OK利用脂肪酶催化菜籽油與甲醇進(jìn)行酯交換反應(yīng)制取生物柴油

1、摘 要非水相中的酶促酯交換反應(yīng)廣泛應(yīng)用于油脂的改性。該反應(yīng)通過酯交換替換甘三酯中的酰基基團(tuán)來改善油脂性質(zhì)。生物柴油作為一般石化燃料的良好替代品，其發(fā)展前景被世界發(fā)達(dá)國家普遍看好。本論文從降低生產(chǎn)成本和提高生物柴油品質(zhì)的角度出發(fā)，采用無溶劑系統(tǒng)作為反應(yīng)體系，利用脂肪酶催化菜籽油與甲醇進(jìn)行酯交換反應(yīng)制取生物柴油，簡單探討了生物柴油中甘油含量的測定方法和脂肪酶促酯交換制取生物柴油的反應(yīng)條件。采用萃取的方法從生物柴油中提取甘油，用高碘酸鈉氧化法對甘油含量進(jìn)行測定，證明了該方法對甘油含量測定的準(zhǔn)確性。進(jìn)而又嘗試了采用分批加入甲醇的方法來制取生物柴油，發(fā)現(xiàn)此法比一次性加入全部甲醇有更高的反應(yīng)轉(zhuǎn)化率，但是在

2、反應(yīng)歷程的實(shí)驗中，分批加入甲醇的方法還有待完善。關(guān)鍵詞：無溶劑系統(tǒng)；菜籽油；脂肪酶；酯交換反應(yīng)；生物柴油ABSTRACTEnzymatic interesterification in non-aqueous phase has been widely used for improving the quality of oil and fats. This reaction provides a useful alternative for replacing the acyl group of glycerides to modify oil and fats. Biodiesel is a

3、 good substitute for Petrochemical fuel, and developed country realize that it has good Development foreground. To reduce the product cost and improve the quality of Biodiesel, lipase-catalyzed interesterification of Vegetable oil with Methyl alcohol for Biodiesel production in a solvent free system

4、 was explored in this dissertation. The analytical method of Glycerin in Biodiesel and the optimization of reaction conditions were investigated systematically.Glycerin could be extracted from Biodiesel by extraction. And it could be analysised by Sodium Periodata oxidimetry. The accuracy of it has

5、been proved. Trying to join Methyl alcohol by several times in Biodiesel production, we found it was more effective than joining Methyl alcohol by one time. But it need to be improved in the experiment of reaction process.Keywords: Solvent free system; Vegetable oil; Lipase; Interesterification; Bio

6、diesel目 錄摘 要ABSTRACT第一章 緒 論11.1 生物柴油研究進(jìn)展11.1.1 生物柴油的化學(xué)組成及物理特性11.1.2 生物柴油生產(chǎn)研究狀況11.1.3 生物柴油的制備方法21.1.4 生物柴油生產(chǎn)原料41.2 生物催化與有機(jī)合成41.3 非水相酶學(xué)51.3.1 非水相酶學(xué)的興起51.3.2 非水相酶催化的優(yōu)點(diǎn)51.3.3 無溶劑系統(tǒng)61.4 脂肪酶的研究與應(yīng)用61.4.1 脂肪酶的研究概況61.4.2 脂肪酶的催化機(jī)制71.4.3 脂肪酶的底物特異性71.4.4 脂肪酶在油脂工業(yè)中的應(yīng)用81.5 菜籽油的研究與應(yīng)用91.5.1 菜籽油的性質(zhì)及組成91.5.2 菜籽油的工業(yè)用途

7、91.5.3 菜籽油甲酯化101.6 脂肪酶促酯交換反應(yīng)101.6.1 脂肪酶促酯交換反應(yīng)的催化機(jī)制101.6.2 菜籽油酶促酯交換生產(chǎn)生物柴油111.6.3 反應(yīng)體系含水量的影響11第二章 材料與方法132.1 實(shí)驗材料132.1.1 脂肪酶132.1.2 主要試劑及原料132.2 儀器設(shè)備132.3 實(shí)驗方法142.3.1 試劑的配制142.3.2 酸度計的校準(zhǔn)142.3.3 游離甘油含量測定152.3.4 總甘油含量測定15第三章 甘油含量標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制173.1 水中游離甘油測定方法研究173.2 菜籽油中游離甘油含量標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制18小 結(jié)19第四章 脂肪酶酯交換制取生物柴油的研究2

8、04.1 菜籽油中總甘油含量測定204.2 甲醇的添加對酯交換反應(yīng)的影響214.3 生物柴油反應(yīng)歷程實(shí)驗21小 結(jié)23結(jié)論與展望24參考文獻(xiàn)25致 謝30第一章 緒 論1.1 生物柴油研究進(jìn)展1.1.1 生物柴油的化學(xué)組成及物理特性柴油分子是由15個左右的碳鏈組成的,研究發(fā)現(xiàn)植物油分子則一般由1418個碳鏈組成,與柴油分子中碳數(shù)相近。因此生物柴油就是一種用油菜籽油等可再生植物油加工制取的新型燃料。按化學(xué)成分分析,生物柴油燃料是一種高脂酸甲烷,它是通過以不飽和油酸C18為主要成分的甘油脂分解而獲得的1。與常規(guī)柴油相比,生物柴油具有下述無法比擬的性能。(1)具有優(yōu)良的環(huán)保特性。主要表現(xiàn)在由于生物柴

9、油中硫含量低,使得二氧化硫和硫化物的排放低,可減少約30%(有催化劑時為70%);生物柴油中不含對環(huán)境會造成污染的芳香族烷烴,因而廢氣對人體損害低于柴油。檢測表明,與普通柴油相比,使用生物柴油可降低90%的空氣毒性,降低94%的患癌率;由于生物柴油含氧量高,使其燃燒時排煙少,一氧化碳的排放與柴油相比減少約10%(有催化劑時為95%);生物柴油的生物降解性高。(2)具有較好的低溫發(fā)動機(jī)啟動性能。無添加劑冷濾點(diǎn)達(dá)-20。(3)具有較好的潤滑性能。使噴油泵、發(fā)動機(jī)缸體和連桿的磨損率低,使用壽命長。(4)具有較好的安全性能。由于閃點(diǎn)高,生物柴油不屬于危險品。因此,在運(yùn)輸、儲存、使用方面的優(yōu)點(diǎn)是顯而易見

