免疫熒光介紹

1、免疫熒光介紹 免疫熒光技術(shù)（Immunofluorescence technique ）又稱熒光抗體技術(shù)，是標(biāo)記免疫技術(shù)中發(fā)展最早的一種。它是在免疫學(xué)、生物化學(xué)和顯微鏡技術(shù)的基礎(chǔ)上建立起來(lái)的一項(xiàng)技術(shù)。很早以來(lái)就有一些學(xué)者試圖將抗體分子與一些示蹤物質(zhì)結(jié)合，利用抗原抗體反應(yīng)進(jìn)行組織或細(xì)胞內(nèi)抗原物質(zhì)的定位。它是根據(jù)抗原抗體反應(yīng)的原理，先將已知的抗原或抗體標(biāo)記上熒光基團(tuán)，再用這種熒光抗體（或抗原）作為探針檢查細(xì)胞或組織內(nèi)的相應(yīng)抗原（或抗體）。利用熒光顯微鏡可以看見熒光所在的細(xì)胞或組織，從而確定抗原或抗體的性質(zhì)和定位。一、基本原理及特點(diǎn)： 免疫熒光技術(shù)是根據(jù)抗原抗體反應(yīng)的原理，先將已知的抗原或抗體標(biāo)記上

2、熒光素，制成熒光抗體，再用這種熒光抗體（或抗原）作為探針檢測(cè)組織或細(xì)胞內(nèi)的相應(yīng)抗原（或抗體）。在組織或細(xì)胞內(nèi)形成的抗原抗體復(fù)合物上含有標(biāo)記的熒光素，利用熒光顯微鏡觀察標(biāo)本，熒光素受外來(lái)激發(fā)光的照射而發(fā)生明亮的熒光（黃綠色或橘紅色），可以看見熒光所在的組織細(xì)胞，從而確定抗原或抗體的性質(zhì)、定位，以及利用定量技術(shù)測(cè)定含量。 該技術(shù)的主要特點(diǎn)是：特異性強(qiáng)、敏感性高、速度快。主要缺點(diǎn)是：非特異性染色問題尚未完全解決，結(jié)果判定的客觀性不足，技術(shù)程序也還比較復(fù)雜。 熒光免疫法按反應(yīng)體系及定量方法不同，還可進(jìn)一步分做若干種。與放射免疫法相比，熒光免疫法無(wú)放射性污染，并且大多操作簡(jiǎn)便，便于推廣。國(guó)外生產(chǎn)的TDM

3、用試劑盒，有相當(dāng)一部分即屬于此類，并且還有專供TDM熒光偏振免疫分析用的自動(dòng)分析儀生產(chǎn)。由于一般熒光測(cè)定中的本底較高等問題，熒光免疫技術(shù)用于定量測(cè)定有一定困難。新發(fā)展了幾種特殊的熒光免疫測(cè)定，與酶免疫測(cè)定和放射免疫分析一樣，在臨床檢驗(yàn)中應(yīng)用。 免疫熒光實(shí)驗(yàn)的主要步驟包括細(xì)胞片制備、固定及通透（或稱為透化）、封閉、抗體孵育及熒光檢測(cè)等。細(xì)胞片制備（通俗的說(shuō)法是細(xì)胞爬片）是免疫熒光實(shí)驗(yàn)的第一步，細(xì)胞片的質(zhì)量對(duì)實(shí)驗(yàn)的成敗至關(guān)重要，原因很簡(jiǎn)單，如果發(fā)生細(xì)胞掉片，一切都無(wú)從談起。這一步關(guān)鍵的是玻片（Slides or Coverslips）的處理以及細(xì)胞的活力，有人根據(jù)成功經(jīng)驗(yàn)總結(jié)出許多有益的細(xì)節(jié)或小竅

4、門，非常值得借鑒。固定和通透步驟最重要的是根據(jù)所研究抗原的性質(zhì)選擇適當(dāng)?shù)墓潭ǚ椒?，合適的固定劑和固定程序?qū)τ讷@得好的實(shí)驗(yàn)結(jié)果是非常重要的。免疫熒光中的封閉和抗體孵育與其它方法（如 ELISA 或 Western Blot）中的相同步驟是類似的，最重要的區(qū)別在于免疫熒光實(shí)驗(yàn)中要用到熒光抗體，因此必須謹(jǐn)記避光操作，此外抗體濃度的選擇可能更加關(guān)鍵。最后需要注意的是，標(biāo)記好熒光的細(xì)胞片應(yīng)盡早觀察，或者用封片劑封片后在 4或-20避光保存，以免因標(biāo)記蛋白解離或熒光減弱而影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。由于操作步驟比較多，同時(shí)在分析結(jié)果時(shí)無(wú)法像 WB 那樣可以根據(jù)分子量的大小區(qū)分非特異性識(shí)別，所以要得到一個(gè)完美的免疫熒光實(shí)

5、驗(yàn)結(jié)果，除了需要高質(zhì)量的抗體，以及對(duì)實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行反復(fù)優(yōu)化外，還必須設(shè)立嚴(yán)謹(jǐn)?shù)膶?shí)驗(yàn)對(duì)照?？傊?，免疫熒光實(shí)驗(yàn)從細(xì)胞樣品處理、固定、封閉、抗體孵育到最后的封片及觀察拍照，每步都非常關(guān)鍵，需要嚴(yán)格控制實(shí)驗(yàn)流程中每個(gè)步驟的質(zhì)量，才能最終達(dá)到你的實(shí)驗(yàn)?zāi)康?。?熒光色素介紹： 許多物質(zhì)都可產(chǎn)生熒光現(xiàn)象，但并非都可用作熒光色素。只有那些能產(chǎn)生明顯的熒光并能作為染料使用的有機(jī)化合物才能稱為免疫熒光色素或熒光染料。常用的熒光色素有： （一）熒光色素 1 異硫氰酸熒光素（fluoresceinisothiocyanate，F(xiàn)ITC）為黃色或橙黃色結(jié)晶粉末，易溶于水或酒精等溶劑。分子量為389.4，最大吸收光波長(zhǎng)為4

