微生物菌種 高通量篩選技術(shù) 與裝置ppt課件

1、 國家生化工程技術(shù)研究中心國家生化工程技術(shù)研究中心()()2011.11.242011.11.24微生物菌種高通量篩選技術(shù)與裝置微生物菌種高通量篩選技術(shù)與裝置內(nèi)容提綱內(nèi)容提綱n 高通量篩選在微生物育種中的重要意義高通量篩選在微生物育種中的重要意義 n 菌種高通量篩選技術(shù)與裝備菌種高通量篩選技術(shù)與裝備國際進展國際進展n 高通量篩選技術(shù)應(yīng)用示范高通量篩選技術(shù)應(yīng)用示范高通量篩選在微生物育種中的重要意義高通量篩選在微生物育種中的重要意義 1、菌種是發(fā)酵技術(shù)的源頭菌種是發(fā)酵技術(shù)的源頭2、菌種是發(fā)酵技術(shù)的核心之核心、菌種是發(fā)酵技術(shù)的核心之核心3、菌種提高不增加設(shè)備材料投入、菌種提高不增加設(shè)備材料投入 菌種

2、發(fā)酵水平是企業(yè)產(chǎn)品市場競爭力的體現(xiàn)菌種發(fā)酵水平是企業(yè)產(chǎn)品市場競爭力的體現(xiàn)青霉素：5萬12萬 u/ml（國內(nèi)） 8萬20萬 u/ml（國外）紅霉素：50008000/10000 u/ml（國內(nèi)） 1000015000 u/ml（國外）阿維菌素：40008400 u/ml（國內(nèi)） 10000 u/ml 以上（國外）案案例例 育種工作中兩大任務(wù)：突變突變與與篩選篩選高通量篩選在微生物育種中的重要意義高通量篩選在微生物育種中的重要意義變異變異菌種庫篩選篩選目標(biāo)株自然選育人工誘變推理選育雜交育種基因工程代謝工程各種組學(xué)系統(tǒng)生物學(xué)合成生物學(xué)特異性模型篩選量突變僅是前提篩選才是關(guān)鍵 我國現(xiàn)有菌種篩選儀器裝備

3、與技術(shù)國際相比存在巨大差距 我國：傳統(tǒng)方法，篩選方式半個世紀(jì)沒有明顯改進 國際：高通量篩選技術(shù)(High throughput screening, HTS) 高通量篩選在微生物育種中的重要意義高通量篩選在微生物育種中的重要意義 Traditional screeningHigh throughput screeningFlask/tube (single)Microtiter plate (12、24、48、96、384、1536)Volume (10-50 ml)Volume (10-500 l)Screen 20-50/week/labScreen 1000-10000/week/lab

4、Manual AutomaticLaborious Laborsaving Series Parallel 內(nèi)容提綱內(nèi)容提綱n 高通量篩選在微生物育種中的重要意義高通量篩選在微生物育種中的重要意義 n 菌種高通量篩選技術(shù)與裝備國際進展菌種高通量篩選技術(shù)與裝備國際進展n高通量篩選技術(shù)應(yīng)用示范高通量篩選技術(shù)應(yīng)用示范1929，1940s-1950sPfizer公司：土霉素的發(fā)現(xiàn)p56名科學(xué)家、10萬份土樣、歷時1年p25%市場1984年，Pfizer提出Automation Project.1990年，在Nagoya, Japan實施p1萬株份/周高通量篩選技術(shù)的起源高通量篩選技術(shù)的起源 微生物菌種

5、篩選一般流程 概率事件菌種高通量篩選技術(shù)與裝備國際進展菌種高通量篩選技術(shù)與裝備國際進展通量限制步驟誘變等誘變等10倍稀釋倍稀釋涂平板涂平板單菌落單菌落初篩初篩復(fù)篩復(fù)篩驗證驗證工業(yè)應(yīng)用工業(yè)應(yīng)用接種到接種到多孔板多孔板倒平板倒平板培養(yǎng)基培養(yǎng)基保藏保藏活化活化前處理前處理檢測檢測出發(fā)菌株出發(fā)菌株微生物菌種篩選儀器裝備發(fā)展趨勢： 自動化、微型化、高通量培養(yǎng)基滅菌、分裝；倒平板；挑取單菌落、接種；培養(yǎng)；目的產(chǎn)物抽提；測定；數(shù)據(jù)收集處理等過程 單元自動化與系統(tǒng)集成自動化（通量匹配）菌種高通量篩選技術(shù)與裝備國際進展菌種高通量篩選技術(shù)與裝備國際進展Filling Unit分裝速率：400 - 1200 dis