10、的。(5)具有良好的燃料性能。十六烷值高,使其燃燒性好于柴油,燃燒殘留物呈微酸性使催化劑和發(fā)動機(jī)機(jī)油的使用壽命加長。(6)具有可再生性能。作為可再生能源,與石油儲量不同其通過農(nóng)業(yè)和生物科學(xué)家的努力,可供應(yīng)量不會枯竭。生物柴油的優(yōu)良性能使得采用生物柴油的發(fā)動機(jī)廢氣排放指標(biāo)不僅滿足目前的歐洲號標(biāo)準(zhǔn),甚至滿足隨后即將在歐洲頒布實(shí)施的更加嚴(yán)格的歐洲號排放標(biāo)準(zhǔn)。而且由于生物柴油燃燒時排放的二氧化碳遠(yuǎn)低于該植物生長過程中所吸收的二氧化碳,從而改善由于二氧化碳的排放而導(dǎo)致的全球變暖這一有害于人類的重大環(huán)境問題。因此生物柴油是一種真正的綠色柴油2。1.1.2 生物柴油生產(chǎn)研究狀況德國的生物柴油主要是利用油菜籽

11、提煉而成，是目前生物柴油利用最廣泛的國家，其2002年消費(fèi)生物柴油達(dá)110萬t，占世界總消費(fèi)量210萬t的一半左右。在德國1.7萬家加油站中，有1400個生物柴油加油站。德國政府鼓勵使用生物柴油，對生物柴油生產(chǎn)企業(yè)全額免除稅收，致使其價格低于普通柴油，目前每升生物柴油零售價比普通柴油便宜310歐分3。另外，美國、意大利、日本等國也已經(jīng)開始正式生產(chǎn)生物柴油 我國研究生物柴油始于上個世紀(jì)80年代，由上海內(nèi)燃機(jī)研究所和貴州山地農(nóng)機(jī)所聯(lián)合承擔(dān)課題，并對生物柴油的研究、開發(fā)做了大量基礎(chǔ)試驗探索。中國農(nóng)業(yè)工程研究設(shè)計院、遼寧省能源研究所、中國科技大學(xué)、河南科學(xué)陸軍化學(xué)所等單位也都對生物柴油作了不同程度的研

12、究。近幾年，北京化工大學(xué)、江蘇石油化工學(xué)院、中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院、華東理工大學(xué)、遼河化工廠、長春通達(dá)輕工技術(shù)研究所等科研院所也加入了生物柴油的研究行列。已研制成功利用菜籽油、大豆油、米糠油、工業(yè)豬油、牛油及野生植物小桐籽油等為原料的生物柴油生產(chǎn)工藝4。目前已有一些公司用化學(xué)法進(jìn)行生物柴油的開發(fā)生產(chǎn)，如：海南正和生物能源公司和四川古杉油脂化學(xué)有限公司都在致力于生物柴油的研究生產(chǎn)。1.1.3 生物柴油的制備方法 生物柴油的制備主要可采用5種方法，其中直接混合法和微乳液法屬于物理法，高溫?zé)崃呀夥ㄊ腔瘜W(xué)法，酯交換法又可分為化學(xué)酯交換和生物酶促酯交換。使用物理法能夠降低動植物油的粘度，但積炭及潤滑油污染等問題

13、難以解決；而高溫?zé)崃呀夥ǖ闹饕a(chǎn)品是生物汽油，生物柴油只是其副產(chǎn)品。相比之下，酯交換法5,6是一種更好的制備方法。1.1.3.1 直接混合法制備生物柴油 在生物柴油研究初期，研究人員設(shè)想將天然油脂與柴油、溶劑或醇類混合以降低粘度，提高揮發(fā)度7。1983年Amans等8將脫膠的大豆油與2號柴油分別以1:1和1:2的比例混合，在直接噴射渦輪發(fā)動機(jī)上進(jìn)行600h的試驗。當(dāng)兩種油品以1:1混合時，會出現(xiàn)潤滑油變渾以及凝膠化現(xiàn)象，而1:2的比例不會出現(xiàn)該現(xiàn)象，可以作為農(nóng)用機(jī)械的替代燃料。Ziejewski等人9將葵花籽油與柴油以1:3的體積比混合，測得該混合物在40下的粘度為4.88×10-6

14、m2/s，而ASTM(美國材料實(shí)驗標(biāo)推)規(guī)定的最高粘度應(yīng)低于4.00×10-6m2/s，因此該混合燃料不適合在直噴柴油發(fā)動機(jī)中長時間使用。而對紅花油與柴油的混合物進(jìn)行的試驗則得到了令人滿意的結(jié)果。但是在長期的使用過程中該混合物仍會導(dǎo)致潤滑油變渾。1.1.3.2 微乳液法制備生物柴油 將動植物油與溶劑混合制成微乳狀液也是解決動植物油高粘度的辦法之一。微乳狀液是一種透明的、熱力學(xué)穩(wěn)定的膠體分散系，是由兩種不互溶的液體與離子或非離子的兩性分子混合而形成的直徑在1150nm的膠質(zhì)平衡體系。1982年Georing等用乙醇水溶液與大豆油制成微乳狀液，這種微乳狀液除了十六烷值較低之外，其他性質(zhì)均

15、與2號柴油相似。Ziejewski等9以53.3%的冬化葵花籽油、13.3%的甲醇以及33.4%的1-丁醇制成乳狀液，在200h的實(shí)驗室耐久性測試中沒有嚴(yán)重的惡化現(xiàn)象，但仍出現(xiàn)了積炭和使?jié)櫥驼扯仍黾拥葐栴}。Neuma等10使用表面活性劑(主要成分為豆油皂質(zhì)、十二烷基磺酸鈉及脂肪酸乙醇胺)、助表面活性劑(成分為乙基、丙基和異戊基醇)、水、煉制柴油和大豆油為原料，開發(fā)了可替代柴油的新的微乳狀液體系，其中組成為柴油3.160g、大豆油0.790g、水0.050g、異戊醇0.338g、十二烷基碳酸鈉0.676g的微乳狀液體系的性質(zhì)與柴油最為接近。1.1.3.3 高溫?zé)崃呀夥ㄖ苽渖锊裼?最早對植物油

16、進(jìn)行熱裂解的目的是為了合成石油。Schwab等11對大豆油熱裂解的產(chǎn)物進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)烷烴和烯烴的含量很高，占總質(zhì)量的60%。還發(fā)現(xiàn)裂解產(chǎn)物的粘度比普通大豆油下降了3倍多，但是該粘度值還是遠(yuǎn)高于普通柴油的粘度值。在十六烷值和熱值等方面，大豆油裂解產(chǎn)物與普通柴油相近。 1993年，Pioch等12對植物油經(jīng)催化裂解生產(chǎn)生物柴油進(jìn)行了研究。將椰油和棕櫚油以SiO2/Al2O3為催化劑，在450裂解。裂解得到的產(chǎn)物分為氣液固三相，其中液相的成分為生物汽油和生物柴油。分析表明，該生物柴油與普通柴油的性質(zhì)非常相近。1.1.3.4 化學(xué)酯交換法制備生物柴油 各種天然的植物油和動物脂肪以及食品工業(yè)的廢油，都

