代謝組學分析在重癥醫(yī)學領(lǐng)域的研究與應(yīng)用進展

1、代謝組學分析在重癥醫(yī)學領(lǐng)域的研究與應(yīng)用進展代謝組學分析在重癥醫(yī)學領(lǐng)域的研究與應(yīng)用進展 本文關(guān)鍵詞：代謝，重癥，進展，領(lǐng)域，醫(yī)學 代謝組學分析在重癥醫(yī)學領(lǐng)域的研究與應(yīng)用進展 本文簡介：摘要：重癥醫(yī)學領(lǐng)域的疾病常常以“綜合征”為代表，即使是同樣的一個結(jié)局他們的病因也不盡相同，現(xiàn)行評估這些綜合征的指標并不能完全反映機體所受到的壓力。代謝組學是最新的“組學”技術(shù)，涉及生物體或特定生物樣品小分子代謝物的全面分析。代謝組學提供了對細胞狀態(tài)的洞 代謝組學分析在重癥醫(yī)學領(lǐng)域的研究與應(yīng)用進展 本文內(nèi)容： 摘要：重癥醫(yī)學領(lǐng)域的疾病常常以“綜合征”為代表， 即使是同樣的一個結(jié)局他們的病因也不盡相同， 現(xiàn)行評估這些綜

2、合征的指標并不能完全反映機體所受到的壓力。代謝組學是最新的“組學”技術(shù)， 涉及生物體或特定生物樣品小分子代謝物的全面分析。代謝組學提供了對細胞狀態(tài)的洞察， 并描述了生物體的實際健康狀況。氣相色譜-質(zhì)譜法 （gas chromatography-mass spectrometry, GC-MS） 和液相色譜-質(zhì)譜法 （liquid chromatography-mass spectrography, LC-MS） 等可用于各種生物流體的研究技術(shù)， 用于重癥監(jiān)護室 （intensive care unit, ICU） 患者的代謝組學分析。這些技術(shù)已成功用于ICU和其他臨床環(huán)境的診斷和預后， 例如，

3、 膿毒癥和急性呼吸窘迫綜合征 （acute respiratory distress syndrome, ARDS） 、急性腎損傷 （acute kidney injury, AKI） 等。本文就代謝組學分析在重癥醫(yī)學領(lǐng)域的研究進展做一綜述。 關(guān)鍵詞：代謝組學； 重癥醫(yī)學； 應(yīng)用； 近年來， 重癥醫(yī)學在整體生命支持方面取得了很大進展， 但預測性生物標志物的缺失已經(jīng)成為該領(lǐng)域相關(guān)疾病診斷、治療以及開發(fā)降低發(fā)病率和 （或） 死亡率有效藥物的瓶頸之一， 這也許最終會成為危重癥救治“桶形效應(yīng)”的關(guān)鍵點。重癥監(jiān)護室 （intensive care unit, ICU） 患者常常處于各種“綜合征”包圍之中

4、。在宏觀上， “危重”是這些綜合征最重要的“特征”.但由于病因不同， 綜合征僅僅是多種病因的后續(xù)體現(xiàn)， 即使對同一綜合征的評估都難以達成共識。因此， 加強對疾病機制的理解， 探討“綜合征”與微觀環(huán)境變化之間是否存在特別的關(guān)系， 可能會給探尋臨床上的檢測、評估和治療新靶點提供機會?！敖M學” （包括基因組學、蛋白質(zhì)組學和代謝組學等） 可以幫助我們從微觀層面了解疾病， 使用組學研究重癥醫(yī)學領(lǐng)域中的疾病和 （或） 綜合征的性質(zhì)將是一個很有前途的方法。由于基因組學、轉(zhuǎn)錄組學和蛋白質(zhì)組學不能完全解釋生物體對生理和病理生理刺激的復雜反應(yīng)， 我們的研究目光聚焦于基因組級聯(lián)反應(yīng)中比DNA、RNA和蛋白生物標志物

