第四章 體細(xì)胞胚及人工種子

1、體細(xì)胞胚及體細(xì)胞胚及人工種子人工種子原生質(zhì)體培養(yǎng)原生質(zhì)體培養(yǎng)植物細(xì)胞、組織體培養(yǎng)及生物反應(yīng)植物細(xì)胞、組織體培養(yǎng)及生物反應(yīng)器器植物離體快速繁殖和脫毒培養(yǎng)植物離體快速繁殖和脫毒培養(yǎng)細(xì)胞融合細(xì)胞融合染色體工程染色體工程轉(zhuǎn)基因植物及食品安全轉(zhuǎn)基因植物及食品安全植物細(xì)胞工程及其應(yīng)用植物細(xì)胞工程及其應(yīng)用體細(xì)胞胚（體細(xì)胞胚（somatic embryosomatic embryo）又叫胚狀體，是指離體培）又叫胚狀體，是指離體培養(yǎng)條件下沒(méi)有經(jīng)過(guò)受精過(guò)程而形成的胚胎類似物。養(yǎng)條件下沒(méi)有經(jīng)過(guò)受精過(guò)程而形成的胚胎類似物。胚的發(fā)育圖胚的發(fā)育圖 (A) 伸長(zhǎng)期合子；(B) 合子經(jīng)過(guò)第一次分裂, 產(chǎn)生1 個(gè)頂細(xì)胞(綠色)

2、和一個(gè)基細(xì)胞(粉紅色)；(C) 四分體胚: 頂細(xì)胞經(jīng)歷2 次縱向分裂，產(chǎn)生含有4 個(gè)細(xì)胞的胚體和2 個(gè)細(xì)胞的胚柄；(D) 16 細(xì)胞球形胚: 8 細(xì)胞胚的所有細(xì)胞經(jīng)過(guò)1 次平周分裂, 產(chǎn)生包含8 個(gè)細(xì)胞的表皮原和8 個(gè)細(xì)胞的內(nèi)部組織；(E) 早期心形胚；(F) 心形胚: 子葉和胚根原基已經(jīng)出現(xiàn)；(G) 成熟胚胎。 1: 頂細(xì)胞; 2 : 基細(xì)胞; 3: 胚根原細(xì)胞, 形成未來(lái)的ROC 和根冠中央?yún)^(qū); RM: 根尖生長(zhǎng)點(diǎn); SM: 莖尖生長(zhǎng)點(diǎn) 雙子葉植物的胚胎發(fā)育過(guò)程雙子葉植物的胚胎發(fā)育過(guò)程花粉培養(yǎng)單細(xì)胞懸浮培養(yǎng)原生質(zhì)體培養(yǎng)組織器官培養(yǎng)體細(xì)胞胚花粉胚非合子胚非合子細(xì)胞合子胚無(wú)融合生殖胚*大量研究

3、表明，大多數(shù)植物組織培養(yǎng)，單細(xì)胞懸浮培養(yǎng)、原生質(zhì)體培養(yǎng)和花粉培養(yǎng)中都觀察到體細(xì)胞胚胎發(fā)生或花粉胚胎發(fā)生（pollen embryogenesis） *前者為二倍體的體細(xì)胞產(chǎn)生的胚狀結(jié)構(gòu) *后者是由小孢子或其分裂產(chǎn)物等單倍體細(xì)胞產(chǎn)生的體細(xì)胞胚，通常稱花粉胚（pollen embryos），可發(fā)育成單倍體植株。*體細(xì)胞胚或花粉胚都是指在植物組織培養(yǎng)中起源于一個(gè)非合子細(xì)胞，經(jīng)過(guò)胚胎發(fā)生和胚胎發(fā)育過(guò)程形成的胚狀結(jié)構(gòu)，包括以下幾點(diǎn)含義： 1 1、體細(xì)胞胚是組織培養(yǎng)的產(chǎn)物，區(qū)別于無(wú)融合生殖的胚，只限于在組織培養(yǎng)范圍使用； 2 2、體細(xì)胞胚起源于非合子細(xì)胞，區(qū)別于合子胚； 3 3、體體細(xì)胞胚細(xì)胞胚的形成經(jīng)歷

4、胚胎發(fā)育過(guò)程，區(qū)別于組織培養(yǎng)的器官發(fā)生中芽與根的分化。植物體細(xì)胞胚胎發(fā)生和誘導(dǎo)器官發(fā)生相比具有明顯的特點(diǎn)： 1、具有兩極性 2、存在生理隔離 3、遺傳性相對(duì)穩(wěn)定 4、重演受精卵形態(tài)發(fā)生的特性 二、體細(xì)胞胚胎發(fā)生的方式 *植物組織培養(yǎng)過(guò)程中植物體細(xì)胞胚胎途徑可歸納為兩類：直接途徑和間接途徑。 *直接途徑是直接從原外植體不經(jīng)愈傷組織階段發(fā)育而成 *間接方式是體胚從愈傷組織或懸浮細(xì)胞、有時(shí)也從已形成的體胚的一組細(xì)胞中發(fā)育而成，如香雪蘭（Freesia refracta）花序外植體經(jīng)直接體細(xì)胞胚胎發(fā)生途徑形成再生植株。 *外植體形態(tài)學(xué)極性決定體細(xì)胞胚胎發(fā)生，所有體細(xì)胞胚都出現(xiàn)在花序軸切段的原形態(tài)學(xué)下端

