放線菌抗生素的發(fā)酵及目的產(chǎn)物的提取實驗報告

1、放線菌抗生素的發(fā)酵及目的產(chǎn)物的提取1、 試驗?zāi)康?1、生疏把握土壤中分別抗生素及培育方法 2、了解和把握種子制備和搖瓶發(fā)酵技術(shù)和方法 3、了解抗生素發(fā)酵的一般規(guī)律和代謝調(diào)控理論  4、了解小型發(fā)酵罐的基本結(jié)構(gòu) 5、生疏把握小型發(fā)酵罐的使用方法和保養(yǎng) 6.把握抗生素生物效價測定的原理和方法； 7. 把握管碟法測定抗生素生物效價相關(guān)的操作方法。8.把握放線菌次級代謝物的初步純化及牛津杯試驗的基 本原理和操作技術(shù)二、試驗原理 發(fā)酵罐是進行液體發(fā)酵的特殊設(shè)備。生產(chǎn)上使用的發(fā)酵罐容積大，均用鋼板或不銹鋼板制成；供試驗室使用的小型發(fā)酵罐，其容積可從約lL至數(shù)百升或稍大些。一般來說，5L以下是用耐

2、壓玻璃制作罐體，5L以上用不銹鋼板或鋼板制作罐體。發(fā)酵罐配備有把握器和各種電極，可以自動地調(diào)控試驗所需要的培育條件，是微生物學(xué)、遺傳工程、醫(yī)藥工業(yè)等科學(xué)爭辯所必需的設(shè)備。抗生素（antibiotics）是由微生物（包括細菌、真菌、放線菌屬）或高等動植物在生活過程中所產(chǎn)生的具有抗病原體或其它活性的一類次級代謝產(chǎn)物，能干擾其他生活細胞發(fā)育功能的化學(xué)物質(zhì)。現(xiàn)臨床常用的抗生素有轉(zhuǎn)基因工程菌 培育液液中提取物以及用化學(xué)方法合成或半合成的化合物。 放線菌發(fā)酵結(jié)束后，次級代謝物可能與菌體結(jié)合，工業(yè)上常接受草酸或磷酸等酸化劑處理，釋放與菌體結(jié)合的次級代謝物，并接受加熱發(fā)酵液70 ，2 min使蛋白凝

3、固，所得酸性濾液，在經(jīng)堿處理，進一步去除蛋白。 抗生素的效價常接受微生物學(xué)方法測定，它是利用抗生素對特定的微生物具有抗菌活性的原理來測定抗生素效價的方法，如管碟法。管碟法是目前抗生素效價測定的國際通用方法，我國藥典也接受此法。管碟法是依據(jù)抗生素在瓊脂平板培育基中的集中滲透作用，比較標準品和檢品兩者對試驗菌的抑菌圈大小來測定供試品的效價。管碟法的基本原理是在含有高度敏感性試驗菌的瓊脂平板上放置小鋼管（內(nèi)徑6.0±0.l mm，外徑8.0±0.l mm，高10±0. lmm），管內(nèi)放人標準品和檢品的溶液，經(jīng)1618小時恒溫培育，當(dāng)抗生素在菌層培育基中集中時，會形成抗生

4、素濃度由高到低的自然梯度，即集中中心濃度高而邊緣濃度低。因此，當(dāng)抗生素濃度達到或高于MIC（最低抑制濃度）時，試驗菌就被抑制而不能繁殖，從而呈現(xiàn)透亮的無菌生長的區(qū)域，常呈圓形，稱為抑菌圈。依據(jù)集中定律的推導(dǎo)，抗生素總量的對數(shù)值與抑菌圈直徑的平方成線性關(guān)系，比較抗生素標準品與檢品的抑菌圈大小，可計算出抗生素的效價。 常用的管碟法有：一劑量法、二劑量法、三劑量法。后二法已經(jīng)列入藥典。二劑量法系將抗生素標準品和供試品各稀釋成肯定濃度比例（2:1或4:1）的兩種溶液，在同一平板上比較其抗藥活性，再依據(jù)抗生素濃度對數(shù)和抑菌圈直徑成直線關(guān)系的原理來計算供試品效價。取含菌層的雙層平板培育基，每個平板表面放置