17、可以作為酯交換生產(chǎn)生物柴油的原料。可用于酯交換的醇包括甲醇、乙醇、丙醇、丁醇和戊醇6。其中最為常用的是甲醇，這是由于甲醇的價格較低，同時其碳鏈短、極性強(qiáng)，能夠很快地與脂肪酸甘油酯發(fā)生反應(yīng)，且堿性催化劑易溶于甲醇。該反應(yīng)可用酸、堿或酶作為催化劑。其中堿性催化劑包括NaOH、KOH、各種碳酸鹽以及鈉和鉀的醇鹽，酸性催化劑常用的是硫酸、磷酸或鹽酸。甲醇越多產(chǎn)率越高，但也會給分離帶來困難。通過酯交換反應(yīng)可以使天然油脂(甘油三酸酯)的分子量降至原來的1/3，粘度降低8倍，同時也提高了燃料揮發(fā)度。生產(chǎn)出來的生物柴油的粘度與柴油接近，十六烷值達(dá)到5013。1.1.3.5 生物酶促酯交換制備生物柴油 新的研究

18、表明，脂肪酶是一種很好的催化醇與脂肪酸甘油酯的酯交換反應(yīng)的催化劑。酶作為一種生物催化劑，具有高的催化效率和經(jīng)濟(jì)性，日益受到關(guān)注。目前用化學(xué)方法生產(chǎn)生物柴油使用的催化劑存在難以分離以及耗能高等問題，都可以通過使用酶催化劑加以解決。例如以多孔高嶺石作為載體的固定酶催化劑14，與其他催化劑相比，不但壽命長，無需經(jīng)常更換，而且活性高，易于分離，是一種性能上和經(jīng)濟(jì)上都具有競爭力的新型催化劑。Ban等15以橄欖油和油酸為原料進(jìn)行酶催化反應(yīng)，產(chǎn)物中的甲酯含量達(dá)到90%。生物法存在以下局限性：一是生物催化劑價格昂貴；二是甲醇對生物催化劑有毒害作用；三是反應(yīng)體系粘度過高；四是甲醇轉(zhuǎn)化率不高。現(xiàn)有實(shí)驗證明，在反應(yīng)

19、過程中必須及時除去反應(yīng)生成的甘油,否則產(chǎn)生的甘油很容易堵塞顆粒狀固定化酶的孔徑,使固定化酶壽命大大降低。因此很有必要開發(fā)新型脂肪酶固定化方法及酯化工藝,以制備高品質(zhì)、低成本的生物柴油。1.1.4 生物柴油生產(chǎn)原料理論上一切動物、植物油脂都可以作為生產(chǎn)生物柴油的原料，但目前投入生產(chǎn)的大多是植物油脂，例如菜籽油、豆油、棉籽油、米糠油、棕櫚油、野生植物油、桉油、花生油或它們油腳料等。我國有豐富的植物油脂，是油菜生產(chǎn)大國，廣袤千里山區(qū)又大量種植油料植物，飯店產(chǎn)生的煎炸油也不少。有關(guān)資料顯示，我國每年消耗植物油1200萬t，直接產(chǎn)生下腳酸化油250萬t，大中城市餐飲業(yè)的發(fā)展也產(chǎn)生地溝油達(dá)500萬t。目前

20、，這些垃圾油一般都作為廢物處理，還有一些經(jīng)過地下作坊重新流入餐桌，直接造成污染。上述資源如果加以很好利用，必有很大的市場潛力。目前，海南正和生物能源有限公司開發(fā)出可以采用榨油廠的油腳、黃連木等油料樹木的果實(shí)以及城市餐飲廢油為原料的生產(chǎn)工藝，可以年生產(chǎn)生物柴油1萬t，產(chǎn)品已達(dá)到國外同類產(chǎn)品的技術(shù)水平。另據(jù)報道，目前福建已經(jīng)生產(chǎn)生物柴油5000多噸，其原料是食用油加工過程中的下腳料、地溝油、廢豬油等垃圾油，可使福州、廈門兩城市的地溝油問題得到有效解決4。1.2 生物催化與有機(jī)合成生物催化是蓬勃發(fā)展的生物技術(shù)中一個重要的具有廣泛前景的領(lǐng)域。它是用生物催化劑將有機(jī)化合物的生產(chǎn)過程與人們對天然高品質(zhì)的、

21、有利于環(huán)境保護(hù)的、可再生利用的產(chǎn)品不斷增強(qiáng)的需求結(jié)合起來，工業(yè)化生產(chǎn)與人類生存密切相關(guān)的物質(zhì)，尤其是食品、飲料、醫(yī)藥、化工和保健用品中的重要原料或組分16-18，甚至可以生產(chǎn)出自然界中不存在或化學(xué)方法無法合成的生物活性物質(zhì)19。與化學(xué)合成相比，生物催化具有如下優(yōu)勢：第一，在常溫、常壓下反應(yīng)，反應(yīng)條件溫和；第二，反應(yīng)速度快，反應(yīng)轉(zhuǎn)化率高；第三，催化反應(yīng)特異性強(qiáng)，副產(chǎn)物少；第四，更重要的是生物催化的產(chǎn)品品質(zhì)高，可以避免化學(xué)催化產(chǎn)生對人類及其生存環(huán)境有害的物質(zhì)。因此，生物催化被看成是化學(xué)工業(yè)發(fā)展的重要方向之一，許多發(fā)達(dá)國家將其列在發(fā)展的重要位置上20。生物催化劑包括生物細(xì)胞和生物大分子酶等。使用活的

22、微生物細(xì)胞做催化劑的生物催化過程就是發(fā)酵過程。它可以利用價格低廉和結(jié)構(gòu)簡單的原料，通過活細(xì)胞的代謝產(chǎn)生復(fù)雜的化合物。工業(yè)化發(fā)酵生產(chǎn)有機(jī)產(chǎn)品已有一百五十多年的歷史。發(fā)酵過程的本質(zhì)也是利用酶來進(jìn)行催化反應(yīng)。近年來，隨著一些重要有機(jī)產(chǎn)物的成功的工業(yè)化生產(chǎn)，使用從細(xì)胞中提取的酶直接催化單一或多底物來生產(chǎn)有機(jī)產(chǎn)品已顯示了酶催化反應(yīng)過程巨大的工業(yè)化應(yīng)用潛力。1.3 非水相酶學(xué)1.3.1 非水相酶學(xué)的興起酶能在疏水環(huán)境中表現(xiàn)出生物活性，這在生物體中早已被人們所知。在非生物體系的疏水有機(jī)溶劑中仍表現(xiàn)出生物活性，這無疑是對長期以來認(rèn)為生物功能大分子（酶、抗體、核酸等）只能在水溶液中才行使其生物功能以及有機(jī)溶劑是