5、。1 直接途徑 直接發(fā)生體胚的來(lái)源細(xì)胞可以是外植體表皮、亞表皮、幼胚、懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞和原生質(zhì)體。 一般認(rèn)為直接方式發(fā)生體胚是由原先就存在于外植體中的胚性細(xì)胞預(yù)胚胎決定細(xì)胞（PEDCs）培養(yǎng)后直接進(jìn)入胚胎發(fā)生而形成體胚，如柑桔屬的珠心組織（在體內(nèi)或離體情況）通過(guò)預(yù)胚胎決定細(xì)胞直接進(jìn)行體胚發(fā)生的最好例子. 2 間接途徑 間接體細(xì)胞胚胎發(fā)生中，外植體已分化的細(xì)胞先脫分化，并對(duì)其發(fā)育命運(yùn)重決定而誘導(dǎo)出胚性細(xì)胞誘導(dǎo)胚胎決定細(xì)胞（IEDCs），進(jìn)而形成體細(xì)胞胚。 1 莖尖培養(yǎng)誘導(dǎo)形成胚性愈傷組織 MS培養(yǎng)基附加2.0mg/L 2,4-D2 胚性愈傷組織懸浮培養(yǎng)增殖 MS培養(yǎng)基附加2.0mg/L 2,4-D

6、3 由細(xì)胞集合體形成體細(xì)胞胚 MS培養(yǎng)基附加2.0mg/L 2,4-D 4 體細(xì)胞胚萌發(fā)并形成小植株 MS培養(yǎng)基附加1.0mg/L ABA 圖 甘薯品種栗子香胚性愈傷組織誘導(dǎo)體細(xì)胞胚和再生小植株 胚性細(xì)胞團(tuán)特征：成簇、成團(tuán)，體積小，細(xì)胞質(zhì)致密三、體細(xì)胞胚的起源 *體細(xì)胞胚胎發(fā)生途徑有直接途徑和間接途徑，但無(wú)論哪一種發(fā)生途徑，絕大多數(shù)研究報(bào)道認(rèn)為體細(xì)胞胚胎起源于單細(xì)胞,從多種植物中都觀察到單個(gè)胚性細(xì)胞，有不均等分裂的二細(xì)胞原胚和均等分裂的二細(xì)胞原胚、多細(xì)胞原胚、球形胚直到成熟胚。也有研究認(rèn)為起源于多細(xì)胞。 *在同一塊愈傷組織或一個(gè)胚性細(xì)胞復(fù)合體上可以觀察到多個(gè)不同發(fā)育時(shí)期的體細(xì)胞胚，從單個(gè)原始細(xì)

7、胞到多細(xì)胞的原胚、球形胚、魚(yú)雷胚直至具子葉的胚狀體，這是由體細(xì)胞胚發(fā)生和分裂的不同步所致。 香蕉心形體細(xì)胞胚 可可心形胚A和球形胚B A AB B1 1 體細(xì)胞胚的單細(xì)胞起源體細(xì)胞胚的單細(xì)胞起源野胡蘿卜的胚狀體 A. 心形期胚狀體 B. 成熟胚狀體 C. 早心形期胚狀體 D. 兩個(gè)成熟胚狀體共一個(gè)胚柄 a) 胚性細(xì)胞第一次分裂； b-d) 原胚第一次細(xì)胞分裂，鱷梨樹(shù)形胚柄細(xì)胞仍保持單個(gè)細(xì)胞； e) 胚柄細(xì)胞開(kāi)始增殖；f-k) 原胚和胚柄發(fā)育的不同時(shí)期； l)球形體細(xì)胞胚。 (ep)=原胚； (s)=胚柄圖 仙人掌科體細(xì)胞胚胎早期發(fā)育（由單細(xì)胞形成球形胚時(shí)期）a 胚性葉片愈傷組織；b 球形細(xì)胞；

8、c 伸長(zhǎng)細(xì)胞；d 兩個(gè)細(xì)胞時(shí)期； e 四個(gè)細(xì)胞時(shí)期； f 原胚； g 球形胚；h 心形胚；i 早期魚(yú)雷胚； j 成熟魚(yú)雷胚； k 不同時(shí)期的體細(xì)胞胚；l 體細(xì)胞胚的萌發(fā)； m 再生小植株。圖 木豆幼苗葉片愈傷組織懸浮培養(yǎng)體細(xì)胞胚發(fā)育過(guò)程 *有的學(xué)者觀察到體細(xì)胞胚來(lái)源于多細(xì)胞組成的胚性細(xì)胞復(fù)合體，王亞馥等人也觀察到這種胚性細(xì)胞團(tuán)，但用同位素脈沖標(biāo)記實(shí)驗(yàn)即可證明這些細(xì)胞團(tuán)也是由一個(gè)單細(xì)胞連續(xù)分裂而形成，經(jīng)進(jìn)一步分化和分裂形成不同發(fā)育時(shí)期的體細(xì)胞胚，因而這些體細(xì)胞胚實(shí)質(zhì)也可能是起源于單細(xì)胞。當(dāng)然也不排除有些植物的體細(xì)胞胚的確是起源于多細(xì)胞，仍有待深入研究。 *總之，體細(xì)胞胚胎的發(fā)生是一個(gè)非常復(fù)雜的生

9、理過(guò)程，仍有許多問(wèn)題尚需進(jìn)一步研究。2 2 體細(xì)胞胚的多細(xì)胞起源體細(xì)胞胚的多細(xì)胞起源 四、體細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)榕咝约?xì)胞的機(jī)制 *合子胚來(lái)源于受精卵；體細(xì)胞胚是非合子胚，未經(jīng)過(guò)雌雄配子受精這一過(guò)程，Somatic Embryos 又是如何形成？ 機(jī)制是什么？*體細(xì)胞胚無(wú)論起源于哪一種細(xì)胞，都存在著一個(gè)共同的問(wèn)題，即體細(xì)胞是如何轉(zhuǎn)變?yōu)榕咝约?xì)胞而形成體細(xì)胞胚的。大量研究事實(shí)表明，植物細(xì)胞在一定培養(yǎng)條件下，具胚胎發(fā)生能力可能是一個(gè)普遍現(xiàn)象。 1 體細(xì)胞胚發(fā)生理論漸變理論 （1）體細(xì)胞胚胎發(fā)生實(shí)質(zhì) *體細(xì)胞胚胎發(fā)生實(shí)質(zhì)是細(xì)胞分化的問(wèn)題，而細(xì)胞分化的分子基礎(chǔ)則是基因差別表達(dá)與調(diào)控的結(jié)果。有關(guān)細(xì)胞分化的分子機(jī)制有許

