fù)合物，最大光吸取強(qiáng)度與蛋白質(zhì)濃度成正比。【操作】標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：取試管七支、編號(hào)【計(jì)算】（一）        繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。（二）     &

16、#160;  以測(cè)定管吸光度值，查找標(biāo)準(zhǔn)曲線，求出待測(cè)血清中蛋白質(zhì)濃度(g/L)。（三）        再?gòu)臉?biāo)準(zhǔn)管中選擇一管與測(cè)定管光密度相接近者，求出待測(cè)血清中蛋白質(zhì)濃度(g/L)?！緝?yōu)缺點(diǎn)】(一) 操作簡(jiǎn)潔，快速，45分鐘內(nèi)完成測(cè)定，比經(jīng)典的Lowary法快4倍且更加便利；(二) 精確靈敏，試劑穩(wěn)定性好，BCA試劑的蛋白質(zhì)測(cè)定范圍是20-200g/ml，微量BCA測(cè)定范圍在0.5-10g/ml。(三) 經(jīng)濟(jì)有用，除試管外，測(cè)定可在微板孔中就進(jìn)行，大大節(jié)省樣品和試劑用量；(四) 抗試劑干擾力量比較強(qiáng)，如去垢劑，尿素等均無影響。【器材】（一）   7220型分光光度計(jì)（二）   恒溫水浴箱（三）   中試管7支（四）   槍式移液管【試劑】1、 試劑A：1BCA二鈉鹽 2無水碳酸鈉 0.16%酒石酸鈉 0.4氫氧