5、4個小鋼管，管內(nèi)分別放入供試品高、低劑量和標準品高、低劑量溶液。先測量出四點的抑菌圈直徑，按下列公式計算出檢品的效價。 （1） 求出W和V： W=（SH+UH）-（SL+UL） (式 2.10-1) V=（UH+UL）-（SH+SL） (式 2.10-2) 式中：UH：供試品高劑量之抑菌圈直徑； UL：供試品低劑量之抑菌圈直徑； SH：標準品高劑量之抑菌圈直徑； SL：標準品低劑量之抑菌圈直徑；（2） 求出： =D·antilog（IV/W） (式 2.10-3) 式中：供試品和標準品的效價比； D：標準品高劑量與供試品高劑量之比，一般為1 I：凹凸劑量之比的對數(shù)，即log2或log

6、4。 求出Pr ：Pr = Ar× (式 2.10-4) 式中：Pr：供試品實際單位數(shù)； Ar：供試品標示量或估量單位 甲醛滴定法測定氨基氮含量：水溶液中的氨基酸為兩性離子，因而不能直接用堿滴定氨基酸的羧基。用甲醛處理氨基酸,甲醛與氨基結(jié)合,可形成羥甲基衍生物，使NH3+上的H+游離出來，這樣就可用堿滴定NH3+放出的H+，從而計算出氨基氮含量。如樣品中只含有某一種已知氨基酸，由甲醛滴定的結(jié)果即可算出氨基氮的含量。假如樣品是多種氨基酸的混合物（如蛋白質(zhì)水解物），則滴定結(jié)果不能作為氨基酸的定量依據(jù)。甲醛滴定法常用于測定蛋白質(zhì)的水解程度，隨著水解程度的增加，滴定值增加，當(dāng)水解完

7、全后，滴定值保持恒定。 甲基紅的變色范圍是PH4.46.2,意思是說: 1.其pH值在4.46.2區(qū)間時,呈橙色, 2.其pH值4.4時,呈紅色,因是靠近酸性強的一邊時的顏色,故又稱之為酸色。 3.其pH值6.2時,呈黃色，因是靠近堿性強的一邊時的顏色,故又稱之為堿色二、儀器與材料 （一）培育基 高氏一號培育基： 可溶性淀粉 20.0g NaCl 0.5g KNO3 1.0g K2HPO4 0.5g MgSO4.7H2O 0.5g FeSO4.7H2O 0.01g 蒸餾水 1000ml，PH 7.4， 發(fā)酵瓶培育基： 淀粉3%,葡萄糖2%, 黃豆餅粉2.5%, 蛋白胨0.5% , 酵母粉0.5

8、%, MgSO4 0.1%,(NH4)2SO4 0.3%, KH2PO4, 0.03%, CaCO3 0.4%, PH 6.0。 黃豆餅粉 4g, 淀粉10g, 酵母粉0.25 g , 蛋白胨1.5g, MgSO4 0.025 g, CaCO3 0.4g, (NH4)2SO4 0.3 g, -淀粉酶（105u/ml） 0.01ml. 100ml PH7.4-7.6 可溶性淀粉 2.0g，NaCl 0.05g，KNO3 0.1g, K2HPO4 0.05g， MgSO4.7H2O 0.05g， FeSO4.7H2O 0.001g， 加蒸餾水至100ml，PH 7.4， 牛肉膏蛋白胨牛肉膏 (5.

9、0g），蛋白胨（10.0g）， NaCl（5g），蒸餾水（1000mL），pH 7.27.4 發(fā)酵罐培育基(2L)： 黃豆餅粉 80g 淀粉 200g 酵母粉 5 g 蛋白胨 30g MgSO4 0.5 g CaCO3 8g (NH4)2SO4 6 g -淀粉酶（105u/ml） 0.2ml（二)流加補料 碳源：葡萄糖（10%）300ml,把握1%；2000*1%=20g,200ml 氮源：硫酸銨（10%）250ml,把握16% 調(diào)PH值：0.1MHCl 0.1MNaOH（三)分析指標及方法所用試劑及溶液測殘?zhí)?DNS法1. 3，5二硝基水楊酸試劑（DNS試劑）：將6.3g的3，5二硝基水楊酸

10、和2molNaOH溶液加到500ml含有182g酒石酸鉀鈉的熱水溶液中，再加5g結(jié)晶苯酚和5g亞硫酸鈉，攪拌溶解，冷卻后加蒸餾水定容到1000ml 2. 1.0mg/ml葡萄糖溶液：稱取1g葡萄糖，加蒸餾水定容到1L。3. 6mol/l氫氧化鈉溶液：稱取氫氧化鈉24g,加蒸餾水定容到100ml。 4. 6mol/l的鹽酸：取濃鹽酸49.68ml,加蒸餾水定容到100ml。測殘氮的方法-甲醛法 1. 甲基紅：0.1g甲基紅，用95%乙醇定容100ml。 2. 0.3mol/LHCL：取濃鹽酸2.48ml,加蒸餾水定容到100ml。 3. 0.02858mol/L NaOH：稱0.11432g,定