10、多理論，其中最具普遍性的是漸變理論，認(rèn)為一個(gè)細(xì)胞系的細(xì)胞質(zhì)因子間的互相作用是一個(gè)原發(fā)穩(wěn)定基因組中基因活化的結(jié)果，從而使該細(xì)胞系與其它細(xì)胞系不同。 外植體脫分化愈傷組織細(xì)胞分化胚性細(xì)胞非胚性細(xì)胞基因調(diào)控（2）漸變理論認(rèn)為細(xì)胞分化可分為幾個(gè)階段？ 分為兩個(gè)階段： 第一階段為預(yù)定階段，細(xì)胞接受了或預(yù)定了特殊發(fā)育命運(yùn)，但并未表現(xiàn)出可見(jiàn)的特化標(biāo)志，這種特性一旦建立就可以在細(xì)胞繼代培養(yǎng)中得以穩(wěn)定保持。 第二階段是表達(dá)階段，在適宜條件誘導(dǎo)下，預(yù)定的細(xì)胞（pro-embroygenic determined cells, PEDC）發(fā)生一系列生理生化和形態(tài)上的變化，表現(xiàn)出分化的特性，但由于這種表達(dá)與培養(yǎng)過(guò)程中

11、誘導(dǎo)因素關(guān)系密切，而表現(xiàn)為一種生理反應(yīng)，是不穩(wěn)定的。（3）漸變理論的不足 （一）未揭示體細(xì)胞胚胎發(fā)生的實(shí)質(zhì)，以及細(xì)胞的預(yù)定性是如何實(shí)現(xiàn)的問(wèn)題。 （二）不能解釋經(jīng)多次繼代培養(yǎng)的細(xì)胞往往會(huì)失去胚胎發(fā)生能力，因其理論認(rèn)為預(yù)定性細(xì)胞在以后的培養(yǎng)過(guò)程中處于穩(wěn)定狀態(tài)。 （三）不能解釋體細(xì)胞胚胎直接發(fā)生途徑和間接發(fā)生途徑可因條件不同而相互轉(zhuǎn)化的問(wèn)題。 *按預(yù)決定觀點(diǎn)，從外植體組織或細(xì)胞直接形成體細(xì)胞胚的途徑，需要一種誘導(dǎo)物的合成或抑制物的消除，來(lái)恢復(fù)有絲分裂活動(dòng)和促進(jìn)胚胎發(fā)育。這時(shí)生長(zhǎng)素對(duì)胚胎發(fā)生常起抑制作用，去掉生長(zhǎng)素并給以必要的條件就使細(xì)胞進(jìn)入分裂周期，并進(jìn)行胚胎發(fā)生的表達(dá)。 *從外植體經(jīng)過(guò)脫分化形成愈

12、傷組織，間接產(chǎn)生體細(xì)胞胚的途徑，則需要分化細(xì)胞的重新預(yù)決定，稱為誘導(dǎo)的胚胎預(yù)決定的細(xì)胞（induced embroygenically determined cells,IEDC），這時(shí)則需要生長(zhǎng)素，誘導(dǎo)細(xì)胞進(jìn)入細(xì)胞周期。生長(zhǎng)素不僅作為使細(xì)胞發(fā)生分裂所必需的物質(zhì)，而且也是使細(xì)胞進(jìn)入胚胎狀態(tài)所必需的因素。 （4）按預(yù)決定觀點(diǎn)，生長(zhǎng)素對(duì)由直接途徑和間接途徑體細(xì)胞胚發(fā)生的作用五、體細(xì)胞胚發(fā)育成植株的能力1 體細(xì)胞胚發(fā)育成植株的能力 *一般來(lái)說(shuō)胚胎一旦被分化出來(lái)或甚至完成誘導(dǎo)之后轉(zhuǎn)移到基本培養(yǎng)基上即可發(fā)育成熟，并可形成小植株。 *如陳東方等（1986）對(duì)棒頭草幼穗培養(yǎng)的研究表明，體細(xì)胞胚形成之后，可以

13、在原來(lái)培養(yǎng)基上或MS無(wú)任何附加成分的培養(yǎng)基上以及1/2MS加IAA或NAA 0.5mg/L和6-BA 0.5mg/L培養(yǎng)基上萌發(fā)形成小植株。 1 莖尖培養(yǎng)誘導(dǎo)形成胚性愈傷組織 MS培養(yǎng)基附加2.0mg/L 2,4-D2 胚性愈傷組織懸浮培養(yǎng)增殖 MS培養(yǎng)基附加2.0mg/L 2,4-D3 由細(xì)胞集合體形成體細(xì)胞胚 MS培養(yǎng)基附加2.0mg/L 2,4-D 4 體細(xì)胞胚萌發(fā)并形成小植株 MS培養(yǎng)基附加1.0mg/L ABA 圖 甘薯品種栗子香胚性愈傷組織誘導(dǎo)體細(xì)胞胚和再生小植株 2 體細(xì)胞胚萌發(fā)的兩種不正?，F(xiàn)象 體細(xì)胞胚萌發(fā)時(shí)觀察到兩種不正常萌發(fā)現(xiàn)象： *一種是不完全萌發(fā)，即只有芽而無(wú)根或只有根