6、90495nm，最大發(fā)射光波長(zhǎng)520530nm，呈現(xiàn)明亮的黃綠色熒光，結(jié)構(gòu)式如下：有兩種同分異結(jié)構(gòu)，其中異構(gòu)體型在效率、穩(wěn)定性、與蛋白質(zhì)結(jié)合能力等方面都更好，在冷暗干燥處可保存多年，是應(yīng)用最廣泛的熒光素。其主要優(yōu)點(diǎn)是：人眼對(duì)黃綠色較為敏感，通常切片標(biāo)本中的綠色熒光少于紅色。 2 四乙基羅丹明（rhodamine，RIB200）為橘紅色粉末，不溶于水，易溶于酒精和丙酮。性質(zhì)穩(wěn)定，可長(zhǎng)期保存。結(jié)構(gòu)式如下：最大吸收光波長(zhǎng)為570nm，最大發(fā)射光波長(zhǎng)為595600nm，呈橘紅色熒光。 3四甲基異硫氰酸羅丹明（tetramethylrhodamineisothiocyanate，TRITC）結(jié)構(gòu)式如下：

7、最大吸引光波長(zhǎng)為550nm，最大發(fā)射光波長(zhǎng)為620nm，呈橙紅色熒光。與FITC的翠綠色熒光對(duì)比鮮明，可配合用于雙重標(biāo)記或?qū)Ρ热旧?。其異硫氰基可與蛋白質(zhì)結(jié)合，但熒光效率較低。 （二）其他熒光物質(zhì) 1 酶作用后產(chǎn)生熒光的物質(zhì)某些化合物本身無(wú)熒光效應(yīng)，一旦經(jīng)酶作用便形成具有強(qiáng)熒光的物質(zhì)。例如4-甲基傘酮-D半乳糖苷受-半乳糖苷酶的作用分解成4-甲基傘酮，后者可發(fā)出熒光， 激發(fā)光波長(zhǎng)為360nm，發(fā)射光波長(zhǎng)為450nm。其他如堿性酸酶的底物4-甲基傘酮磷酸鹽和辣根過氧化物酶的底物對(duì)羥基苯乙酸等。 2鑭系螯合物某些3價(jià)稀土鑭系元素如銪（Eu3+）、鋱（Tb3+）、鈰（Ce3+）等的螯合物經(jīng)激發(fā)后也可發(fā)

8、射特征性的熒光，其中以Eu3+應(yīng)用最廣。Eu3+螯合物的激發(fā)光波長(zhǎng)范圍寬，發(fā)射光波長(zhǎng)范圍窄，熒光衰變時(shí)間長(zhǎng)，最適合用于分辨熒光免疫測(cè)定。 所需要的儀器：熒光顯微鏡、顯微熒光分光光度計(jì)、流式細(xì)胞儀和時(shí)間分辨熒光計(jì)等儀器 激光共聚焦顯微鏡 熒光偏振免疫分析用偏振光激發(fā)標(biāo)記物，利用結(jié)合競(jìng)爭(zhēng)免疫原理，可以快速檢測(cè)激素種瘤標(biāo)志物、維生素和多種治療藥物濃度。而且用于鑒定的材料也比較多樣，可以是培養(yǎng)物、感染組織、分泌排泄物，也可以是土壤、水、雜物等。應(yīng)用于生物酶含量及活性測(cè)定、臨床醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)、食品分析和環(huán)境監(jiān)測(cè)、毒品檢驗(yàn)。 選擇熒光素主要考慮以下幾點(diǎn)：高消光系數(shù)（extinction coefficient）

9、和光子產(chǎn)量（Quantum yield），這意味著光捕獲能力強(qiáng)和效率高；光穩(wěn)定性較好；與常見光源和濾光器匹配性較好；不干擾抗體反映；水溶性以及 pH 穩(wěn)定性。此外，還需要考慮到是否有毒性以及熒光素的顏色是否與背景顏色反差大對(duì)比鮮明等。三.熒光技術(shù)平臺(tái)介紹:1.時(shí)間分辨熒光免疫測(cè)定 以常用熒光素作為標(biāo)記物的熒光免疫測(cè)定往往受血清成分、試管、儀器組件等的本底熒光干擾，以及激發(fā)光源的雜射光的影響，使靈敏度受到很大限制。時(shí)間分辨熒光免疫測(cè)定（timeresolvedfluorescenceimmunoassay，TR-FIA）是針對(duì)這缺點(diǎn)加以改進(jìn)的一種新型檢測(cè)技術(shù)。其基本原理是以鑭系元素銪（Eu）螯合

10、物作熒光標(biāo)記物，利用這類熒光物質(zhì)有長(zhǎng)熒光壽命的特點(diǎn)，延長(zhǎng)熒光測(cè)量時(shí)間，待短壽命的自然本底熒光完全衰退后再行測(cè)定，所得信號(hào)完全為長(zhǎng)壽命鑭系螯合物的熒光，從而有效地消除非特異性本底熒光的干擾。TR-FIA的測(cè)定原理見圖17-4。以雙抗體夾心法為例的測(cè)定反應(yīng)程序見圖17-5。其中增強(qiáng)液的作用是使熒光信號(hào)增強(qiáng)。因?yàn)槊庖叻磻?yīng)完成后，生成的抗原抗體銪標(biāo)記物復(fù)合物在弱堿性溶液中，經(jīng)激發(fā)后所產(chǎn)生的熒光信號(hào)甚弱。在增強(qiáng)液中可至pH23，銪離子很容易解離出來(lái)，并與增強(qiáng)液中的-二酮體生成帶有強(qiáng)烈熒光的新的銪螯合物，大大有利于熒光測(cè)量。所用檢測(cè)儀器為時(shí)間分辨熒光計(jì)，與一般的熒光分光光度計(jì)不同，采用脈沖光源（每秒閃爍1