23、它們的變性劑這一傳統(tǒng)觀點(diǎn)巨大的挑戰(zhàn)。1984年美國Massachusetts Institute Of Technology(MIT)的Klibanov21在Science上首次發(fā)表了非水介質(zhì)中脂肪酶的催化行為及熱穩(wěn)定性的研究，從此該領(lǐng)域得到迅速發(fā)展并取得了突破性的進(jìn)展。這對進(jìn)一步加深人們對各種生命活動現(xiàn)象的認(rèn)識提供了又一探索的領(lǐng)域。經(jīng)過近二十年的發(fā)展，酶學(xué)領(lǐng)域誕生了一個全新的學(xué)科方向非水相酶學(xué)22-24，為生物工程技術(shù)又增添了一個新的研究方向。非水相酶學(xué)在立體異構(gòu)體的拆分、聚合物的合成、多肽的合成、藥物合成及油脂的改性等方面已顯示出了巨大的應(yīng)用前景25-27。一方面，探索在非水介質(zhì)中酶的催化

24、行為，充分發(fā)揮酶生物催化劑特有的選擇性強(qiáng)、催化效率高、反應(yīng)條件溫和等優(yōu)點(diǎn)，有著巨大的應(yīng)用價值。另一方面，隨著研究的深入，也為許多其他生命領(lǐng)域的研究提供了新的研究方法和手段。例如：用非水體系來精確地控制蛋白質(zhì)分子表面的含水量，研究蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的相互關(guān)系；研究蛋白質(zhì)在有機(jī)溶劑中X晶體衍射，可以給出有機(jī)分子在蛋白質(zhì)表面的準(zhǔn)確結(jié)合位置，為蛋白質(zhì)類藥物設(shè)計提供詳細(xì)信息，減少盲目性。1.3.2 非水相酶催化的優(yōu)點(diǎn)研究證明，酶在幾乎無水的有機(jī)介質(zhì)中不僅可以不變性，而且還有較高的催化活性。與水相催化相比，酶在非水介質(zhì)中的催化作用有以下優(yōu)點(diǎn)28-31：（1）增加非極性底物的溶解度；（2）可進(jìn)行在水相中不能進(jìn)

25、行的反應(yīng)（如：酯合成、酯交換）。（3）增加底物濃度，提高反應(yīng)速度。（4）改變熱力學(xué)平衡，有利于產(chǎn)物的生成。（5）減少因水引起的副反應(yīng)（如：酸酐的水解，醌的聚合）。（6）增加酶的剛性，促進(jìn)穩(wěn)定性。（7）有利于酶與產(chǎn)物的分離及酶的再利用，簡化了生產(chǎn)工藝。正因為具有以上的顯著優(yōu)點(diǎn)，酶在非水介質(zhì)中的催化作用引起了人們廣泛的重視。目前已經(jīng)證明許多酶，特別是脂肪酶、蛋白酶、過氧化物酶、多酚氧化酶、醇脫氫酶等都能在有機(jī)介質(zhì)中發(fā)揮催化作用。1.3.3 無溶劑系統(tǒng)作為酶反應(yīng)介質(zhì)的有機(jī)溶劑是影響非水相酶催化的一個重要因素。溶劑體系可歸納為以下幾類32：（1）水/水溶性有機(jī)溶劑均相體系；（2）水/水不溶性有機(jī)溶劑雙

26、相體系；（3）微水相；（4）超臨界流體；（5）逆相膠團(tuán)；（6）無溶劑系統(tǒng)；（7）氣相；（8）離子液。無溶劑系統(tǒng)是一類無其他溶劑，只含底物和酶的反應(yīng)體系。同溶劑系統(tǒng)相比，此類反應(yīng)體系底物濃度高，反應(yīng)快；無需分離反應(yīng)介質(zhì)，簡化分離純化工藝；同時，無溶劑系統(tǒng)不需要使用其他有機(jī)溶劑，是一種環(huán)保型的酶催化技術(shù)33。例如，酶催化的糖基化反應(yīng)由于競爭性水解反應(yīng)的發(fā)生，其轉(zhuǎn)化率通常較低。但當(dāng)采用無溶劑系統(tǒng)時，可獲得高的轉(zhuǎn)化率34。非水相酶催化是酶工程史上一次飛躍性進(jìn)步，然而有機(jī)溶劑作為反應(yīng)介質(zhì)仍有許多缺點(diǎn)，如：價格不低，有毒性及易燃性，且溶劑殘留及廢棄物的處理在環(huán)保意識日益增強(qiáng)的今天亦是必須考慮的因素。由于無

27、溶劑系統(tǒng)不需加入任何溶劑，所以能夠避免溶劑系統(tǒng)所帶來的不良影響。對比溶劑系統(tǒng)，無溶劑系統(tǒng)具有以下優(yōu)點(diǎn)35：（1）不需加入有機(jī)溶劑，降低了生產(chǎn)的成本；（2）處于高底物濃度的條件下，反應(yīng)速度快；（3）產(chǎn)物的分離純化比較簡單，不存在有機(jī)溶劑的殘留問題；（4）無有機(jī)溶劑廢棄物排放，減少了環(huán)境污染。從降低生產(chǎn)成本和環(huán)境保護(hù)的角度出發(fā)，無溶劑系統(tǒng)具有比有機(jī)溶劑系統(tǒng)更廣闊的發(fā)展前景，人們對該領(lǐng)域的研究也會越來越深入。1.4 脂肪酶的研究與應(yīng)用1.4.1 脂肪酶的研究概況脂肪酶是分解油水界面上脂肪的酶36。根據(jù)Novo Nordisk公司的定義，脂肪酶與酯酶的區(qū)別在于：脂肪酶是可以水解一類特殊的酯鍵三酸甘油酯

28、的酶，而酯酶則是可以水解羧酯鍵的酶。雖然脂肪酶產(chǎn)品市場銷售份額只占全球酶制劑產(chǎn)品的百分之四，在工業(yè)生產(chǎn)中的作用還無法與淀粉酶和蛋白酶相比較。但近二十年來由于其用途的不斷擴(kuò)大，加上脂肪酶的結(jié)構(gòu)、催化機(jī)理及特性的復(fù)雜性都遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過了淀粉酶和蛋白酶，因此其研究的投入費(fèi)用也在不斷增大。尤其是自1988年，Novo Nordisk公司首次用基因工程菌生產(chǎn)洗滌劑用堿性脂肪酶獲得成功以來，脂肪酶酶源的開發(fā)進(jìn)入了一個新的時期。商業(yè)應(yīng)用的脂肪酶通常來自于微生物，除了在水溶液里表現(xiàn)出的水解功能外，大多數(shù)在有機(jī)溶劑里能表現(xiàn)出較強(qiáng)的催化活性，其主要反應(yīng)包括酯化反應(yīng)37-43、酯交換反應(yīng)、多肽合成44,45和其他的一些有