14、而無(wú)芽. *另一種是早熟萌發(fā)，即體胚還未表現(xiàn)出完整的胚結(jié)構(gòu)之前就已萌發(fā)，萌發(fā)時(shí)盾片膨大形成一葉狀體，在葉狀體基部長(zhǎng)出芽。注意：體細(xì)胞胚胎途徑的形態(tài)發(fā)生能力要比器官分化途徑保持更長(zhǎng)久。 六、影響體細(xì)胞胚發(fā)生的因素 （a）不同基因型體細(xì)胞胚誘導(dǎo)率； （b）不同基因型每個(gè)胚性外植體上體細(xì)胞胚的數(shù)目 圖6.7 在相同培養(yǎng)基上Feijoa sellowiana Berg不同基因型體細(xì)胞胚誘導(dǎo) （引自Miguel等，2001）n*離體植物細(xì)胞在開(kāi)始往往缺乏合成生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素的能力，但是在大多數(shù)情況下，這些細(xì)胞的分裂和分化以及形態(tài)建成過(guò)程中又必需生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素兩種激素的共同作用。 n*在培養(yǎng)介質(zhì)中添

15、加不同種類或不同濃度的外源激素誘導(dǎo)形態(tài)發(fā)生已受到廣泛的重視。 n*但最關(guān)鍵的是組織內(nèi)部和體細(xì)胞胚發(fā)生部位的內(nèi)源激素代謝動(dòng)態(tài)和平衡。n早在胡蘿卜細(xì)胞懸浮培養(yǎng)體細(xì)胞胚發(fā)生中發(fā)現(xiàn)，2，4-D在誘導(dǎo)胚性細(xì)胞早期是必需的，而且2，4-D是通過(guò)影響IAA結(jié)合蛋白起作用，其實(shí)質(zhì)是促進(jìn)IAA結(jié)合蛋白的形成，提高細(xì)胞對(duì)IAA的敏感性從而誘導(dǎo)胚性細(xì)胞的形成。n水稻細(xì)胞培養(yǎng)中也發(fā)現(xiàn)，由于2,4-D促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)源IAA含量提高進(jìn)而誘導(dǎo)胚性細(xì)胞的形成，并認(rèn)為內(nèi)源IAA含量上升或維持在較高水平，是胚性細(xì)胞出現(xiàn)的一個(gè)共同標(biāo)志。 n一些研究表明，ABA對(duì)植物體細(xì)胞胚的發(fā)生與發(fā)育具有重要作用。 n外源ABA與內(nèi)源ABA對(duì)體細(xì)胞胚

16、發(fā)生起到相互調(diào)節(jié)和促進(jìn)的作用，而且通過(guò)補(bǔ)充提高外源ABA，可以明顯提高體細(xì)胞胚發(fā)生的頻率與質(zhì)量。n荔枝體細(xì)胞胚胎發(fā)生早期的內(nèi)源激素ABA與IAA和ABA與CTK（細(xì)胞分裂素）的質(zhì)量比增大，將有利于荔枝體細(xì)胞球形胚的形成。n 2，4-D與體細(xì)胞胚發(fā)生 n2，4-D是誘導(dǎo)多種植物離體培養(yǎng)體細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)榕咝约?xì)胞的重要激素。 n單子葉植物和雙子葉植物誘導(dǎo)體細(xì)胞胚胎發(fā)生時(shí)，所要求的2,4-D的濃度不同，對(duì)單子葉植物而言，一般要求較高濃度的2,4-D，其濃度范圍為0.5-5mg/L，通常使用濃度為2mg/L； n而對(duì)雙子葉植物而言，一般要求較低濃度的2,4-D，其濃度范圍為0.02-1mg/L，通常使用的濃

17、度為0.1mg/L。n在體細(xì)胞胚胎發(fā)生的誘導(dǎo)階段，培養(yǎng)基中必需添加2,4-D，而在體細(xì)胞胚胎形成階段，要降低培養(yǎng)基中2,4-D的濃度或去除2,4-D，以保證體細(xì)胞胚的正常生長(zhǎng)。 n在胡蘿卜細(xì)胞培養(yǎng)中，加入2，4-D后誘導(dǎo)一些特異性多肽或蛋白質(zhì)形成，當(dāng)去除生長(zhǎng)素后，這些多肽和蛋白質(zhì)也隨之消失。但在誘導(dǎo)出胚性細(xì)胞后，及時(shí)除去培養(yǎng)基中的2，4-D，胚性細(xì)胞在進(jìn)一步分化和發(fā)育的同時(shí)釋放糖蛋白GP65（65kDa）表 在MS固體培養(yǎng)基上不同濃度2,4-D對(duì)木豆幼苗葉片外植體誘導(dǎo)和原胚細(xì)胞形成的影響2,4-D(M) Callus induction(%) Proembryonic cell*(%) 0.0

18、0 0.0 0.0 2.26 3.2d 3.4d 4.52 7.4c 10.2c 6.78 38.6a 37.4a 9.04 18.2b 12.8b 11.30 3.6c 2.2c 表 在具有不同濃度2,4-D的MS液體培養(yǎng)基上木豆不同時(shí)期體細(xì)胞胚誘導(dǎo)率2,4-D(M) 收集細(xì)胞的體積 (10th day) 體細(xì)胞胚發(fā)育時(shí)期 球形胚(%) 心形胚(%) 魚(yú)雷胚(%) 0.00 0 0 0 0 1.12 2.8e 2.4e 1.8e 1.2e 2.26 3.2d 7.6d 2.4d 1.6d 3.38 4.6c 20.2b 8.2b 5.2b 4.52 5.2b 36.2a 20.4a 16.4

19、a 5.64 5.6b 18.6c 6.6c 3.6c 6.78 6.2a 7.4d 1.6e 1.2e Origin of embryoids in embryo-derived callus culture. (a) Single cells (arrow) and two-celled stage (double arrows). x137. (b)Four-celled stage (arrowhead). x137. (c) Multicelled proembryo containing eight to ten cells. x137 (d) Epidermized lobula