11、000次的氙燈），照射樣品后即短暫熄滅，以電子設(shè)備控制延緩時(shí)間，待非特異本底熒光衰退后，再測(cè)定樣品發(fā)出的長(zhǎng)鑭系熒光。檢測(cè)靈敏度可達(dá)0.21ng/ml。 2.解離增強(qiáng)鑭系元素?zé)晒饷庖叻治鼋怆x增強(qiáng)鑭系元素?zé)晒饷庖叻治觯―issociation Enhanced Lanthanide FluoroimmunoassayDELFIA）是時(shí)間分辨熒光免疫分析中的一種。它用具有雙功能基團(tuán)結(jié)構(gòu)的螯合劑，使其一端與銪（Eu）連接，另一端與抗體/抗原分子上的自由氨基連接，形成EU標(biāo)記的 經(jīng)過免疫反應(yīng)之后生成免疫復(fù)合物。由于這種復(fù)合物在水中的熒光強(qiáng)度非常弱，因此加入一種增強(qiáng)劑，使Eu3+從復(fù)合物上解離下來(lái)，自由E

12、u3+同增強(qiáng)劑中的另一種螯合劑螯合形成一種膠態(tài)分子團(tuán)，這種分子團(tuán)在紫外光的激發(fā)下能發(fā)出很強(qiáng)的熒光，信號(hào)增強(qiáng)了百萬(wàn)倍。因?yàn)檫@種分析方法使用了解離增強(qiáng)步驟，因此稱為解離增強(qiáng)鑭系元素?zé)晒饷庖叻治觥?兩對(duì)半定量測(cè)定 乙肝病毒（HBV）標(biāo)記物的檢測(cè)方法常用測(cè)定乙肝病毒的抗原、抗體標(biāo)記物，由60年代末70年代初的瓊脂擴(kuò)撒法，依次發(fā)展為血凝法酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）、同位素免疫標(biāo)記（RIA）化學(xué)發(fā)光免疫分析、生物發(fā)光、電化學(xué)發(fā)光免疫標(biāo)記和80年代中建立的稀土離子熒光標(biāo)記（時(shí)間分辨熒光免疫分析 ）等不同的檢測(cè)方法。隨著科學(xué)的發(fā)展和檢驗(yàn)技術(shù)的進(jìn)步，其方法每發(fā)展一步，乙肝標(biāo)記物檢出的靈敏度和準(zhǔn)確性都得到不同的提

13、高(其中RIA為10-12mol/L、ELISA為10-9mol/L、CLIA為10-15mol/L、ECL10為-17/L、TRF為10-18mol/L)。其中時(shí)間分辨熒光免疫分析（TRF）為近年新研制成功的用三價(jià)稀土離子作為示蹤物，以單克隆抗體包被支持物與樣品中抗原反應(yīng)，再加入用銪（EU）標(biāo)記的抗體，進(jìn)行反應(yīng)檢測(cè)，可大大降低一般同位素和熒光標(biāo)記受環(huán)境干擾缺點(diǎn)，提高了檢測(cè)的靈敏度和準(zhǔn)性，該TRF法檢測(cè)乙肝病毒標(biāo)記物較其他方法靈敏度高、特異性好，因干擾因素少可大地優(yōu)于以上各種方法， 可與HBV-DNA的檢測(cè)相比(未經(jīng)規(guī)范化要求開展的HBV-DNA檢測(cè)，多年的臨床實(shí)驗(yàn)證明，假陽(yáng)性、假陰性率較高，

14、重復(fù)性差，且不能定量。)，TRF為目前檢測(cè)乙肝病毒標(biāo)記物最理想的方法。TRF定量檢測(cè)乙肝病毒“兩對(duì)半”為臨床診斷乙肝提供了新手段，有助于臨床客觀的分析HBV感染情況、療效的觀察和轉(zhuǎn)歸等情況的分析，至少可對(duì)下列情況更具有獨(dú)特的診斷價(jià)值：1治療前進(jìn)行病毒定量檢測(cè)，可以指導(dǎo)選擇抗病毒藥物，避免盲目用藥。2治療后定量間接判斷體內(nèi)病毒數(shù)量，有助于療效的觀察。3. 懷孕前進(jìn)行定量測(cè)定，有助于選擇有利的懷孕時(shí)機(jī)。乙肝孕婦進(jìn)行定量檢查，有助于使部分病人得到及時(shí)的正確的診斷 時(shí)間分辨熒光免疫定量測(cè)定乙肝兩對(duì)半的臨床意義 目前我科已正式開展了乙肝二對(duì)半的TRFIA定量分析，其每一項(xiàng)的正常值范圍均是由我國(guó)衛(wèi)生部根據(jù)

15、美國(guó)雅培的標(biāo)準(zhǔn)而制定，其靈敏度，準(zhǔn)確度，及精確度都有遠(yuǎn)遠(yuǎn)優(yōu)于一般的ELISA法，乙肝兩對(duì)半的定量制定將給臨床提供一個(gè)關(guān)于乙肝診斷及療效，預(yù)后判斷的更可靠的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。 1.極大地提高了檢測(cè)的靈敏度 時(shí)間分辨熒光免疫定量技術(shù)（TRFIA）檢測(cè)HbsAg靈敏度可達(dá)0.2ng/ml,而酶標(biāo)（EIASA）檢測(cè)的靈敏度是2ng/ml，極大地提高檢測(cè)的靈敏度。因此，在急性乙肝早期能及早檢出HbsAg，確證HBV感染，縮短窗口期；其次，可發(fā)現(xiàn)低濃度HbsAg攜帶者；在部分慢性乙肝患者中，由于機(jī)體缺乏對(duì)HBV包膜蛋白的免疫應(yīng)答，HbsAg表達(dá)較低，酶標(biāo)檢測(cè) 可出現(xiàn)HbsAg和 HbsAb均陰性的情況，TRF技術(shù)