11、容100ml。 4. 1%酚酞指示劑：稱取1g酚酞指示劑粉末。溶于100ml 95%乙醇溶液中。 5. 95%乙醇：取乙醇96ml,倒入100ml容量瓶中定容值100ml。6. 18%中性甲醛：取48ml 38%的甲醛加入小于100ml容量瓶，往溶液中加兩滴酚酞用氫氧化鈉滴定剛好變紅，定容到100ml。（4） 器材 玻璃試管、試管架、吸管（1ml，2ml，10ml）、吸耳球、離心管、容量瓶、燒杯、三角瓶（250 ml，500ml）、量筒（250ml，500ml，1000ml）、玻璃棒、試紙、塑料漏斗、電爐、接種鏟（針）、振蕩培育箱、恒溫箱、臺秤、5L-發(fā)酵罐，無菌室、培育皿（直徑9

12、cm）、陶瓦蓋、鋼管、鋼管放置器、恒溫培育室、滅菌刻度吸管、玻璃容器、稱量管、毛細滴管、天平、直尺或游標卡尺、超凈工作臺，無菌培育皿，酒精燈，牛津杯，鑷子，移液器等等（五）.生物效價測定所需材料（1）菌種：大腸桿菌（Escherichia coli），菌液濃度約為106個/mL。菌株保存的時間過久，影響其對抗生素的敏感度，導(dǎo)致抑菌圈變大、模糊或者消滅雙圈。如若菌株不純，也會造成這樣的結(jié)果。因此，菌液在使用一段時間后，可以重新配制純化或者減小原來菌液在使用中的稀釋倍數(shù)。（2）抗生素標準品和供試品：頭孢拉定標準品和供試品。（3）培育基：效價檢定用培育基1號。（4）無菌緩沖液：稱取磷酸氫二鉀5.59

13、g，磷酸二氫鉀0.41g，加水1000mL，即為pH 7.8的磷酸鹽緩沖液。制備緩沖液的試劑應(yīng)為分析純，配制后的緩沖液應(yīng)澄清，分裝于玻璃容器內(nèi)，經(jīng)121蒸氣滅菌30 min備用。（5）草酸，10 M NaOH四、試驗步驟 篩選高產(chǎn)放線菌從土壤里篩選出高產(chǎn)放線菌，于斜面培育基中保藏 接種  在超凈工作臺上，將長好的斜面孢子用無菌接種針挖塊約0.5×1cm2，接種于滅過菌的高氏一號培育基中。  培育  將接種好的種子搖瓶于28恒溫室搖床上，轉(zhuǎn)速為200r/min，培育48小時左右。 實罐滅菌 1、將冷凝水管路斷開，拔下電極，打開罐蓋，將發(fā)酵培育基裝入發(fā)酵罐及

14、補料瓶，易產(chǎn)生泡沫的培育基盡量不要超過兩升。 2、連接管路：取樣管路連接，補料管路連接；空氣過濾器用硅膠管與罐蓋空氣管連接，并用彈簧夾夾緊；排氣口與過濾器用硅膠管連接；安裝溫度電極、pH電極、溶氧電極，pH電極用們帽蓋緊電極上端口，溶氧 電極用鋁鉑紙包裹電極上端口，防止受潮。蓋緊其它罐蓋接口。 3、提起玻璃罐體及補料瓶放入滅菌鍋，蓋好牛皮紙，蓋好鍋蓋，確定發(fā)酵溫度準時間。 4、滅菌結(jié)束后，盡快將罐放回原位并盡快通入空氣。 發(fā)酵操作 1、將滅菌后的罐體放回原位，連接冷凝水管路，通入冷凝水，連接通氣管路，調(diào)整通氣量至35L/min。 2、將溫度電極、pH電極、溶氧電極與把握器連接。 3、補料管連接

15、：打開補料蠕動泵防護蓋，搬開進出口處的白色管夾，將硅膠管嵌入入口處的管夾并夾緊，用手轉(zhuǎn)動泵頭，將硅膠管沿凹槽安裝直至出口處，開手動開關(guān)約十秒后夾緊出口處管夾，關(guān)手動開關(guān)；將酒精棉球放在罐蓋補料口內(nèi)，將針頭插入并穿透密封蓋；打開蠕動泵手動開關(guān)，使輸液管中布滿料液，置于自動狀態(tài)。  接種  將培育48小時的搖瓶種子接種于發(fā)酵罐中，使用接種圈放置酒精棉點燃，進行無菌接種，接入100ml種子。接種后馬上進行第一次取樣。 發(fā)酵生產(chǎn) 發(fā)酵過程的測定：  發(fā)酵液狀態(tài)觀看：粘度、顏色、氣味、菌絲形態(tài)  發(fā)酵中殘?zhí)堑臏y定-DNS法： 1.取1.0mg/ml葡萄糖標準溶液，