20、r stage. x34. (e) Heart shape embryoid that remain in the callus. X34. (f) Several compact embryoids in different stages of formation. x14.A,C,E為離體培養(yǎng)6周后的體細(xì)胞胚；B,D,F為離體培養(yǎng)5個(gè)月后形成的體細(xì)胞胚 A:品種GK7 ，在添加83.0 mM centrophenoxine培養(yǎng)基上; B: 品種AT120，在添加124.4 mM centrophenoxine培養(yǎng)基上; C: 品種59-4144，在添加12.4 mM dicamba培養(yǎng)基上

21、; D:品種AT120，在添加83.0 mM dicamba培養(yǎng)基上; E: 品種VC1，在添加83.0 mM picloram培養(yǎng)基上; and F:品種VC1，在添加124.4 mM picloram培養(yǎng)基上. 圖 含不同種類和不同濃度生長(zhǎng)素固體培養(yǎng)基上成熟花生胚軸體細(xì)胞胚誘導(dǎo) n 其它生長(zhǎng)激素與體細(xì)胞胚發(fā)生 n除2,4-D外，ABA對(duì)植物體細(xì)胞胚的發(fā)生也起到重要的調(diào)控作用。 n研究表明，ABA具有促進(jìn)藶蒿體細(xì)胞胚結(jié)構(gòu)正?；娘@著效應(yīng)。 n在濃度適宜時(shí)，ABA能抑制多種異常體細(xì)胞胚的發(fā)生，而且ABA加入培養(yǎng)基的時(shí)間愈早其效應(yīng)也越明顯。 n較低濃度的ABA對(duì)保持秈稻愈傷組織的胚性結(jié)構(gòu)具有重要

22、意義，可明顯提高這種胚性愈傷組織分化出苗率。 n在拐芹中ABA與NAA共同作用可誘導(dǎo)一些游離氨基酸含量的變化和特異蛋白的形成。 nABA和PEG對(duì)胡蘿卜(Daucus carota L.)體細(xì)胞胚發(fā)生具有調(diào)控作用3 多胺（腐胺、尸胺、亞精胺、高亞精胺、精胺等）和乙烯與體細(xì)胞胚發(fā)生 *外源多胺對(duì)體胚發(fā)生的作用除了取決于植物種類及其內(nèi)源多胺的狀況之外，還關(guān)系到它們?nèi)绾伪晃铡⑦\(yùn)輸及降解等問(wèn)題。多胺與體細(xì)胞胚發(fā)生的關(guān)系在胡蘿卜的研究中較多。舉例說(shuō)明： *已發(fā)現(xiàn)胡蘿卜的胚性細(xì)胞中腐胺、精胺含量比非胚性的高，在胡蘿卜體細(xì)胞胚發(fā)生的前胚時(shí)期多胺含量一般較低，從球形胚、心形胚到魚(yú)雷胚時(shí)期，精胺和亞精胺逐漸升

23、高，心形胚時(shí)期以腐胺為主，魚(yú)雷胚時(shí)期則富含亞精胺。 *在胡蘿卜愈傷組織的體細(xì)胞胚發(fā)生中發(fā)現(xiàn)乙烯抑制體細(xì)胞胚的發(fā)生，而乙烯形成酶抑制劑Ni2+、Co2+可以促進(jìn)其體細(xì)胞胚發(fā)生。 *有研究表明，只在胚細(xì)胞分化早期才與多胺生物合成關(guān)系較密切。4 糖類和金屬離子與體細(xì)胞胚發(fā)生 糖類 *糖類對(duì)誘導(dǎo)植物體細(xì)胞胚發(fā)生也是不可缺少的重要成分。 *研究表明，小麥的愈傷組織一旦分化為胚性細(xì)胞后就有淀粉粒的積累，在胚性細(xì)胞分化與發(fā)育的整個(gè)過(guò)程中，淀粉的兩次合成高峰均在發(fā)育的重要轉(zhuǎn)折期，為體細(xì)胞胚的進(jìn)一步發(fā)育和分化提供必要物質(zhì)和能量基礎(chǔ)。淀粉的積累與胚性細(xì)胞分化能力和體細(xì)胞胚發(fā)育時(shí)期的轉(zhuǎn)折密切有關(guān)。 *在茴香的胚性細(xì)

24、胞中也富含淀粉粒，在體細(xì)胞胚發(fā)育中同樣出現(xiàn)兩次峰值，同時(shí)認(rèn)為淀粉出現(xiàn)的峰值與核酸和蛋白質(zhì)合成密切相關(guān)，因此，表明淀粉為蛋白質(zhì)和核酸的合成奠定了物質(zhì)基礎(chǔ)。 碳水化合物 濃度（mM） 胚胎發(fā)育時(shí)期 球形胚（） 心形胚（） 魚(yú)雷胚（） 葡萄糖 Glucose 55.49 2.4f 1.2h 1.2g 110.99 6.8f 2.6h 2.4f 166.48 10.2e 5.0f 4.2e 221.98 13.6c 7.2d 6.4d 果糖 Fructose 55.49 6.2f 2.8g 2.4f 110.99 12.4c 5.2f 4.6c 166.48 6.4f 5.0f 4.2e 221.98

25、 2.4h 1.2h 1.2g 蔗糖 Sucrose 29.21 12.4c 6.8c 6.2d 58.43 20.2b 16.2b 14.6b 87.64 36.2a 20.4a 16.4a 116.86 12.6d 10.2c 8.4c 麥芽糖 Maltose 27.75 2.4h 1.2h n.d 55.51 5.4g 2.6g 1.2g 83.26 1.2i n.d n.d 111.02 n.d n.d n.d 表 在4.52M/L 2,4-D培養(yǎng)基上不同碳水化合物 對(duì)木豆愈傷組織懸浮培養(yǎng)體細(xì)胞胚發(fā)生的影響 金屬離子 *金屬離子對(duì)體細(xì)胞胚的發(fā)生也有影響。 *在小麥愈傷組織誘導(dǎo)體細(xì)胞胚發(fā)