16、則可避免這些情況的發(fā)生，為正確判斷病情提供依據(jù)。 2.能動(dòng)態(tài)觀察療效和監(jiān)測(cè)病情 1） 定量分析HBsAg和 HBsAb的濃度變化，可預(yù)見急性乙肝是否處于恢復(fù)期。如HBsAg濃度降低，HBsAb濃度逐漸升高，可說(shuō)明病情正往恢復(fù)期發(fā)展；反之，HBsAg濃度處于較高水平或上升趨勢(shì)，而HBsAb一直處于較低水平，則易發(fā)展為慢性乙肝或病毒攜帶者。 2） 定量分析HBeAg和HBeAb的濃度變化，可反映病情變化和治療效果。定量測(cè)定能明確檢測(cè)HBeAg向HBeAb轉(zhuǎn)換的時(shí)期，即表現(xiàn)為HBeAg濃度下降和HbeAb升高的過程。高濃度的HBeAg還可間接提示病毒處于高復(fù)制狀態(tài)，具有較高的傳染性。高濃度的HBeA

17、b一方面提示病情好轉(zhuǎn)，而在某些時(shí)候（如肝功能指標(biāo)很差）則可能與肝壞死、肝硬化、肝癌有關(guān)。 3） HBcAb濃度的高低可反映病毒感染的狀態(tài)。高濃度的抗-Hbc提示乙肝急性感染，恢復(fù)期濃度降低。慢性乙肝呈抗-Hbc持續(xù)高濃度。而低濃度的抗-Hbc一般為恢復(fù)期或既往感染。 4） 有利于對(duì)慢性肝炎活動(dòng)性或非活動(dòng)性的判斷。非活動(dòng)性慢性乙肝各項(xiàng)指標(biāo)相對(duì)穩(wěn)定，活動(dòng)性往往呈現(xiàn)進(jìn)行性變化。 3.TRFIA和定量PCR技術(shù)可互相補(bǔ)充 血清HBVDNA熒光定量PCR測(cè)定可以直接反映血液中病毒復(fù)制狀態(tài)，具有很多臨床應(yīng)用價(jià)值，但不能完全反映病毒復(fù)制靜息期肝細(xì)胞內(nèi)HBV病毒狀態(tài)。HBVDNA陰性并不完全代表體內(nèi)HBV已被

18、清除，結(jié)合“兩對(duì)半”各項(xiàng)指標(biāo)更能客觀反映體內(nèi)HBV病毒狀態(tài)。 4.HbsAb的定量測(cè)定能夠?qū)σ腋蔚念A(yù)防起到監(jiān)督作用 HbsAb的定量測(cè)定能夠?qū)贵w是否真正具有“中和”HBV的免疫力作出正確評(píng)價(jià)，對(duì)乙肝的預(yù)防起到監(jiān)督作用。HbsAb的含量在10mlU/ml以上病人ELISA檢測(cè)即可呈陽(yáng)性結(jié)果，但并不提示機(jī)體都一定具有免疫力，而HBsAb 的含量在10100mlU/ml之間的樣本，定性雖為“陽(yáng)性”，但此時(shí)機(jī)體對(duì)HBV的免疫力較弱，甚至不能預(yù)防HBV感染。只有HbsAb的含量達(dá)到100mlU/ml以上時(shí)才可確定具有抵抗HBV入侵的作用。作定量檢測(cè)，可根據(jù)HBsAb 的含量判斷機(jī)體對(duì)HBV的免疫狀態(tài)及

19、乙肝疫苗的免疫效果。因此定量測(cè)定對(duì)乙肝疫苗免疫力的評(píng)價(jià)和高危人群預(yù)防免疫具有重要意義，特別是在少年兒童預(yù)防乙肝方面。 3.熒光偏振免疫測(cè)定 熒光偏振免疫分析技術(shù)(FPIA),這是一種均相熒光免疫分析法,主要用于測(cè)定小分子量物質(zhì),如藥物濃度測(cè)定。原理是:標(biāo)記在小分子抗原上的熒光素經(jīng)485m的激發(fā)偏振光照射后,吸收光能,越入激發(fā)狀態(tài),激發(fā)狀態(tài)的熒光素不穩(wěn)定,很快以發(fā)出光子的形式釋放能量而還原。發(fā)射出的光子經(jīng)過偏振儀形成525一550nm的偏振光,這一偏振光的強(qiáng)度與熒光素受激發(fā)時(shí)分子轉(zhuǎn)動(dòng)的速度呈反比,游離的熒光素標(biāo)記抗原,分子小,轉(zhuǎn)動(dòng)速度快,激發(fā)后發(fā)射的光子散向四面八方,因此通向偏振儀的光信號(hào)很弱,

20、而與抗體大分子結(jié)合的熒光素標(biāo)記抗原,因分子大,分子的轉(zhuǎn)動(dòng)慢,激發(fā)后產(chǎn)生的熒光比較集中,因此偏振光信號(hào)比未結(jié)合時(shí)強(qiáng)得多。在測(cè)定過程中待測(cè)抗原小分子、熒光標(biāo)記抗原小分子和特異性抗體大分子同時(shí)加入到一反應(yīng)杯中,經(jīng)過溫育,待測(cè)抗原和熒光標(biāo)記抗原競(jìng)爭(zhēng)性地與抗體結(jié)合。待測(cè)抗原越少,與抗體競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合的量越少,而熒光標(biāo)記抗原與抗體結(jié)合量就越多,當(dāng)激發(fā)光照射時(shí),熒光偏振的程度與熒光標(biāo)記物分子轉(zhuǎn)動(dòng)的速度成反比,而熒光標(biāo)記的小分子抗原與大分子抗體結(jié)合后,其分子的轉(zhuǎn)動(dòng)速度減慢,因此熒光偏振信號(hào)強(qiáng)。結(jié)果是待測(cè)抗原的濃度低,可以通過計(jì)算獲得其含量。作為一種均相標(biāo)記免疫分析技術(shù)，熒光偏振免疫方法與其它非均相標(biāo)記免疫方法相比具