29、機(jī)合成46-48。目前，隨著基因工程手段在酶制劑開發(fā)和研究方面的廣泛應(yīng)用以及脂肪酶的品種和催化活力的提高，脂肪酶的應(yīng)用范圍也不斷擴(kuò)大，如：洗滌劑、化妝品、醫(yī)藥、農(nóng)化、造紙和功能性食品的生產(chǎn)和開發(fā)。預(yù)計在不久的將來，脂肪酶將同蛋白酶和淀粉酶一樣得到更為普遍的應(yīng)用。1.4.2 脂肪酶的催化機(jī)制脂肪酶的主要來源是微生物、哺乳動物和植物。不同來源脂肪酶可催化同一反應(yīng)。脂肪酶作用在體系的親水-疏水界面層，催化部位含有親核催化三聯(lián)體（Ser-His-Asp）或（Ser-His-Glu）49。其催化部位位于分子內(nèi)部，表面被相對疏水的氨基酸殘基形成的-螺旋蓋狀結(jié)構(gòu)覆蓋，對三聯(lián)體催化部位起保護(hù)作用50。通過界面

30、活化可提高催化部位附近的疏水性，導(dǎo)致-螺旋再定向，從而暴露出催化部位51；油水界面的存在，還可以使酶形成不完全的水化層，這有利于疏水性底物的脂肪族側(cè)鏈折疊到酶分子表面，使酶催化易于進(jìn)行。1.4.3 脂肪酶的底物特異性酶的底物特異性取決于酶分子的結(jié)構(gòu)，特別是酶活性中心的結(jié)構(gòu)。因此，不同來源的脂肪酶，其結(jié)構(gòu)的差異使酶的底物特異性也不同。脂肪酶的底物特異性包括：1.4.3.1 脂肪酸特異性 脂肪酸特異性是指脂肪酸對底物油脂中具有不同的鏈長、不同飽和度及不同雙鍵位置的脂肪酸表現(xiàn)出的特殊反應(yīng)性。不同來源的脂肪酶水解甘油三酯的脂肪酸特異性有很大差異，并可以通過蛋白質(zhì)工程對脂肪酶的脂肪酸特異性加以改造。Pl

31、eiss等52分析了6個脂肪酶的?；Y(jié)合位點(diǎn)。其結(jié)合位點(diǎn)以凹陷的口袋形式存在，其形狀可分為三種：（1）裂縫式，如Rhizomucor和Rhizopus脂肪酶；（2）漏斗式，如Candida Antarctica脂肪酶、哺乳動物胰脂肪酶和角質(zhì)脂肪酶；（3）地道式，如Candida rugosa脂肪酶。并發(fā)現(xiàn)通過突變那些連接位點(diǎn)可以改變酶的脂肪酸特異性。在Rhizopus delemar和Rhizop-us oryzae脂肪酶口袋底部的V205接近易斷裂脂肪酸鏈的C4處，用親水的Thr替換之，可使酶活降低，用Try替代與C6接近的F111，可以提高酶對短鏈甘三酯的相對專一性，L208和F94與C1

32、0C12接近，用較大的或更疏水的殘基來替換則增加了短鏈和中等長度鏈的相對專一性。F213位于疏水裂縫的末端，接近C16，用更大或更疏水的Tyr來替換之，則降低了酶對油酸和硬酯酸的相對專一性。1.4.3.2 位置特異性 位置特異性是指酶對底物甘三酯中1（或3）和2-位置酯鍵的識別和水解的反應(yīng)性。研究證明，不少微生物脂肪酶具有1，3-位置特異性，即它們只能選擇性地催化1，3-位置酯鍵水解，對2-位置酯鍵沒有作用。但在具有1，3-位置特異性酶催化的反應(yīng)中，一般存在速度較慢的非酶催化的酰基遷移，使2-位置?；S遷到1（或3）-位置。來源于豬胰、黑曲霉和根霉的脂肪酶，及牛奶脂蛋白脂肪酶（純酶）和人的脂蛋

33、白脂肪酶均具有1，3-位置特異性，對2-位置酯鍵沒有作用；圓弧青霉的脂肪酶和大鼠脂肪組織的脂蛋白脂肪酶能水解2-位置酯鍵，無1，3-位置特異性。1.4.3.3 立體特異性 立體特異性是指酶對底物甘油三酯中立體對映結(jié)構(gòu)的1，3-位置酯鍵的識別和選擇性水解，在有機(jī)相中酶促酯合成和酯交換時，酶對底物的不同立體結(jié)構(gòu)也表現(xiàn)出立體特異性。據(jù)文獻(xiàn)報道53，豬胰脂肪酶水解甘油三酯無1，3-位置的立體選擇性；人奶和牛奶中脂蛋白脂肪酶優(yōu)先水解1-位酯鍵。脂肪酶不僅在催化甘油三酯水解反應(yīng)中具有上述三種底物特異性，在催化酯合成與交換時，同樣具有底物特異性。在有機(jī)體系中，酶的底物特異性對催化反應(yīng)有重大的影響。1.4.4

34、 脂肪酶在油脂工業(yè)中的應(yīng)用脂肪酶具有來源廣泛和底物特異性多樣化的特點(diǎn)，使其在油脂加工和有機(jī)合成中有巨大的應(yīng)用潛力。近年來，脂肪酶產(chǎn)生菌的選育、微生物脂肪酶的分離純化及固定化技術(shù)的發(fā)展，為油脂工業(yè)全面引入脂肪酶生物技術(shù)提供了條件。根據(jù)反應(yīng)體系的不同，脂肪酶可以催化油脂的水解、酯交換、醇解等54。1.4.4.1 酶促油脂水解 由于水和油的不溶性，脂肪酶催化油脂的水解一般都是在雙相的水溶液中進(jìn)行55,56。脂肪酶可水解天然油脂，制備脂肪酸、甘油和甘單酯，且特別適用于具有生理活性而又不穩(wěn)定的脂肪酸和具有特定結(jié)構(gòu)的甘油單酯的生產(chǎn)。應(yīng)用酶法催化油脂水解可避免高溫高壓的化學(xué)法水解所引起的不飽和脂肪酸的氧化、