5、更晚的細胞代謝化學分解產(chǎn)物， 因而近年來對代謝組學的關(guān)注日益增加。本文僅就代謝組學分析在重癥醫(yī)學領(lǐng)域中的研究與應(yīng)用進展做一綜述。 1 代謝組學發(fā)展與基本研究方法 代謝組學是指活體系統(tǒng)對病理生理刺激或遺傳修飾的動態(tài)多參數(shù)代謝反應(yīng)的定量測量1, 可以追溯到古希臘， 當時尿液的顏色、味道或氣味就已經(jīng)被用來診斷糖尿病2.20世紀70年代Horning和Pauling等2-3開創(chuàng)了代謝組學系統(tǒng)研究的新時代， 其重點是分析生物體液中全面的特異性代謝物組。目前， 現(xiàn)代代謝組學就是在給定時間點對生物樣品中的小分子代謝物 （ 代謝組學中最常用的分析技術(shù)包括：核磁共振 （nuclear magnetic reso

6、nance, NMR） 波譜法 （主要是1H-NMR） 和質(zhì)譜法 （mass spectrometry, MS） 5-6, 均可完成對樣品中的大量小分子的分析， 以實現(xiàn)對代謝物的鑒定和定量分析；同時， 兩者各有其優(yōu)勢與局限性 （表1） 6-7.NMR波譜檢測的“無損性”對于完整細胞或組織 （活組織樣本） 分析具有特別價值。而MS通常需要從待分析的生物流體中分離出代謝物， 因此常需與高分辨率技術(shù)相結(jié)合， 如：液相色譜 （liquid chromatograph, LC） 、氣相色譜 （gas chromatography, GC） 、毛細管電泳 （capillary electrophoresi

7、s, CE） 和超高效液相色譜 （ultra High performance liquid chromatography, UHPLC） 等。雖然MS是一種破壞性技術(shù)， 但分析所需樣本量很少 （以微升為計量單位） ;同時， 色譜-MS聯(lián)儀法又具有高靈敏度和可重復性的優(yōu)點， 被經(jīng)常用于代謝組學研究。上述MS方法特點各異， 有的需要對非揮發(fā)性物質(zhì)進行衍生化 （如GC-MS） , 有的能覆蓋從親水性到疏水性的各種代謝物的分析 （如LC-MS） , 有的具有優(yōu)異的分離能力但重復性較低 （如CE） 6-9.因此， 選擇與研究目的和樣本匹配的MS技術(shù)將是研究成功的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一?？梢?， NMR和MS兩種分

8、析方法具有互補性10, 對一個有機體的代謝組學綜合表征分析需要運用多種分析技術(shù)和 （或） 儀器相互結(jié)合來開展。    在當今代謝組學分析條件下， 代謝指紋分析、代謝物譜分析和靶向代謝組學是可以運用的3種不同的研究方法。代謝指紋分析是對生物樣本中可重現(xiàn)代謝物指紋圖譜的全面、快速評估。它不需要特殊的樣品制備和最終的色譜分離技術(shù)， 主要用于樣品分類。識別的目的是根據(jù)表征特定組織或生物液體中代謝狀態(tài)的獨特模式來區(qū)分來自不同生物狀態(tài) （如疾病或健康） 的樣本11-13.代謝物譜分析是一種非靶向的代謝分析法， 旨在盡可能多地識別并量化化合物。其重點在于對各種代謝物 （如氨基酸、糖、脂質(zhì)

9、和膽汁酸等） 以及未知潛在化合物的分析。它涉及代謝物的高通量測量， 需要高分辨率色譜分離和質(zhì)譜檢測， 能夠檢測到代謝物組的具體變化， 并了解具體代謝途徑， 常用于新的科學假說探索與代謝生物標志物鑒定11-12,14.而靶向代謝組學是基于已知的代謝途徑和 （或） 生物標志物， 選擇監(jiān)測與生物體特定反應(yīng)有關(guān)的目標化合物11-12,14, 并在樣本中予以明確和精確定量。 在實際運用中， 研究標本可以是細胞、液體或組織， 其中尿液和血液是代謝組學研究中使用的典型標本5, 而樣本的收集、儲存和準備則是研究成功的關(guān)鍵步驟15.對數(shù)據(jù)進行預處理使之特征更具可比性16、使用多變量統(tǒng)計分析17、內(nèi)部交叉驗證檢驗