21、有顯著的優(yōu)點(diǎn)：1）抗原抗體間的反應(yīng)和樣品分于的測(cè)定在溶液中進(jìn)行進(jìn)免了固相標(biāo)記過程中反復(fù)多次的洗滌步驟屆于實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化控制和提高分析方法的精度，F(xiàn)PIA方法的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（CV一般可控制在 35之間；2）檢測(cè)過程僅需樣品、示蹤劑和抗體的加入和混勻數(shù)分鐘甚至數(shù)秒鐘孵育后即可測(cè)定熒光偏振光強(qiáng)度方法的測(cè)定速度快有利于大批量樣品的分析測(cè)試；（3）因?yàn)闊晒馄癫皇軆?nèi)濾作用的影響，對(duì)于有顏色和渾濁的溶液仍能很好地完成檢測(cè)任務(wù)：（4）不需要使用放射性問位素避免了污物不易處理的難題。4.熒光免疫法 原理是應(yīng)用一對(duì)單克隆抗體的夾心法。底物用磷酸-4-甲基傘形酮，檢測(cè)產(chǎn)物發(fā)出的熒光，熒光強(qiáng)度與Mb濃度呈正比，可在8m

22、in內(nèi)得出結(jié)果。結(jié)果以Mb每小時(shí)釋放的速率表示(Mb)表示。該法重復(fù)性好，線性范圍寬，具有快速、敏感、準(zhǔn)確的特點(diǎn)。以雙抗夾心法為例，首先將特異性抗體與固相載體連接，形成固相抗體。除去未結(jié)合抗體，然后加受檢標(biāo)本，使其中的蛋白抗原與固相抗體形成抗原抗體復(fù)合物。洗滌除去未結(jié)合物，接著加入熒光標(biāo)記的抗體，使之與抗原特異性結(jié)合，形成抗體抗原抗體復(fù)合物。最后根據(jù)熒光強(qiáng)度，即可對(duì)蛋白抗原進(jìn)行定量。傳統(tǒng)的熒光免疫法受本底熒光的干擾較大，時(shí)間分辨熒光免疫測(cè)定法是以具有特長(zhǎng)壽命的稀土金屬如銪，作為標(biāo)記物，加入正常液后激發(fā)測(cè)定，能有效去除短壽命本底熒光的干擾。5.放射免疫法 放射免疫法是以過量的未標(biāo)記抗原與放射性物

23、質(zhì)標(biāo)記的抗原，競(jìng)爭(zhēng)性地與抗體結(jié)合，形成有放射性的抗原抗體復(fù)合物與無(wú)放射性的抗原抗體復(fù)合物，并有過剩的標(biāo)記抗原與未標(biāo)記的抗原。然后通過離心沉淀等方法，將抗原抗體復(fù)合物與游離抗原分離，分別測(cè)定其放射性強(qiáng)度與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較，即可對(duì)未標(biāo)記的待測(cè)抗原進(jìn)行定量。RIA法測(cè)定血清蛋白靈敏度高、特異性強(qiáng)，可準(zhǔn)確定量到ngml水平。但早期的方法操作麻煩，耗時(shí)長(zhǎng)，且有放射性污染。近年來(lái)，隨著單克隆抗體的應(yīng)用，RIA的靈敏度又有了較大提高，且操作大為簡(jiǎn)化，并已有商品試劑盒供應(yīng)，使用方便。 免疫熒光層析快速診斷試紙條主要是將特異性的抗原或抗體以條帶狀包被在NC膜的檢測(cè)線T上，熒光標(biāo)記的抗原或抗體吸附在結(jié)合墊上，當(dāng)待測(cè)樣

24、品加到試紙條一端的加樣墊孔上后，通過毛細(xì)作用向前移動(dòng)，溶解結(jié)合墊上的熒光標(biāo)記的抗原或抗體，再移動(dòng)至包被的抗原或抗體的檢測(cè)線處，如果樣品中含有相應(yīng)的抗體或抗原，包被在檢測(cè)線上的抗原或抗體和熒光標(biāo)記物與樣品中的相應(yīng)抗體或抗原結(jié)合，形成免疫復(fù)合物，熒光標(biāo)記物富集在檢測(cè)線處形成一條通過激發(fā)產(chǎn)生熒光的檢測(cè)線。如果待檢血清中沒有相應(yīng)抗體，熒光標(biāo)記物將不會(huì)與包被在檢測(cè)線上的抗原或抗體結(jié)合，熒光標(biāo)記物不會(huì)富集，檢測(cè)線上不會(huì)出現(xiàn)能產(chǎn)生熒光的檢測(cè)線。當(dāng)樣品與溶化了的熒光標(biāo)記物繼續(xù)往上移動(dòng)至對(duì)照線時(shí)，就與包被在對(duì)照線處的特異性抗體或抗原結(jié)合，在對(duì)照線上形成免疫復(fù)合物，出現(xiàn)一條通過激發(fā)產(chǎn)生熒光的對(duì)照線。免疫熒光層析快

25、速診斷技術(shù)，由于具有操作簡(jiǎn)單、速度快、穩(wěn)定性好、靈敏度高、成本低等優(yōu)點(diǎn)，已在醫(yī)學(xué)、動(dòng)植物檢疫、食品安全監(jiān)督各領(lǐng)域得到了日益廣泛的應(yīng)用。目前，醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中應(yīng)用的免疫熒光層析快速檢測(cè)技術(shù)主要有夾心法和競(jìng)爭(zhēng)法兩種方法。這兩種方法都是以微孔濾膜為載體，包被已知抗原或抗體，加入待檢標(biāo)本后，經(jīng)濾膜的毛細(xì)管作用或滲濾作用使標(biāo)本中的抗原或抗體與膜上包被的抗體或抗原結(jié)合，再用熒光標(biāo)記物與之反應(yīng)形成可通過激發(fā)產(chǎn)生熒光的結(jié)果，從而達(dá)到檢測(cè)目的?？傊庖邿晒鈱游隹焖贆z測(cè)技術(shù)開始逐漸得到廣泛應(yīng)用的免疫標(biāo)記技術(shù)。作為一種檢測(cè)技術(shù)與其他方法相比，如ELISA。RIA，金標(biāo)記等，在許多方面具有無(wú)可比擬的優(yōu)勢(shì)，該技術(shù)操作簡(jiǎn)便、