16、按下表加入試劑。沸水浴加熱5min，冷水冷卻定容至25ml搖勻，在520nm按波長測吸光度。編號 葡萄糖標準溶液/ml 水/ml 溶液糖含量/mg DNS試劑/ml00201.510.2 1.80.21.520.41.60.41.53 0.6 1.4 0.6 1.54 0.81.20.8 1.551.01.01.0 1.56 1.20.8 1.21.57 1.40.6 1.41.58 1.60.41.61.5 2.取發(fā)酵液0.5ml置于50ml容量瓶中，加6mol/l的鹽酸溶液2ml，在沸水溶液中加熱15min水解，冷水冷卻后準時6mol/l氫氧化鈉溶液1.8ml，并定容到50ml的總糖水解液

17、。 3.取總糖水解液2ml于25ml比色管中，加入DNS試劑1.5ml沸水浴中加熱5min，冷水冷卻后定容至25ml搖勻，以空白作對比在520nm波長測吸光度。 氨基酸氮的測定：甲醛法(陳鈞鳴和徐玲娣,1991)。取2ml發(fā)酵液濾液于三角瓶內(nèi),加蒸餾水10ml,甲基紅指示劑2滴,用O.3MHCI調(diào)整pH至溶液呈紅色,再用0.02858MNaOH溶液調(diào)pH至溶液呈橙色(中性),加18%中性甲醛溶液4ml,搖勻,靜置10min,加l%酚酞指示劑8滴,用0.02858NNaOH標準溶液滴定至微紅色為終點。氨基氮的計算公式為:氨基氮(mg/l00ml)=滴定體積*20。 放線菌次級代謝物的初步純化及牛

18、津杯試驗的 1、配制培育基高壓滅菌。 2、倒平板。 3、涂布指示菌。 4、以無菌操作在培育基表面直接垂直放上牛津杯，輕輕加壓，使其與培育基接觸無空隙。 5、收集發(fā)酵液，緩緩加入草酸將發(fā)酵液酸化至pH 1.4- 3.0左右，70 ，2 min， 以10000 rpm離心20 min。 6、取上清加入水稀釋20%左右，在4，用10 M NaOH中和至pH6.4- 6.8。 7、吸取中和液100 L 加入牛津杯中，37培育16hr，觀看結(jié)果。 效價測定 1. 稱量 稱量前，將抗生素標準品和供試品從冰箱取出，使與室溫平衡，供試品應(yīng)放于干燥器內(nèi)至少30 min方可稱取。供試品與標準品應(yīng)用同一天平；吸濕性

19、較強的抗生素在稱量前12小時更換天平內(nèi)干燥劑。標準品稱量不行少于20 mg，取樣后馬上將稱量瓶或適宜的容器及被稱物蓋好，以免吸水稱樣量的計算W=V*C/P (式 2.10-4) 式中：W：需稱取標準品或供試品的重量（mg） V：溶解標準品或供試品制成濃溶液時用容量瓶的體積量（mL） C：標準品或供試品高劑量的濃度（U/mL，g/mL） P：標準品的純度或供試品的估量效價（U/mg，g/mg） 2.稀釋 從冰箱中取出的標準品溶液，必需先在室溫放置，使其溫度達到室溫后，方可量取。標準品或供試品溶液的稀釋應(yīng)接受容量瓶，每步稀釋，取樣量不得少于2 mL，稀釋步驟一般不超過3步。每次吸取溶液用胖肚吸管或密刻度玻璃吸管，量取溶液前要用被量液流洗吸管23次，吸取樣品溶液后，用濾紙將外壁多余液體擦去，從起始刻度開頭放溶液。稀釋標準品與供試品用的緩沖液應(yīng)同一批和同瓶，（估計不夠時，應(yīng)事先與另一瓶混勻后再用），以免因pH或濃度不同影響預(yù)定結(jié)果。稀釋時，每次加液至容量瓶近刻度前，稍放置片刻，待瓶壁的液體完全流下，再精確補加至刻度。標準品與供試品凹凸?jié)舛戎葹?:1或4:1，但所選用的濃度必需在劑量反應(yīng)直線范圍內(nèi)。3. 雙碟制備 在超凈工作臺上，用滅菌