10、18以及主成分分析 （principal component analysis, PCA） 、層次聚類分析 （hierarchical cluster analysi, HCA） 、偏最小二乘判別分析 （partial least squares discrimination analysi, PLS-DA） 等多種模式識別策略的應(yīng)用7均是保障鑒定生物標志物的可靠性重要環(huán)節(jié)。 2 代謝組學在重癥醫(yī)學中的應(yīng)用 重癥醫(yī)學是研究危及生命的疾病狀態(tài)發(fā)生發(fā)展規(guī)律及其診治方法的臨床醫(yī)學學科19.代謝組學允許用一個樣品鑒定數(shù)十至數(shù)百種代謝物， 可以實現(xiàn)與特定病理生理學相關(guān)的代謝指紋的鑒定20, 從而確定生物

11、標志物及解釋病生過程。在重癥醫(yī)學及相關(guān)領(lǐng)域中， 已逐漸將代謝組學應(yīng)用于生物標志物鑒定、疾病預防和藥物開發(fā)與量化治療等方面20. 2.1 膿毒癥 膿毒癥是全球致死的重要疾病之一21, 具有高發(fā)病率 （18.6/1000住院人次） 、高死亡率 （50%） 的特點22.其患者往往需要在ICU進行治療， 醫(yī)療成本占比較大23.雖然引起膿毒癥的病原體并沒有顯著變化， 但隨著多項臨床和基礎(chǔ)研究結(jié)果的展現(xiàn)， 對膿毒癥的定義有了新的理解24.修訂后的國際共識 （膿毒癥-3.0） 建議將SOFA評分為2或更高作為膿毒癥的標準， 雖然它更容易從臨床數(shù)據(jù)中獲得， 但精確度相對較低25-26.理想化的狀態(tài)， 即準確和

12、早期識別， 一定是影響膿毒癥臨床決策并指導更精確治療干預的關(guān)鍵結(jié)點。膿毒癥患者不論病原體如何， 其代謝產(chǎn)物譜都是一致的27-28, 不同的代謝物特征決定了膿毒癥所造成的特定終末器官損害28-29.目前研究表明， 在人體和動物中， 代謝產(chǎn)物譜能夠區(qū)分膿毒癥和無菌性炎癥， 以及評估入住ICU的患者繼發(fā)膿毒癥的可能性27-28,30-31.1H-NMR尿代謝組學檢測也已被認為有助于膿毒癥的早期診斷32.同時， 膿毒癥代謝產(chǎn)物主要是氨基酸及其衍生物， 顯示出一致的方向性變化， 這是能量代謝在其病理生理中作用的體現(xiàn)31,33.葡萄糖、乳酸鹽、醋酸鹽和檸檬酸鹽可用于區(qū)分膿毒癥和全身炎癥反應(yīng)綜合征 （sys

13、temic inflammatory response syndrome, SIRS） 28,31,33.進一步分析發(fā)現(xiàn)， 膿毒癥存活與死亡者游離脂肪酸代謝改變明顯， 存活者線粒體脂肪酸-氧化嚴重缺陷， 其犬尿氨酸可作為區(qū)分SIRS和敗血癥的參考指標27,34.此外， 代謝組學還可以被用來作為闡明生化途徑、監(jiān)測不良事件、預測和追蹤治療反應(yīng) （藥物代謝組學） 的一種工具35-36, 以促進膿毒癥的藥物精確治療。在促紅細胞生成素減少膿毒癥的器官功能損傷37和左旋肉堿治療成人膿毒性休克I期臨床試驗38中均有陽性發(fā)現(xiàn)。還有一些代謝組學研究已嘗試將線粒體脂肪酸-氧化作為膿毒癥靶向治療的關(guān)鍵途徑進行探索性

14、研究33,39-40.可見， 代謝組學具有很大的潛力來幫助確定特定的膿毒癥表型， 并期望找到非常需要的預測性和預后性生物標志物， 從而引導更個性化的管理和治療41. 2.2 急性呼吸窘迫綜合征 急性呼吸窘迫綜合征 （acute respiratory distress syndrome, ARDS） 是ICU常見急危重癥， 死亡率高達10.4%42-43.自1967年首次描述ARDS描述44以來， 已經(jīng)有一些研究期望能解決該綜合征的潛在異質(zhì)性和復雜病因?qū)W問題。ARDS代謝組學分析涉及各種潛在與之相關(guān)的生物流體如呼出氣、支氣管肺泡灌洗液 （bronchoalceolar lavage fluid