26、快速、特異，靈敏度高，全定量檢測(cè)，特別適用急診現(xiàn)場(chǎng)即時(shí)檢測(cè)（POCT）和診斷。在今后的研究中，免疫熒光層析快速檢測(cè)技術(shù)將更進(jìn)一步顯示其巨大的優(yōu)越性，同時(shí)也將在更廣闊的領(lǐng)域內(nèi)發(fā)揮其作用。免疫熒光層析快速檢測(cè)技術(shù)是以熒光物質(zhì)作為示蹤標(biāo)志物，應(yīng)用于抗原抗體反應(yīng)的一種型免疫標(biāo)記技術(shù)。近年來(lái)，該技術(shù)在醫(yī)學(xué)、動(dòng)植物檢疫、食品安全監(jiān)督等各領(lǐng)域得到了日益廣泛的應(yīng)用。免疫熒光層析快速檢測(cè)技術(shù)的靈敏性與ELISA基本相近，許多試驗(yàn)的敏感度都可達(dá)到0.1 ngmL或更低水平，但是有些試驗(yàn)往往不能達(dá)到如此的敏感度，靈敏度的提高無(wú)疑會(huì)拓寬免疫熒光層析快速檢測(cè)技術(shù)的檢測(cè)范圍。進(jìn)一步尋找提高檢測(cè)敏感性的熒光標(biāo)記物，提高準(zhǔn)確

27、性及自動(dòng)化程度，改進(jìn)多元檢測(cè)平臺(tái)的方法學(xué)是未來(lái)免疫熒光層析快速檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展方向。6.偶聯(lián)生物素親和素系統(tǒng)的酶免法 利用了一個(gè)親和素分子可以與4個(gè)生物素分子結(jié)合的特性，使傳統(tǒng)的靈敏度較高的酶免法的靈敏度又有明顯的放大作用。7.熒光定量 PCR 技術(shù) 常規(guī) PCR 中，在擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束之后，我們一般通過凝膠電泳的方法對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行定性的分析，無(wú)法對(duì) PCR 擴(kuò)增反應(yīng)進(jìn)行實(shí)時(shí)檢測(cè)，也無(wú)法對(duì)起始模板準(zhǔn)確定量，而很多情況下，我們所感興趣的是起始模板量， 如轉(zhuǎn)基因動(dòng)植物中插入某種外源基因的拷貝數(shù)或者病人中某種病毒 DNA/RNA 的精確 copy 數(shù)等，如此，熒 光定量 PCR 技術(shù)便應(yīng)運(yùn)而生。四.熒光技

28、術(shù)平臺(tái)具體介紹:1. 時(shí)間分辨熒光免疫分析法 時(shí)間分辨熒光免疫分析法(Time-resolved fluoroimmunoassay)是在熒光分析的基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的一種特殊的熒光分析。它利用具有長(zhǎng)效熒光的稀土金屬（Eu、Tb、Sm、Dy）作標(biāo)記物，充分利用激發(fā)光與發(fā)射光之間的降移與發(fā)射光較長(zhǎng)的半壽期，在激發(fā)光后延時(shí)測(cè)量發(fā)射光的強(qiáng)度。從而所測(cè)的熒光不受激發(fā)光和被檢物中的非特異熒光干擾，提高了檢測(cè)的特異性與靈敏度。在激發(fā)光后延時(shí)400微秒，測(cè)量400微秒，間歇200微秒后進(jìn)入下一個(gè)測(cè)量周期，每一個(gè)周期為1000微秒。對(duì)每一個(gè)樣品實(shí)施1秒鐘的測(cè)量，意味著完成了1000個(gè)周期的測(cè)量，測(cè)量精確度極高。（

29、一）Auto DELFIA自動(dòng)時(shí)間分辨熒光免疫分析儀 開/關(guān)程序1 開機(jī)1.1 依次打開樣品處理器電源，微孔板處理器電源，打印機(jī)電源。1.2 打開計(jì)算機(jī)顯示器。1.3 啟動(dòng)計(jì)算機(jī)。1.4 運(yùn)行系統(tǒng)軟件： Auto DELFIA與Multicalc系統(tǒng)軟件在Windows啟動(dòng)后自動(dòng)運(yùn)行。Auto DELFIA workstation軟件用于控制Auto DELFIA的運(yùn)行，MultiCalc的主要功能是與主機(jī)通訊，對(duì)測(cè)試結(jié)果進(jìn)行評(píng)估和對(duì)質(zhì)控及其他數(shù)據(jù)處理（可通過雙擊屏幕上圖標(biāo)不運(yùn)行）。在MultiCalc Auto DELFIA環(huán)境下，只有鍵盤有效，鼠標(biāo)無(wú)效。2 開機(jī)后準(zhǔn)備1.1 清洗液準(zhǔn)備 微

30、孔板處理器洗液（250ml濃縮液600ml去離子水混合），每做一塊板至少1升用量，洗液在密閉條件可保存2周時(shí)間。 準(zhǔn)備樣品處理器洗液（50ml濃縮液5000ml去離子水混合），每做一塊板至少需要800ml洗液，洗液在密閉條件下可保存1周時(shí)間。1.2 樣品處理器準(zhǔn)備 在Wash bottle（清洗液瓶）、Rinse bottle (沖洗液瓶)分別注入足夠用量的清洗液和去離子水，倒空廢液瓶。擰緊各瓶蓋，確保廢液瓶管路向下。 如樣品需要稀釋，放入稀釋杯和稀釋液。系統(tǒng)安裝時(shí)已調(diào)好有71ml和190ml兩種規(guī)格的稀釋杯，若使用71ml的稀釋杯，從最右端開始放置，如有預(yù)處理樣品，則不能使用190ml的稀釋