35、變性，且利用酶的位置特異性和脂肪酸特異性，可以選擇性地水解甘三酯中特定位置的酯鍵和特定脂肪酸。1.4.4.2 酶促酯交換 脂肪酶還可應(yīng)用于催化酯交換反應(yīng)，通過酯交換反應(yīng)，可以把廉價的油脂改良成具有高價值的工業(yè)和食用特殊油脂。例如：利用脂肪酶可催化菜籽油和甲醇進(jìn)行酯交換反應(yīng)，制取生物柴油；還可催化人造奶油與不飽和脂肪酸的酯交換反應(yīng)，使人造奶油熔點(diǎn)降低，改良了人造奶油質(zhì)量。通過酶促酯交換反應(yīng)，還可制備具有重要生理功能，而用化學(xué)方法不能合成的高度不飽和脂肪酸（PUFA）卵磷脂，或提高魚油中n-3PUFA的含量，制備功能性食品。1.4.4.3 油脂甘油醇解 脂肪酶可以催化油脂甘油醇解生產(chǎn)甘油單甘酯和雙

36、甘酯，且甘油三酯轉(zhuǎn)化率比化學(xué)方法的高，無氧化副產(chǎn)物，產(chǎn)物分離簡單。在石化能源日益枯竭的今天，應(yīng)用脂肪酶促油脂甘油醇解技術(shù)，把天然動植物油脂轉(zhuǎn)換為生物柴油成了目前的研究熱點(diǎn)57。1.4.4.4 生物精煉 生物精煉是借助微生物脂肪酶在一定條件下能催化脂肪酸與甘油之間的酯化反應(yīng)，從而把油中的大量游離脂肪酸轉(zhuǎn)變成中性甘油酯。這樣既降低了酸值，又增加了中性甘油酯的量。并且，從降低煉油損耗和提高油品質(zhì)量出發(fā)來考慮，把生物精煉與常規(guī)的堿煉、脫色、脫臭工藝相結(jié)合起來，是處理高酸值油的一種潛在技術(shù)。1.5 菜籽油的研究與應(yīng)用1.5.1 菜籽油的性質(zhì)及組成普通菜籽油是深黃色的，含有菜籽氣味和澀味。比重約在0.80

37、.9。精制的菜油則是金黃色的。菜籽油中，含有兩大類脂肪酸。一類是飽和脂肪酸，如棕櫚酸，硬脂酸等。另一類為不飽和脂肪酸如油酸、芥酸、亞油酸等。脂肪酸分子結(jié)構(gòu)的共同特點(diǎn)是含有有機(jī)官能團(tuán)羧基(-COOH)。菜籽油的主要成份如下表。表1-1 菜籽油主要成分種子來源江蘇遼寧陜西四川湖北云南棕櫚酸1.82.33.73.53.73.3硬脂酸0.41.41.0微量1.01.3油酸10.726.115.620.516.610.6花生油酸8.112.410.510.59.9芥酸45.932.539.447.045.245.4亞油酸16.615.015.511.414.218.6亞麻酸12.210.19.57.39

38、.420.71.5.2 菜籽油的工業(yè)用途在我國，菜籽油主要用于食用，其次也用于工業(yè)生產(chǎn)。最近四十多年，石油化工發(fā)展迅速，大量的石油產(chǎn)品代替了天然油脂。但在能源危機(jī)的今天，希望從再生資源天然油脂中，提供更多的長碳鏈的中間體，具有重大政治和經(jīng)濟(jì)意義。第二次世界大戰(zhàn)以前，我國的大豆產(chǎn)量占世界首位，后被美國和巴西趕上，但最近幾年我國油料增產(chǎn)很快，菜籽的產(chǎn)量增加尤為突出，作為一種再生資源，是我國必不可少的主要食物，又是不可缺少的工業(yè)原料。動植物油脂用做機(jī)械潤滑油有特殊的優(yōu)點(diǎn)，這是因為動植物油的油膜在金屬表面上的粘附能力比無極性礦物油強(qiáng)得多。這對保護(hù)金屬表面尤為有利，在精密儀器、機(jī)械和鐘表中，一般用動植物

39、油做潤滑油。氧化菜籽油或聚合的菜籽油常用來加到石油中作潤滑油用。另外也可用作連續(xù)鑄鋼潤滑油、金屬熱處理濾火劑。菜籽油皂化可以制得各種表面活性劑，也可用于制造肥皂。在制皂的同時，還可得到副產(chǎn)物甘油。菜油磺化可制備皮革柔亮劑。還可作紡織工業(yè)中的柔軟劑以及作化妝品及發(fā)泡劑的原料，用菜油制取硫酸化油，硫酸化的油脂可作切削油的乳化劑、殺蟲劑油性噴劑、工業(yè)松油清潔劑和消毒劑。對油脂進(jìn)行熱裂反應(yīng)，可制造發(fā)動機(jī)燃料，在實(shí)驗室中已有成功的事例，但由于成本較高，難以大量應(yīng)用，但這是一項有意義的開發(fā)工作。在石油的開采越來越少的今天，用油脂制造發(fā)動機(jī)燃料以替代石油，應(yīng)受到重視。總之，菜油在機(jī)械工業(yè)、橡膠、化工、油漆、

40、紡織等領(lǐng)域，都有廣泛的應(yīng)用，另外菜籽的根莖、葉及油餅都是很好的有機(jī)肥料58。1.5.3 菜籽油甲酯化我國傳統(tǒng)品種菜籽油中的二十二碳-烯酸（C22:1，芥酸）含量高達(dá)4250%59，它是很好的加油材料。菜籽油甲酯化后的產(chǎn)物是脂肪酸甲酯、甘油二酸酯（DG）和甘油-酸酯（MG）。進(jìn)一步處理這些產(chǎn)物可制得性能優(yōu)良的加脂劑59,60。B.Freedman等人系統(tǒng)地研究了植物油的甲酯化反應(yīng)61,62，供實(shí)驗用的植物油有：棉籽油、花生油、大豆油和向日葵油。四種植物油和甲醇反應(yīng)的適宜條件是：油脂/甲醇(摩爾比)1/41/6，用0.5%NaOCH3催化、反應(yīng)溫度60，l小時后甲酯的轉(zhuǎn)化率為9398%B.Free

41、dman等人還研究了大豆油甲酯化反應(yīng)動力學(xué)63。當(dāng)大豆油/甲醇(摩爾比)為1/6，0.5%NaOCH3作催化劑，實(shí)驗了五個溫度點(diǎn)：20、30、40、50和60。根據(jù)分析結(jié)果，提出了反應(yīng)的動力學(xué)模型可用連續(xù)反應(yīng)來描述，它包括四級對峙反應(yīng)和二級對峙反應(yīng)（只計算了反應(yīng)的表觀活化能，沒有給出速度常數(shù)），他們研究使用的分析檢測手段是薄層色譜（TLC）和毛細(xì)管色譜（CGC），兩者均用氫火焰離子化檢測器（FID）。1.6 脂肪酶促酯交換反應(yīng)1.6.1 脂肪酶促酯交換反應(yīng)的催化機(jī)制非水相中脂肪酶催化酯交換反應(yīng)的動力學(xué)比較復(fù)雜。在酯交換反應(yīng)的過程中，存在著?；?酶復(fù)合物，并把整個反應(yīng)分為兩個步驟。（1）?；?酶