26、生中也發(fā)現(xiàn)Zn2+、Cu2+、Co2+、Mn2+等金屬離子具有重要的促進(jìn)作用，不僅可提高誘導(dǎo)頻率，而且還可以加速胚性愈傷組織的形成，因此，在培養(yǎng)基中加入適合濃度金屬離子可提高體細(xì)胞胚發(fā)生的頻率。 *有研究表明，金屬離子可能是通過(guò)促進(jìn)多胺合成而提高體細(xì)胞胚發(fā)生頻率。 5 外植體與體細(xì)胞胚發(fā)生 不同基因型、外植體體細(xì)胞胚發(fā)生能力不同。如胡蘿卜子葉不同部位培養(yǎng)誘導(dǎo)的發(fā)育過(guò)程不同。只有表皮下細(xì)胞具有真正細(xì)胞全能性和有能力直接產(chǎn)生體細(xì)胞胚（胚胎發(fā)生區(qū)），而不用通過(guò)愈傷組織階段的誘導(dǎo)。 表皮下細(xì)胞 根發(fā)生區(qū)細(xì)胞 芽發(fā)生區(qū)細(xì)胞 胡蘿卜子葉不同部位外植體示意圖6 光與體細(xì)胞胚發(fā)生品種JackJack（光照強(qiáng)度

27、50-60 E m2 s-1） 品種 FayetteFayette（光照強(qiáng)度50-60 E m2 s-1） 品種JackJack（光照強(qiáng)度5-10 E m2 s-1） 品種FayetteFayette（光照強(qiáng)度5-10 E m2 s-1） (圖 光對(duì)大豆不同品種子葉體細(xì)胞胚發(fā)生的影響 )第二節(jié)第二節(jié) 人工種子人工種子一、人工種子的概念人工種子：又稱合成種子或體細(xì)胞種子，是指將植物離體培養(yǎng)的胚狀體或芽包裹在含有養(yǎng)分和保護(hù)功能的人工胚乳和人工種皮中的類似種子的顆粒。*人工種子可在一定條件下萌發(fā)生長(zhǎng)，形成完整的植株。人工種子 依靠植物細(xì)胞“全能性”，美國(guó)首先發(fā)明“人工種子” 人工種子www.agr.

28、hokudai.ac.jp 不定胚形成人工種子www.brs.nihon-u.ac.jp 人工種子大量生產(chǎn) kankyo08.en.a.u-tokyo.ac.jp 人工種子結(jié)構(gòu)示意圖二、人工種子研究歷史 *1978年Murashige提出人工種子概念 *1986年Redenbaugh等成功地利用藻酸鈉包埋單個(gè)體細(xì)胞胚，生產(chǎn)人工種子。 *胡蘿卜、棉花、玉米、甘藍(lán)、萵苣、苜蓿等人工種子制作獲得成功。 *在我國(guó)人工種子的研究已列入重點(diǎn)攻關(guān)項(xiàng)目，并已取得一些重要的研究成果。 n三、人工種子各部分功能 n 1 體細(xì)胞胚 n為了使人工種子在一定條件下萌發(fā)生長(zhǎng)，并形成完整植株，人工種子首先應(yīng)該具備一個(gè)能夠很

29、好地發(fā)育成完整植株能力的胚，它具有胚根和胚芽的雙極性，經(jīng)原胚、球形胚、心形胚、魚(yú)雷胚和子葉形胚等不同階段發(fā)育而成。 n 2、人工胚乳 n人工胚乳為體細(xì)胞胚萌發(fā)提供營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。根據(jù)使用者的目的，可向人工胚乳內(nèi)自由添加有利于胚狀體正常萌發(fā)所需的各種營(yíng)養(yǎng)成分、防病蟲(chóng)物質(zhì)、植物激素等，也是人工種子優(yōu)越于天然種子之處。n四、人工種子種類 n 根據(jù)包裹體細(xì)胞胚材料的不同，可以將人工種子分為以下4種類型（Redenbaush等，1991）。 n（1）裸露的或休眠的繁殖體，可以直接播種，如休眠的微鱗莖和微型薯等。 n（2）人工種皮包裹的繁殖體。 n（3）水凝膠包埋的胚狀體、不定芽以及休眠的小鱗莖等繁殖體，水凝膠

30、中可含多種養(yǎng)分和激素，促進(jìn)繁殖體的生長(zhǎng)。 n（4）液膠包埋的繁殖體。 五、人工種子與天然種子比較有其自身的特點(diǎn)： （1）可對(duì)一些自然條件下不結(jié)實(shí)的或種子很昂貴的植物進(jìn)行繁殖。 （2）固定雜種優(yōu)勢(shì)，使Fl雜交種可多代利用，使優(yōu)良的單株能快速繁殖成無(wú)性系品種，從而大大縮短育種年限。 （3）節(jié)約糧食。 （4）在人工種子的包裹材料里加入各種生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)、菌 肥、農(nóng)藥等，可人為地影響控制作物生長(zhǎng)發(fā)育和抗性。 ( 5 )可以保存及快速繁殖脫病毒苗，克服某些植物由于長(zhǎng)期營(yíng)養(yǎng)繁殖所積累的病毒病等。 ( 6 )與試管苗相比成本低，運(yùn)輸方便(體積小)，可直接播種和機(jī)械化操作。 六、目前人工種子涉及的問(wèn)題 1、高質(zhì)