6、hes/h分裝量：4 - 45 ml/0.5 - 0.6 sec平動規(guī)格：直徑92 - 98 mm可調(diào)高度15 - 21 mm可調(diào)滅菌方式：253.7 nm 紫外線滅菌尺寸重量：45 cm(L)*30 cm(D)*61cm(H),15 kg Stacking Unit堆疊速率：可調(diào)，與輸送機自動配合。 堆疊高度：2 - 15板平皿，可調(diào)堆疊桌面：500 500 mm可擴充尺寸重量：81cm(L)*49cm(D)*45cm(H),13kg誘變等誘變等10倍稀釋倍稀釋涂平板涂平板單菌落單菌落初篩初篩復(fù)篩復(fù)篩驗證驗證工業(yè)應(yīng)用工業(yè)應(yīng)用接種到接種到多孔板多孔板倒平板倒平板培養(yǎng)基培養(yǎng)基保藏保藏活化活化前處

7、理前處理檢測檢測出發(fā)菌株出發(fā)菌株全自動培養(yǎng)基分裝系統(tǒng)全自動培養(yǎng)基分裝系統(tǒng)750皿/小時自動滅菌培養(yǎng)基制備機自動滅菌培養(yǎng)基制備機 出發(fā)株出發(fā)株誘變等誘變等10倍稀釋倍稀釋涂平板涂平板單菌落單菌落初篩初篩復(fù)篩復(fù)篩工藝工藝放大放大接種接種倒平板倒平板培養(yǎng)基培養(yǎng)基保藏保藏活化活化前處理前處理檢測檢測自動細(xì)菌平板稀釋儀自動細(xì)菌平板稀釋儀 4600個克隆/小時誘變等誘變等10倍稀釋倍稀釋涂平板涂平板單菌落單菌落初篩初篩復(fù)篩復(fù)篩驗證驗證工業(yè)應(yīng)用工業(yè)應(yīng)用接種到接種到多孔板多孔板倒平板倒平板培養(yǎng)基培養(yǎng)基保藏保藏活化活化前處理前處理檢測檢測出發(fā)菌株出發(fā)菌株培養(yǎng)培養(yǎng)出發(fā)株出發(fā)株誘變等誘變等10倍稀釋倍稀釋涂平板涂平

8、板單菌落單菌落初篩初篩復(fù)篩復(fù)篩工藝工藝放大放大接種接種倒平板倒平板培養(yǎng)基培養(yǎng)基保藏保藏活化活化前處理前處理檢測檢測出發(fā)株出發(fā)株誘變等誘變等10倍稀釋倍稀釋涂平板涂平板單菌落單菌落初篩初篩復(fù)篩復(fù)篩工藝工藝放大放大接種接種倒平板倒平板培養(yǎng)基培養(yǎng)基保藏保藏活化活化前處理前處理檢測檢測培養(yǎng)基分裝培養(yǎng)基分裝傳統(tǒng)方法傳統(tǒng)方法誘變等誘變等10倍稀釋倍稀釋涂平板涂平板單菌落單菌落初篩初篩復(fù)篩復(fù)篩驗證驗證工業(yè)應(yīng)用工業(yè)應(yīng)用接種到接種到多孔板多孔板倒平板倒平板培養(yǎng)基培養(yǎng)基保藏保藏活化活化前處理前處理檢測檢測出發(fā)菌株出發(fā)菌株高通量方法：高通量方法：96、384、1536/min傳統(tǒng)方法：傳統(tǒng)方法：1-2/min（分光

9、光度計）（分光光度計）1/15-30min（HPLC）傳統(tǒng)方法傳統(tǒng)方法出發(fā)株出發(fā)株誘變等誘變等10倍稀釋倍稀釋涂平板涂平板單菌落單菌落初篩初篩復(fù)篩復(fù)篩驗證驗證放大放大接種接種倒平板倒平板培養(yǎng)基培養(yǎng)基保藏保藏活化活化前處理前處理檢測檢測培養(yǎng)基分裝培養(yǎng)基分裝1 微孔板式反應(yīng)器微孔板式反應(yīng)器2 微流控式芯片實驗室微流控式芯片實驗室3 搖瓶形式的微型反應(yīng)器搖瓶形式的微型反應(yīng)器1 232056 valves , 256 compartments containing bacterial expressing an enzyme24個，個，5ml12個，個，30ml24個，個，1ml多通道多參數(shù)多通道多參

10、數(shù)微型反應(yīng)器微型反應(yīng)器 動物細(xì)胞培養(yǎng)用微型反應(yīng)器左圖4.92.32.2 m，整個箱體有溫濕度控制，箱體內(nèi)，條形碼閱讀器、蓋板站、封板器、液體處理裝置、搖床、光度計、離心機、冷藏室等。平行地實現(xiàn)樣品準(zhǔn)備、運行、監(jiān)控768個（16個48孔板）。系統(tǒng)集成自動化：四個層次系統(tǒng)集成自動化：四個層次OrbitorOrbitor工作站工作站n重量輕重量輕nonly 55 lbs. 只有25公斤n高可靠性高可靠性nCollision detection & recovery沖突檢測與恢復(fù)nPlate sensing in the gripper微孔板傳感器nServo gripper does not