42、復(fù)合物的形成；（2）?；?酶復(fù)合物的溶劑解，包括水解和醇解等方式。脂肪酸和脂肪酸酯均可形成?；?酶復(fù)合物，甘三酯-酶復(fù)合物水解生成游離脂肪酸和雙甘酯，水和水解生成的雙甘酯同時又是酰基-酶復(fù)合物溶劑解的競爭性?；荏w。體系中水含量的多少是酯交換反應(yīng)的重要影響因素，它不僅影響有機(jī)相中酶的活性，同時又參與酯交換反應(yīng)。水含量過高，則以水解反應(yīng)為主反應(yīng)；水含量低，則甘油三酯水解程度小，作為酯合成反應(yīng)的雙甘酯濃度低，兩種情況都將不能進(jìn)行有效的酯合成（即?；?酶復(fù)合物的醇解）反應(yīng)。因此，在酶促酯交換反應(yīng)中，水含量是一個非常關(guān)鍵的控制參數(shù)64。1.6.2 菜籽油酶促酯交換生產(chǎn)生物柴油將一種酯與另一種脂肪酸或酯

43、混合并伴隨?；粨Q生成新酯的反應(yīng)叫酯交換反應(yīng)。菜籽油中進(jìn)行酯交換反應(yīng)的成分主要是甘油三酯，選用對甘油三酯有特異性催化作用的脂肪酶來進(jìn)行酯交換反應(yīng)，即可制得生物柴油。由于是與甲醇進(jìn)行反應(yīng)，甲醇的沸點(diǎn)是44，如果溫度過高會加快甲醇的揮發(fā)。因此反應(yīng)溫度應(yīng)控制在30。鄧?yán)?5進(jìn)行了有機(jī)溶劑體系中脂肪酶酯交換制取生物柴油的研究，他們用石油醚做溶劑，并研究了甲醇的用量和甲醇的加入方式對脂肪酶催化過程的影響。要實(shí)現(xiàn)大規(guī)模的工業(yè)應(yīng)用，關(guān)鍵在于解決酶的成本問題，因為酶的價格較高，這就要求所使用的酶催化活性高、穩(wěn)定性好、使用壽命長。1.6.3 反應(yīng)體系含水量的影響（1）水的作用 酶在絕對無水的條件下是不可能有催

44、化活性的，水分子直接或間接地通過氫鍵、疏水鍵、靜電作用、范得華力等來維持酶分子的催化活性結(jié)構(gòu)66。在絕對無水條件下，酶分子的帶電基團(tuán)和極性基團(tuán)之間相互作用而形成“鎖定”的失活構(gòu)象。加入適量水可削弱這種相互作用，使酶分子的柔性增大，并通過非共價作用力來維持酶的催化活性構(gòu)象67。氫鍵、疏水鍵、靜電作用、范得華力等分子內(nèi)和分子間相互作用力的組合，構(gòu)成了復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)，在酶分子表面形成一個水化層。酶催化反應(yīng)就是在環(huán)繞著酶分子表面的水層內(nèi)或界面上進(jìn)行的。當(dāng)酶周圍含有足夠的水分子來維持其天然構(gòu)象時，這些“必需水”以外的介質(zhì)對反應(yīng)影響較小。也就是說，只要酶吸附足夠的“必需水”，在有機(jī)相中也應(yīng)顯示其催化活力68。

45、所謂的無水體系并不是絕對無水的，而是一種含有微量水的有機(jī)溶劑體系（水含量<1%）。在這種體系中，宏觀上是有機(jī)溶劑，微觀上是水體系。酶催化反應(yīng)時，底物分子須先從有機(jī)相進(jìn)入水相或油水界面，然后才能與酶形成底物-酶復(fù)合物，繼而發(fā)生反應(yīng)67。（2）酶促酯交換反應(yīng)中水的影響 水含量對酶促酯交換反應(yīng)熱力學(xué)有很大影響31，通過改變反應(yīng)介質(zhì)中水的含量可改變反應(yīng)的平衡點(diǎn)。例如，隨著水含量的降低，脂肪酶催化反應(yīng)難度有如下順序69：水解>醇解>酯交換>酯化。所以對于酯交換反應(yīng)，水含量的多少影響到其副反應(yīng)（即酯的水解）的進(jìn)行。水含量偏高，有利于副反應(yīng)，生成脂肪酸和醇，使酯交換反應(yīng)的得率偏低。水

46、含量偏低，有利于酯交換和酯化反應(yīng)。因此在反應(yīng)介質(zhì)中可通過控制水的含量，使所期望的反應(yīng)占主導(dǎo)地位。從酶的穩(wěn)定性來說，在一般的酶催化反應(yīng)中，水發(fā)揮著雙重作用。一方面作為潤滑劑賦予蛋白質(zhì)柔韌性，維持酶活力構(gòu)象；另一方面，水參與酶的熱失活過程，是導(dǎo)致酶熱失活的重要因素。有水存在時，隨著溫度的升高，酶分子會發(fā)生以下變化：1.形成不規(guī)則結(jié)構(gòu)；2.二硫鍵受到破壞；3.天冬酰胺和谷胺酰胺脫酰胺基。在有機(jī)溶劑體系中因為存在的水量很少，酶表現(xiàn)出極高的熱穩(wěn)定性。因而，在有機(jī)相酶催化反應(yīng)中控制適宜的水含量，可提高酶的穩(wěn)定性和催化效率，使反應(yīng)具有一般水溶液體系所不具備的優(yōu)越性。第二章 材料與方法2.1 實(shí)驗材料2.1.