31、量和數(shù)量體細(xì)胞胚的誘導(dǎo)。 2、體細(xì)胞胚發(fā)生的同步控制。 3、人工種皮的制造與生產(chǎn)。 4、人工胚乳的研制。 5、工藝流程。 6、貯藏。 *獲得體細(xì)胞胚是生產(chǎn)人工種子的基礎(chǔ)，其發(fā)生頻率的高低、胚的質(zhì)量和體細(xì)胞胚發(fā)生的同步控制是生產(chǎn)人工種子的關(guān)鍵。*人工種子制備包括胚狀體的誘導(dǎo)與同步化、人工種子的包埋、人工胚乳的制作、人工種皮的制作、人工種子貯藏等步驟內(nèi)容。 1、高質(zhì)量和高產(chǎn)量的體細(xì)胞胚誘導(dǎo)與同步化控制 體細(xì)胞胚的誘導(dǎo)與同步化控制方法： 七 人工種子的研制體細(xì)胞胚誘導(dǎo)與同步化控制體細(xì)胞胚誘導(dǎo)與同步化控制 a 成熟的體細(xì)胞胚；b 用無(wú)菌吸管吸取與包埋劑混合的體細(xì)胞胚 c 帶體細(xì)胞胚的液滴滴入2CaCl

32、2溶液后形成的白色半透明的包埋丸； d 人工種皮包埋制成的人工種子 人工種子的制人工種子的制備備苜蓿體細(xì)胞胚的生產(chǎn)與植株的獲得苜蓿體細(xì)胞胚的生產(chǎn)與植株的獲得www.plant.uoguelph.ca/research/embryo/embryo.htm 2、人工種子包埋 獲得發(fā)育正常、形態(tài)上較為一致的體細(xì)胞胚后，就要用適合的材料進(jìn)行包埋。進(jìn)行包埋時(shí)應(yīng)做到以下幾點(diǎn)： （1）包埋材料必須對(duì)體細(xì)胞胚無(wú)損害和無(wú)毒性，并能保護(hù)胚和胚發(fā)芽的能力； （2）同時(shí)在制造、貯藏、運(yùn)輸和種植過(guò)程中必須具有耐久性； （3）膠囊必須含有養(yǎng)分和植物激素以及植物生長(zhǎng)和發(fā)育所需的成分和水分，并要求制作的人工種子適合于農(nóng)業(yè)機(jī)械

33、化播種。 3 包埋方法： 經(jīng)研究認(rèn)為藻酸鹽所形成的膠囊是目前最好的凝膠包埋材料，所采用的主要方法是滴注和裝膜兩種。 （1）滴注法 制備人工種子是將選擇好的體細(xì)胞胚懸浮于含2%3%的藻酸鈉溶液中，然后用一個(gè)塑料吸管吸注含體細(xì)胞胚的藻酸鈉懸滴加入到0.1mol/LCaCl2溶液中，這時(shí)離子間發(fā)生交換而形成膠囊，膠囊的直徑依賴于吸管的內(nèi)徑和吸注的速度，膠囊的大小，視體細(xì)胞胚的大小和發(fā)芽能力而定，一般采用吸管口徑為34mm，可得直徑為45mm的膠囊。體細(xì)胞胚包在膠囊中的位置不宜處在中央，宜偏在一邊以利萌發(fā)。至于聚合時(shí)間長(zhǎng)短則依賴于所用試劑濃度。一般藻酸鈉的濃度控制在23%，在CaCl2中停留實(shí)踐不要超

34、過(guò)10min，以免膠囊太硬而影響發(fā)芽。形成膠囊后轉(zhuǎn)入無(wú)菌水中沖洗，最后在1/2MS培養(yǎng)基上作發(fā)芽和轉(zhuǎn)換試驗(yàn)或進(jìn)一步包裹人工種皮。 滴注法人工種子包埋過(guò)程示意圖（2）裝膜法 制備人工種子是把體細(xì)胞胚混合到一個(gè)溫度較高的膠液中，然后滴注到一個(gè)有小坑的微滴板上，隨著溫度降低變?yōu)槟z而形成膠丸。 4、人工種皮的研制 美國(guó)杜邦公司生產(chǎn)的Elvax4260是一種較好的“人工種皮”材料，是由乙烯、乙酸和丙烯酸三種物質(zhì)共聚的產(chǎn)物，用它作為人工種子最外層的包裹劑，即人工種皮取得較好效果 。 2、用Elvax作為人工種皮的具體操作程序?yàn)椋?（1）、將4g藻酸鈣膠囊置于20mL含0.1g葡萄糖和含0.2mL甘油的氫

35、氧化鈉溶液中攪拌1min； （2）、在50mL環(huán)乙烷中加入10%的Elvax4260; （3）、在40條件下溶解5g硬脂酸，10g鯨醋醇和25g鯨醋取代物，另加295mL石油醚和155mL二氯甲烷； (4)、 將藻酸鈣膠囊放在上述的混合液中浸泡10s，取出后用熱風(fēng)吹干。如此重復(fù)45次，最后用石油醚沖洗干凈，經(jīng)尼龍布過(guò)慮后在空氣中風(fēng)干即可。體細(xì)胞胚與人工種子 1、人工種子轉(zhuǎn)換定義 *轉(zhuǎn)換（Transformation）指人工種子在一定條件下，萌發(fā)、生長(zhǎng)、形成完整植株的過(guò)程。 2、轉(zhuǎn)換方法 *轉(zhuǎn)換的方法可分為無(wú)菌條件下的轉(zhuǎn)換和土壤條件下的轉(zhuǎn)換。 八、人工種子的轉(zhuǎn)換試驗(yàn)（1）、無(wú)菌條件的轉(zhuǎn)換：其也稱