15、, BALF） 和血漿等.早期研究即發(fā)現(xiàn)外科ICU的ARDS患者呼出氣中異戊二烯水平偏低45.Evans等46針對ARDS患者的非靶向代謝組學分析發(fā)現(xiàn)其BALF中存在明顯代謝組學差異， 呈現(xiàn)多種氨基酸和糖酵解產(chǎn)物水平增高以及脂質(zhì)中間體水平降低。Stringer等47從13名膿毒癥誘導的ARDS患者血漿中鑒定出40種代謝物 （其中4種存在顯著性差異） .近期Viswan等48使用NMR對BALF進行代謝組學研究， 經(jīng)PLS-DA分析發(fā)現(xiàn)脯氨酸、賴氨酸、精氨酸、?；撬?、蘇氨酸和谷氨酸6種代謝產(chǎn)物可作為判別輕、中、重度 （依據(jù)2012年柏林定義49） ARDS的參考生物標志物并解釋了相關(guān)代謝路徑?？?/p>

16、見， 代謝組學分析在ARDS早期診斷、嚴重程度評估上具有一定前景。 2.3 急性胰腺炎 近年急性胰腺炎 （acute pancreatitis, AP） 發(fā)病呈上升趨勢， 其中20%可致多器官功能衰竭甚至死亡50-52.目前臨床診斷AP的方法包括實驗室檢查與放射成像 （如超聲、MRI和CT等53-54） , 然而這些檢查的假陽性、假陰性、非特異性以及滯后性均會限制對AP的早期診斷。Ma等55用高分辨質(zhì)子魔角旋轉(zhuǎn)NMR示蹤法發(fā)現(xiàn)大鼠模型在胰腺組織損傷前即存在亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、脂質(zhì)和?；撬岬却x物水平改變。Villasenor等56利用1H-NMR波譜和多變量模型發(fā)現(xiàn)AP患者尿液中鳥嘌呤、

17、馬尿酸、肌酸和血漿中纈氨酸、丙氨酸、脂蛋白所組合的生物標志物對AP具有很強的診斷和預后潛力。Tang等57利用GC-MS, 采用PLS-DA模型確定高脂血癥性急性胰腺炎 （HLP） 存在一些特異代謝物。近期， Xiao等58采用GC-MS發(fā)現(xiàn)包括3-羥基丁酸、磷酸、甘油、檸檬酸、D-半乳糖、D-甘露糖、D-葡萄糖、十六烷酸和5-羥色胺在內(nèi)的一些重要代謝物可作為輔助AP臨床診斷的潛在生物標志物。在治療方面， Lia等用600 MHz超導NMR光譜儀檢測證實中草藥大承氣湯治療后的AP大鼠模型血漿甘油、谷氨酸、低密度脂蛋白、飽和脂肪酸水平降低， 而丙氨酸和谷氨酰胺水平升高， 為基于1H-NMR的代謝

18、組學方法系統(tǒng)研究AP治療提供了方法學依據(jù)59.可見， 代謝物水平的檢測將有助于AP的早期診斷與預后判斷， 代謝譜與化學計量模型耦合可能是展開代謝系統(tǒng)研究的有效工具57. 2.4 急性腎損傷 急性腎損傷 （acute kidney injury, AKI） 是指由多種病因和 （或） 危險因素引起的腎功能快速下降的一種復雜臨床綜合， 住院死亡率可高達75%.膿毒癥和缺血再灌注損傷是ICU患者發(fā)生AKI的主要原因60-62, 盡管有連續(xù)腎臟替代療法 （continuous renal replacement therapy, CRRT） 等治療手段， 但AKI的預后仍較差63.血清肌酐水平和尿量仍然