47、1 脂肪酶Novozym 435，廣州明遠(yuǎn)工貿(mào)有限公司2.1.2 主要試劑及原料菜籽油：鯉魚牌100%純菜油，四川嘉里糧油工業(yè)有限公司高碘酸鈉：60g/L酸性溶液，分析純，浙江溫州助劑廠乙二醇：1體積乙二醇用1體積水稀釋，分析純，重慶東方試劑廠甲酸鈉：約1mol/L溶液，分析純，NaOH：約0.02mol/L標(biāo)準(zhǔn)溶液，分析純，成都科龍化工試劑廠鹽酸：化學(xué)純，四川省德陽市化學(xué)試劑廠甲醇：分析純，重慶東方試劑廠石油醚：分析純，中國醫(yī)藥（集團(tuán)）上海化學(xué)試劑公司甘油：分析純，北京化工廠硫酸：分析純，四川省德陽市化學(xué)試劑廠磷酸：分析純，成都化學(xué)試劑廠碘化鉀：15%，分析純，鄭州化學(xué)試劑二廠鄰苯二甲酸氫鉀

48、：分析純，成都化學(xué)試劑廠硫代硫酸鈉：約0.5mol/L，分析純，成都化學(xué)試劑廠淀粉指示劑：將5g可溶性淀粉（分析純），用冷去離子水先制成均勻的糊狀，加入500mL煮沸的去離子水，迅速攪拌，然后冷卻。pH=4.00及pH=9.18的緩沖溶液2.2 儀器設(shè)備振蕩培養(yǎng)箱：深圳市沙頭角國華儀器廠振蕩器：HZQ-R型，哈爾濱東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司pH計：pHS-3C型酸度計，成都方舟科技開發(fā)公司。光學(xué)讀數(shù)分析天平：型號TG328A，湘儀天平儀器廠上皿電子天平：型號FA1104，上海精科天平電熱鼓風(fēng)干燥箱：型號101-1，上海三星電熱儀器廠2.3 實(shí)驗方法2.3.1 試劑的配制高碘酸鈉酸性溶液：（1）在

49、含有60mL0.1N硫酸的去離子水中，溶解高碘酸鈉30g，并稀釋至總的容積為500mL。在溶解高碘酸鈉時不可加熱，將溶液存放在磨口塞棕色玻璃瓶內(nèi)，并保存在暗處。（2）質(zhì)量的鑒定，吸取高碘酸鈉溶液10mL，放在250mL的容量瓶中，稀釋至刻度，并充分混合。在50mL去離子水中含有0.50.6g甘油的溶液內(nèi)，用吸管加入稀釋后的高碘酸鈉溶液50mL，另外，只用50mL的去離子水做空白實(shí)驗，靜置30min，加鹽酸5mL及15%的碘化鉀溶液10mL，搖動混合后靜置5min，再加去離子水100mL，在不斷搖動下，用0.5mol/L硫代硫酸鈉溶液滴定至黃色接近完全消失時加12mL淀粉液指示劑，繼續(xù)加硫代硫酸

50、鈉溶液進(jìn)行緩緩滴定，直至藍(lán)色恰好消失為止，當(dāng)甘油溶液的滴定數(shù)用空白實(shí)驗的滴定數(shù)來除后，其答數(shù)在0.7500.765之間時，說明高碘酸鈉溶液的質(zhì)量是令人滿意的70。本次實(shí)驗鑒定的答數(shù)為0.758。NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液的標(biāo)定：稱取0.6g于105110烘至恒重的基準(zhǔn)鄰苯二甲酸氫鉀，稱準(zhǔn)至0.0001g，溶于50mL去離子水中，加2滴酚酞指示液，用配制好的氫氧化鈉溶液滴定至溶液呈粉紅色，同時做空白實(shí)驗。則氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度按下式計算：(NaOH)=式中：m鄰苯二甲酸氫鉀之質(zhì)量，g；V1氫氧化鈉溶液之用量，mL；V2空白實(shí)驗氫氧化鈉溶液之用量，mL；0.2042與1.00mL氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液c(NaOH

51、)=1.000mol/L相當(dāng)?shù)囊钥吮硎镜泥彵蕉姿釟溻浀馁|(zhì)量71。2.3.2 酸度計的校準(zhǔn)（1）“斜率”調(diào)節(jié)器順時針旋到底，調(diào)節(jié)“溫度”調(diào)節(jié)器使所指的溫度與溶液溫度相同，并搖動試杯使溶液均勻。（2）把電極插入已知pH=6.86的緩沖溶液，調(diào)節(jié)“定位”調(diào)節(jié)器，使一起的指示值為該緩沖溶液所在溫度相應(yīng)的pH值（pH=6.86）。（3）用去離子水清洗電極，并用濾紙吸干，把電極插入另一已知pH緩沖溶液（pH=9.18）并搖動試杯使溶液均勻。（4）調(diào)節(jié)“斜率”調(diào)節(jié)器，使儀器的指示值為溶液所在溫度相應(yīng)的pH值（pH=9.18）。重復(fù)（2）（4）步驟，直至達(dá)到要求為止。儀器兩點(diǎn)標(biāo)定已告完成，經(jīng)標(biāo)定的儀器的定位

52、電位器與斜率調(diào)節(jié)器不應(yīng)再有變動。2.3.3 游離甘油含量測定參考GB/T 13216.691甘油試驗方法 甘油含量的測定。在強(qiáng)酸介質(zhì)中，甘油被高碘酸鈉冷氧化，反應(yīng)產(chǎn)生的甲酸以pH計指示，用氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定。反應(yīng)式為：CH2OHCHOHCH2OH+2NaIO4HCOOH+2HCHO+2NaIO3+H2O具體步驟是，用30mL石油醚溶解油樣（所含甘油重應(yīng)低于0.05g），再用25mL水萃取，重復(fù)4次，收集所有水相，煮沸以除去水相中殘留的有機(jī)溶劑。冷卻后在pH計的指示下，用氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值為7.9。準(zhǔn)確加入5mL高碘酸鈉溶液，緩和攪勻，蓋上蓋子，在溫度不超過35暗處放置30min，然后加5

53、mL乙二醇混合，在同樣條件下放置20min。準(zhǔn)確加5mL甲酸鈉溶液，用pH計指示，以NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定存在的酸度至7.9。取30mL石油醚溶液，用水萃取4次，每次25mL，來做空白實(shí)驗。但加入高碘酸鈉溶液之前，空白溶液應(yīng)調(diào)節(jié)至pH為6.5，加入高碘酸鈉溶液之后，滴定終點(diǎn)至pH為6.5。甘油含量，用質(zhì)量百分?jǐn)?shù)表示，按下式計算：式中：V1測定樣品所耗用NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液體積，mL；V2空白實(shí)驗所耗用NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液體積，mL；m檢測樣品質(zhì)量，g；C所用NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度，mol/L；0.0921甘油毫摩爾質(zhì)量，g/mmol2.3.4 總甘油含量測定將以甘油酯形式存在的甘油通過醇解、酸化等化學(xué)方法轉(zhuǎn)變?yōu)橛坞x甘油，然后用測游離甘油方法進(jìn)行測定。甘油酯的醇解是很容易的，通常是以油脂與過量的醇在堿或酸催化劑的存在下進(jìn)行。用堿作催化劑時可以使反應(yīng)更容易在較低的溫度下進(jìn)行，并可獲得較高的收獲率。在轉(zhuǎn)化過程中，由于樣品油中含有游離脂肪酸，與堿生成肥皂，使反應(yīng)混合物呈膠