31、杯。不能使用多個(gè)稀釋杯。1.3 微孔板處理器準(zhǔn)備。 1.4 點(diǎn)擊Load菜單下的Load System Liquids選項(xiàng)Option-Show Tempareture顯示溫度和壓力。當(dāng)管路內(nèi)有壓力時(shí)，不要打開瓶蓋。1.5 點(diǎn)擊Maintenance Plate Processor Washer test，檢查洗板機(jī)功能，系統(tǒng)自動(dòng)提示檢查步驟。1.6 在試劑艙內(nèi)插入足量干凈、不彎曲的吸嘴。1.7 裝載足量干凈的稀釋杯，每一稀釋杯分為兩半，可做兩次稀釋，總共有24個(gè)稀釋位。1.8 檢查檢測(cè)帽（白色）是否放入試劑艙最左邊第一個(gè)帽架位置，并且其他位置沒有黑色防蒸發(fā)帽。1.9 確認(rèn)傳送器下方的廢物盤已

32、倒空。1.10 檢查兩瓶增強(qiáng)液是否足夠（一瓶可做8塊板），通常先換右邊的瓶子，但如左邊瓶?jī)?nèi)溶液少于1/3，則兩瓶均須更換。增強(qiáng)液瓶?jī)?nèi)有壓力，必須擰緊蓋子。必要時(shí)使用Maintenance菜單下的 Enhancement solution flush 命令灌注管路。1.11 校準(zhǔn)品：每瓶hAFP和hCG校準(zhǔn)品瓶中精確加1.1ml去離子水，輕輕混勻，30min后去除泡沫使用。需再次使用的校準(zhǔn)品保存于-20。1.12 Eu/Sm標(biāo)記物溶液：在使用前1h，根據(jù)每條板條（12孔）需30l標(biāo)記物和30ml緩液配制標(biāo)記物溶液。 3 關(guān)機(jī)3.1 關(guān)閉微孔板處理器電源。3.2 用探針支架支撐探針架防止損壞，關(guān)閉

33、樣品處理器電源。3.3 退出Auto DELFIA系統(tǒng)軟件，退出MultiCalc軟件。退出Windows。3.4 關(guān)閉電腦電源。（二）Auto DELFIA自動(dòng)時(shí)間分辨熒光免疫分析儀 分析參數(shù)設(shè)置程序1 檢驗(yàn)項(xiàng)目設(shè)置1.1 在操作主界面點(diǎn)擊Settings菜單 選擇Assay Protocols（檢驗(yàn)項(xiàng)目）。1.2根據(jù)需要選擇校準(zhǔn)曲線、樣品復(fù)管數(shù)、批號(hào)和質(zhì)控。使用新批號(hào)試劑時(shí)，則更新批號(hào)。如果選擇了參考曲線，批號(hào)改變后系統(tǒng)自動(dòng)提示需做一條新的曲線。1.3 若欲將結(jié)果存到LIS系統(tǒng)中，確認(rèn)在MultiCalc中Protocol的 Stored Files里選擇Results，并選擇Result

34、e格式。1.4 如果要做雙標(biāo)，須先做溢出糾正因子校正（詳見維護(hù)保養(yǎng)部分）。1.5 如果做新生兒篩查，在Settings菜單系統(tǒng)子菜單下選擇新生兒篩查。編輯檢驗(yàn)項(xiàng)目、校準(zhǔn)和質(zhì)控。1在主界面鼠標(biāo)點(diǎn)擊Settings菜單，選擇Assay protocols 如 Screening AFP-BHCG Edit 。2進(jìn)入Assay protocol editor 對(duì)話框。輸入相應(yīng)的批號(hào)，根據(jù)試劑說(shuō)明書上標(biāo)注輸入正確的校準(zhǔn)品濃度值。（三）Auto DELFIA自動(dòng)時(shí)間分辨熒光免疫分析儀 校準(zhǔn)程序。1.1選擇校準(zhǔn)模式：有7種不同的選擇，在屏幕左邊從上到下依次是每一測(cè)試塊均做標(biāo)準(zhǔn)曲線；第一塊測(cè)試板做標(biāo)準(zhǔn)曲線，

35、其余的做兩點(diǎn)校正；第一塊測(cè)試板做標(biāo)準(zhǔn)曲線，其余不做校正和校準(zhǔn)；每一測(cè)試板均做兩點(diǎn)校正；第一塊測(cè)試板做兩點(diǎn)校正，其余不做校正和校準(zhǔn)；不做校正和校準(zhǔn)，使用上一次標(biāo)準(zhǔn)曲線；不做校正和校準(zhǔn)，使用MultiCalc中設(shè)定的參考曲線。1.2 如果還有其他需要，可更改校準(zhǔn)品數(shù)目。例如要求第一塊板做標(biāo)準(zhǔn)曲線，其余的做3點(diǎn)校正，則選擇第二項(xiàng)，然后在“Next Plates”下選擇相應(yīng)的3個(gè)標(biāo)準(zhǔn)即可。1.3 如果做雙標(biāo)（Dual Label Assay ），例如AFPhcg，則無(wú)法更改校準(zhǔn)品的數(shù)目，只能修改濃度值。雙標(biāo)有A-Protocol和B-Protocol兩種協(xié)議，要更改B-protocol的濃度值，點(diǎn)擊屏