11、 drop a plate when the power goes out!伺服抓板手- 即使停電也不會讓一個板子掉落n運送一塊板子只需運送一塊板子只需4秒鐘秒鐘nBi-directional telescoping arm雙向伸縮手nUnlimited 3600 rotation無限360度轉(zhuǎn)動oNo hard stops無急停死角nMotion blending運動混合osmooth movements平穩(wěn)移動Orbitor結(jié)構(gòu)剖解nBi-directional telescoping arm雙向伸縮抓板手nRotating base旋轉(zhuǎn)平臺nInternal re-grip內(nèi)部固定裝置n

12、Hotel mount x4 板子堆棧*41.4.3.2.操作靈活性nPC driven微機控制nNo controller required無需其它控制裝置nAdd-on storage capability可搭配存儲能力nSmall footprint小的占地空間和軌跡nFeed up to 4 instruments with ease可連接4臺儀器nFits within a wide variety of bio safety cabinets適應(yīng)多種型號的生物安全柜內(nèi)容提綱內(nèi)容提綱n 高通量篩選在微生物育種中的重要意義高通量篩選在微生物育種中的重要意義 n 菌種高通量篩選技術(shù)國際進

13、展菌種高通量篩選技術(shù)國際進展n 高通量篩選技術(shù)應(yīng)用示范高通量篩選技術(shù)應(yīng)用示范高通量篩選技術(shù)高通量篩選技術(shù)Scale upScale down微型化微型化高通量高通量標(biāo)準(zhǔn)化標(biāo)準(zhǔn)化對高通量篩選技術(shù)存在認(rèn)識上的誤區(qū)對高通量篩選技術(shù)存在認(rèn)識上的誤區(qū)n認(rèn)為微型化只要按比例縮小即可，忽略參數(shù)相關(guān)性問題；對操作條件的平行性沒有足夠的認(rèn)識n僅注重培養(yǎng)環(huán)節(jié)高通量，忽略其他步驟匹配和瓶頸的轉(zhuǎn)移問題n對標(biāo)準(zhǔn)化重于最優(yōu)化的認(rèn)識不足n高通量篩選是提高成功幾率的一種技術(shù)手段. .菌種高通量篩選技術(shù)組成菌種高通量篩選技術(shù)組成高通量高通量前處理技術(shù)前處理技術(shù)高通量高通量培養(yǎng)技術(shù)培養(yǎng)技術(shù)高通量液體高通量液體處理技術(shù)處理技術(shù)高通

14、量高通量轉(zhuǎn)接種技術(shù)轉(zhuǎn)接種技術(shù)高通量克隆高通量克隆制備技術(shù)制備技術(shù)菌種庫菌種庫管理技術(shù)管理技術(shù)高通量數(shù)據(jù)高通量數(shù)據(jù)管理技術(shù)管理技術(shù)高通量分析高通量分析檢測技術(shù)檢測技術(shù)菌種高通量菌種高通量篩選技術(shù)篩選技術(shù)分析測試分析測試高通量培養(yǎng)高通量培養(yǎng)菌種資源菌種資源菌種高通量篩選技術(shù)菌種高通量篩選技術(shù)通量匹配通量匹配限制瓶頸在不斷克服和轉(zhuǎn)移限制瓶頸在不斷克服和轉(zhuǎn)移菌種高通量篩選技術(shù)F菌種高通量篩選技術(shù)是一整套高通量技術(shù)的有機整合和合理匹配紅霉素生產(chǎn)菌株的微型化培養(yǎng)及分析紅霉素生產(chǎn)菌株的微型化培養(yǎng)及分析菌落庫菌落庫孔板培養(yǎng)孔板培養(yǎng)離心離心移液移液檢測檢測高通量高通量微型化培養(yǎng)n就搖瓶與微孔板之間的生理發(fā)酵參數(shù)