36、離體條件的轉(zhuǎn)換。一般是將新制成的人工種子播種在1/4MS培養(yǎng)基，附加1.5%麥芽糖、8g/L的瓊脂中，培養(yǎng)后統(tǒng)計(jì)人工種子形成完整植株的數(shù)目，即人工種子的轉(zhuǎn)化率。 （2）、無(wú)菌條件轉(zhuǎn)換率的高低主要取決于： （a）、對(duì)提高體細(xì)胞胚質(zhì)量的培養(yǎng)基成分的研究； （b）、改進(jìn)轉(zhuǎn)換條件的研究。如麥芽糖代替蔗糖，有利于體細(xì)胞胚的萌發(fā)和轉(zhuǎn)換。 n體細(xì)胞胚發(fā)育成植株，大致經(jīng)歷幾個(gè)階段： n發(fā)芽 根系的發(fā)育 芽分生組織的生長(zhǎng)和發(fā)育 真葉的生長(zhǎng) 芽和根的連接 正常植株生長(zhǎng)蘭花人工種子的生產(chǎn)及其獲得的小植株（3）、土壤條件的轉(zhuǎn)換：也稱活體條件下的轉(zhuǎn)換。人工種子真正目的是直接播種于土壤，即在活體條件下，使轉(zhuǎn)換成功。 （4

37、）土壤條件下轉(zhuǎn)換采用方法： a、無(wú)土培養(yǎng)試驗(yàn)：目前以蛭石或珍珠巖試驗(yàn)較多，附加低濃度無(wú)機(jī)鹽，1/6的MS培養(yǎng)基，0.75%麥芽糖有利于轉(zhuǎn)換。 b、土壤試驗(yàn)：人工種子的土壤轉(zhuǎn)化試驗(yàn)報(bào)道較少。苜蓿人工種子的直接土壤轉(zhuǎn)化試驗(yàn)已達(dá)20%，水稻不定芽研制的人工種子經(jīng)適當(dāng)?shù)剡^(guò)渡性培養(yǎng)，在土壤中的轉(zhuǎn)化率為10%。 （5）、土壤條件的轉(zhuǎn)換人工種子轉(zhuǎn)化率低的主要限制因子 a、研究無(wú)機(jī)鹽在轉(zhuǎn)換中的重要性時(shí)表明，沒(méi)有硝酸鉀、硫酸鎂、氯化鈣時(shí)就不會(huì)發(fā)生轉(zhuǎn)換，缺乏磷酸銨，轉(zhuǎn)化率從30%降至5%。顯然這些無(wú)機(jī)鹽成分作為人工種子營(yíng)養(yǎng)肥料是不可缺少的。 b、0.75（W/V）的麥芽糖有利于提高轉(zhuǎn)化率。因此推測(cè)，碳源在人工種子

38、轉(zhuǎn)換中也是限制因子。 因此，必須在人工種子中貯藏必需的養(yǎng)分或供給外源營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。 n九、人工種子的儲(chǔ)藏與萌發(fā) n人工種子儲(chǔ)藏時(shí)間的長(zhǎng)短和萌發(fā)率的高低對(duì)人工種子的應(yīng)用至關(guān)重要。人工種子的壽命，其最理想的狀態(tài)是能夠與真正的合子胚種子的壽命一樣長(zhǎng)，只有這樣，才有利于人工種子的儲(chǔ)藏和萌發(fā)。 n此外，海藻酸鹽膠囊本身又抑制呼吸，更加縮短了體細(xì)胞胚的壽命。因此，儲(chǔ)藏和萌發(fā)是人工種子研制的主要難點(diǎn)之一。 n延長(zhǎng)人工種子儲(chǔ)藏時(shí)間和提高其萌發(fā)率的主要方法包括低溫法、干燥法、抑制法、液體石蠟法等以及這些方法的組合。 n干燥法和低溫法是目前應(yīng)用最多的方法。（1）低溫儲(chǔ)藏技術(shù) n低溫儲(chǔ)藏是指在不傷害植物繁殖體的前提下,

39、通過(guò)降低溫度來(lái)降低繁殖體的呼吸作用,使之進(jìn)入休眠狀態(tài)。 n 常用的溫度一般是4。在此溫度下體細(xì)胞胚人工種子可以儲(chǔ)存1-2 個(gè)月。n如茶枝柑( C itrusreticu la ta 的人工種子,儲(chǔ)存1個(gè)月仍具很高轉(zhuǎn)化率。泡桐( Pau low n ia elonga ta 的人工種子在儲(chǔ)藏30 d或60 d后體細(xì)胞胚的存活率分別是67. 8%和53. 5% ,萌發(fā)率分別是43. 2%和32. 4%。n非體細(xì)胞胚人工種子可以在4下儲(chǔ)藏更長(zhǎng)的時(shí)間,Mandal等( 2000對(duì)4 種羅勒屬( Ocim um )的植物腋芽進(jìn)行包被,可保存60 d,并使植物耐寒性提高。 nDatta 等( 1999 包被瀕危植物地寶蘭( Geodorum densif lorum )類原球體,儲(chǔ)藏120 d后,生存能力與儲(chǔ)藏前相比無(wú)明顯變化。 n馬鈴薯芽尖在MS培養(yǎng)基上培養(yǎng)2 d后,用海藻酸鈉包被,儲(chǔ)藏270 d、360 d和390 d 后在MS培養(yǎng)基上的萌發(fā)率分別是100%、70. 8%和25%。n由于人工種子沒(méi)有像自然種子一樣在儲(chǔ)藏前進(jìn)入休眠狀態(tài),隨著低溫儲(chǔ)存時(shí)間的加長(zhǎng),包被體系內(nèi)的含氧量降低,人工種子萌發(fā)率會(huì)下降n（2）液體石蠟儲(chǔ)藏技術(shù) n液體石蠟作為經(jīng)濟(jì)、無(wú)毒穩(wěn)定的液體物質(zhì),常被用來(lái)儲(chǔ)藏細(xì)菌、真菌和植物愈傷組織。美國(guó)已有報(bào)