19、是目前臨床診斷AKI的主要指標64, 但敏感性、特異性和可靠性較差。Wei等在小鼠AKI模型上利用GC-MS、LC-MS技術(shù)發(fā)現(xiàn)AKI早期腎組織和血清中3-吲哚硫酸 （3-indoxyl sulfate, 3-IS） 的變化可能是早期診斷AKI的生物標志物65.研究表明植物多酚、甲氯滅酸和肝磺基轉(zhuǎn)移酶抑制劑能夠通過抑制3-IS生成來減輕急性腎損傷66-68.3-IS作為煙堿酸受體激動劑誘導的AKI的標識， 是最有統(tǒng)計學意義的血清生物標志物， 較肌酐和血尿素氮具有更高的敏感性70.此外， 分析代謝組學研究證實早期左旋肉堿可以減少細胞膜磷脂的分解產(chǎn)物 （如溶血磷脂和游離脂肪酸） 以減輕腎損傷70,

20、 也為AKI的藥物治療動態(tài)評估提供了依據(jù)。 2.5 嚴重顱腦傷 嚴重創(chuàng)傷性腦損傷 （traumatic brain injury, TBI） 通常被定義為由格拉斯哥昏迷評分為3871的外力引起的腦損傷， 這意味著患者存在嚴重的意識障礙， 需入住ICU.雖然約30%的嚴重TBI患者會死亡， 50%至少會有中度殘疾， 但仍存有部分恢復良好者72-73, 這就對早期預測TBI的結(jié)局提出嚴峻挑戰(zhàn)性。Viant等74在流體沖擊傷大鼠模型中發(fā)現(xiàn)大腦皮質(zhì)和海馬體中抗壞血酸、谷氨酸、磷酸膽堿、甘油磷酸膽堿和N-乙酰天冬氨酸鹽水平降低， 而血漿中未發(fā)現(xiàn)明顯改變。一項針對TBI和骨科損傷患者的兩個大型獨立隊列綜合

21、代謝分析研究的中發(fā)現(xiàn)鏈脂肪酸 （癸酸和辛酸） 和糖衍生物 （2, 3-二磷酸甘油酸） 與TBI的嚴重程度密切相關(guān)75.可見， 依托神經(jīng)外科特有的有創(chuàng)顱內(nèi)壓檢測或ICU其他血液監(jiān)護手段開展TBI患者的動態(tài)代謝組學分析評估并預測其神經(jīng)功能狀態(tài)， 將成為一種可能。 3 總結(jié)與展望 代謝組學能告訴我們“什么正在發(fā)生”這一動態(tài)生物學問題， 這是機體面對疾病所產(chǎn)生一系列病理生理變化的微觀動態(tài)結(jié)果。重癥醫(yī)學領(lǐng)域的疾病常以“綜合征”為代表， 即使是同一疾病結(jié)局其病因也不盡相同， 但目前所研究的生物標志物更傾向于對疾病“結(jié)果”的闡釋， 而對其內(nèi)在“過程”的解讀較少。同時， 由于環(huán)境、遺傳和病因等的不同， 現(xiàn)行評

22、估這些綜合征的指標并不能完全反映機體所受的上述壓力， 因而運用基因組學或蛋白組學分析研究ICU常見疾病收獲甚少。代謝組學能夠動態(tài)展現(xiàn)機體在遭受刺激后的一系列反應(yīng)的軌跡， 這一代謝網(wǎng)絡(luò)將幫助我們深入理解重癥醫(yī)學領(lǐng)域疾病的發(fā)病機制， 探尋動態(tài)評估疾病的生物標記物及其出現(xiàn)的時間結(jié)點 （如ARDS嚴重程度動態(tài)評估、膿毒癥嚴重程度劃分等） , 并將這些與臨床經(jīng)驗、生物科技技術(shù)和計算機分析相結(jié)合以提高ICU的早期預測能力， 這也許是未來發(fā)展的方向。 參考文獻 1Nicholson JK, Lindon JC, Holmes E.Metabonomics:understanding the metabolic responses of living systems to pathophysiological stimuli via multivariate statistical analysis of biological NMR spectroscopic dataJ.Xenobiotica, 1999, 29 （11） :1181-1189. 2Pauling L, Robinson AB, Teranishi R, et al.Qu