15、和動力學(xué)參數(shù)進行了研究，以證實微型化培養(yǎng)方法的可行性，為紅霉素產(chǎn)生菌高通量篩選奠定了基礎(chǔ)。微型化培養(yǎng)-動力學(xué)參數(shù)比較動力學(xué)參數(shù)比較t1t2t3t4t5t6搖瓶搖瓶3031282920342237283012孔板孔板(2.5ml)897861859911932887搖瓶搖瓶12孔微孔板孔微孔板kLa（h-1）10528842.1 氧氣傳遞系數(shù)氧氣傳遞系數(shù)2.2物料混合物料混合流場特性流場特性O(shè)TR 與混合三、三、國家生化工程中心的高通量篩選工作基礎(chǔ)國家生化工程中心的高通量篩選工作基礎(chǔ)微型化培養(yǎng)-發(fā)酵參數(shù)比較發(fā)酵參數(shù)比較 2.3 生物效價生物效價2.4 總糖的對應(yīng)性實驗總糖的對應(yīng)性實驗 微型化培養(yǎng)

16、-發(fā)酵參數(shù)比較發(fā)酵參數(shù)比較 2.5 還原糖的對應(yīng)性實驗還原糖的對應(yīng)性實驗2.6生物量生物量微型化培養(yǎng)-裝置圖種子（挖塊）種子（挖塊）發(fā)酵（孔徑發(fā)酵（孔徑2cm） 微型化分析n建立與微型化發(fā)酵培養(yǎng)配套的檢測方法，才能真正意義上實現(xiàn)篩選的高通量。n生物檢測法生物檢測法n化學(xué)檢測法化學(xué)檢測法生物檢測法生物檢測法n生物檢定法又分管碟法和比濁法兩種，管碟法是最常用的生物檢定法，也是我國2005版之前藥典收錄的唯一一種微生物檢定法。n與管碟法比較，比濁法具有快速(檢驗僅需34 h) 、易于操作、采用液體培養(yǎng)法、無擴散因素影響、靈敏度高和精密度較好等優(yōu)點，適用于絕大部分抗生素和含抗生素樣品的含量測定。化學(xué)檢

17、測法化學(xué)檢測法n紅霉素分子在酸性條件下水解生成黃色絡(luò)合物，此顏色與含量成正比，符合朗格爾比色定律。紅霉素檢測方法紅霉素檢測方法微型化分析-生物檢測法生物檢測法微量比濁法測定紅霉素生物效價的可行性微量比濁法測定紅霉素生物效價的可行性 微型化分析-生物檢測法生物檢測法微型化分析-生物檢測法生物檢測法123456789101112A0.3300.3310.3310.3300.3310.3300.3310.3320.3310.3310.3310.330B0.3320.3330.3330.3320.3320.3330.3330.3330.3330.3330.3320.332C0.3310.3320.33

18、20.3320.3320.3320.3330.3330.3320.3320.3320.331D0.3320.3330.3340.3330.3330.3330.3340.3340.3330.3330.3330.332E0.3320.3330.3330.3330.3330.3330.3340.3330.3330.3340.3330.332F0.3330.3340.3340.3340.3330.3330.3340.3360.3340.3330.3330.333G0.3330.3330.3340.3340.3330.3330.3340.3340.3340.3340.3340.333H0.3330.33

19、30.3330.3330.3330.3330.3330.3330.3330.3330.3330.333準(zhǔn)確度：準(zhǔn)確度：1.5% 精密度：精密度：0.005 相對標(biāo)準(zhǔn)偏差相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)：1.48%檢驗檢驗96孔板的準(zhǔn)確度與精密度孔板的準(zhǔn)確度與精密度 微型化分析-化學(xué)檢測法檢測法紅霉素化學(xué)效價測定結(jié)果比較紅霉素化學(xué)效價測定結(jié)果比較微型化分析-化學(xué)檢測法檢測法樣品前處理對紅霉素效價檢測的影響分析樣品前處理對紅霉素效價檢測的影響分析微型化分析-化學(xué)檢測法檢測法高通量化學(xué)檢測方法驗證高通量化學(xué)檢測方法驗證標(biāo)準(zhǔn)品加入法是在樣品溶液中加入一系列梯度標(biāo)準(zhǔn)溶液進行顯色測定，然后按照繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線的步驟測定

20、吸光度,繪制吸光度-加入濃度曲線,用外推法求得樣品溶液的濃度。兩條直線切入橫座標(biāo)上所間的距離，即是樣品中紅霉素的化學(xué)效價，為47.8 /ml，標(biāo)準(zhǔn)曲線法測定的結(jié)果為48.02/ml，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.00324Y1=0.0046X- 0.0164Y2=0.0046X+0.2202高通量（微型化）抗生素效價分析方法高通量（微型化）抗生素效價分析方法生物效價高通量分析方法：生物效價高通量分析方法： 基于比濁法原理設(shè)計生物效價高通量分析方法，使分析時間從20多小時縮短到4小時，分析樣品量從1ml降到10ul，鑒定菌培養(yǎng)基從30ml降到90ul，一次檢測樣品數(shù)量可達(dá)到成百上千份，而且僅需1人操作，傳統(tǒng)生物效價分析，每天每人