36、幕右下角的 B-protocol 鍵。彈出新對(duì)話框，可修改校準(zhǔn)品和質(zhì)控濃度值，然后按 OK 保存退出。返回到Assay Protocol Editor對(duì)話框。1.4 復(fù)管數(shù)：在屏幕右下方點(diǎn)擊 Replicates ,輸入校準(zhǔn)品、質(zhì)控品及待檢標(biāo)本的復(fù)管數(shù)，按 OK保存，返回Assay Protocol Editor對(duì)話框。 1.5 在Assay Protocol Editor對(duì)話框輸入校準(zhǔn)品批號(hào)，輸入正確的校準(zhǔn)品濃度值。1.6 進(jìn)入Map Of Standards 對(duì)話框，拉出校準(zhǔn)品抽屜，按屏幕提示順序依次放入校準(zhǔn)品，放好后合上校準(zhǔn)品抽屜，按OK 。使用后，校準(zhǔn)品立即放置于4冰箱內(nèi)保存。校準(zhǔn)品打

37、開后最多使用二次。在標(biāo)準(zhǔn)抽屜內(nèi)一次最多可放8個(gè)項(xiàng)目的校準(zhǔn)品。1.6 運(yùn)行（四）Auto DELFIA自動(dòng)時(shí)間分辨熒光免疫分析儀 室內(nèi)質(zhì)控程序1.1 點(diǎn)擊屏幕右邊 Controls進(jìn)入Controls 界面，輸入質(zhì)控的允許范圍（目標(biāo)值±2S）、質(zhì)控代碼、質(zhì)控批號(hào)，必要時(shí)在Dil中輸入質(zhì)控稀釋倍數(shù)。1.2 在屏幕左邊Controls欄選擇質(zhì)控做在第一塊板或下一塊板或最后一塊板。在屏幕下部的測(cè)試板圖上已顯示有校準(zhǔn)品。在屏幕右邊Control Operation 欄中選擇所用的質(zhì)控水平（Low、 Medium、High、Control 45），然后移動(dòng)光標(biāo)到板上所要放置的位置。1.3 必要時(shí)

38、選中Move Control、Delete control對(duì)質(zhì)控進(jìn)行移動(dòng)和刪除操作。1.4 然后按 OK鍵完成編輯,按 Close鍵保存。1.5 運(yùn)行三、運(yùn)行1 工作前準(zhǔn)備（二）創(chuàng)建工作表在以上準(zhǔn)備工作完成后，有兩種方法檢測(cè)。即點(diǎn)擊AutoMate（自動(dòng)操作）鍵，系統(tǒng)會(huì)按預(yù)定的程序執(zhí)行?；蜻x擇Load Worklist 或Create list一步一步運(yùn)行。在Auto DELFIA軟件中創(chuàng)建工作表，還可在已存在的工作表中添加樣品：用鼠標(biāo)點(diǎn)擊空位置，然后輸入所須的項(xiàng)目即可。（如果試管已經(jīng)放入樣品處理器中，則不能添加項(xiàng)目）。321編輯試管架圖1 在主屏點(diǎn)擊Create list圖出現(xiàn)Analyte

39、s & samples 和Sample Racks 兩個(gè)對(duì)話框。2 進(jìn)入Sample Racks（樣品架圖），點(diǎn)擊想添加樣品的位置，會(huì)出現(xiàn)一紅方框。注意要確保選擇的位置與試管架上樣品的實(shí)際位置對(duì)應(yīng)。通過對(duì)話框下方的按鍵可實(shí)現(xiàn)以下功能： 點(diǎn)擊 Plate Map 看微孔板圖。 選擇一試管，然后點(diǎn)擊 Del Tube刪除該管檢測(cè)。 Print打印樣品信息。3在屏幕試管架圖最后一排編號(hào)為73的單獨(dú)試管架，是質(zhì)控架，如已在檢驗(yàn)項(xiàng)目中設(shè)置了質(zhì)控品，則自動(dòng)顯示在質(zhì)控架上。322 移動(dòng)試管架1在想插入試管架的編號(hào)區(qū)輸入希望的試管架編號(hào)，則該位置上插入了你輸入編號(hào)的試管架，其余試管架相應(yīng)后移。2如不使

40、用1號(hào)試管架，則必須移動(dòng)試管架或?qū)⒃嚬苤苯泳幹频竭m當(dāng)?shù)脑嚬芗苌稀?23 移動(dòng)質(zhì)控架如要把質(zhì)控放到其他試管架，在當(dāng)前質(zhì)控架73編號(hào)區(qū)輸入想放質(zhì)控的編號(hào)。如把73號(hào)改成40號(hào)，則40架號(hào)成為質(zhì)控架而原質(zhì)控架73號(hào)變成普通的樣品架73。324 移動(dòng)試管用鼠標(biāo)點(diǎn)住想移動(dòng)的試管，將其拖到需要放的位置，然后釋放鼠標(biāo)。在試管架圖左下角顯示出鼠標(biāo)位置、試管數(shù)和稀釋液位置（從右到左排列）。完成試管架安排后，點(diǎn)擊Close，關(guān)閉Sample Racks 對(duì)話框。325 項(xiàng)目和樣品1 在Analytes & samples對(duì)話框中，在Analytes欄中選擇檢驗(yàn)?zāi)康? 在屏幕右邊的下拉菜單中選擇測(cè)試項(xiàng)目。S

41、creening的下拉菜單中只顯示已校準(zhǔn)的測(cè)試項(xiàng)目。3 選擇合適的試劑盒（1板或4板）及程序（不同溫育時(shí)間）。4 選擇合適的運(yùn)行序號(hào)，按OK 。進(jìn)入Sample 對(duì)話框。注意： l 在設(shè)置菜單中選擇了新生兒篩查后，才能按需要間歇振蕩篩查項(xiàng)目。l 如果在系統(tǒng)設(shè)定中選擇了下一管，則需要預(yù)處理的實(shí)驗(yàn)將不顯示。5在Sample 對(duì)話框的Code區(qū)輸入相應(yīng)的樣本ID號(hào)，連續(xù)樣本以2個(gè)點(diǎn)（.）連接起始ID號(hào)與未尾ID號(hào)，即xx.xxx 。點(diǎn)擊 Accept 或按ENTER鍵。6在樣本類型欄中選擇合適的試管，否則吸樣探針會(huì)吸錯(cuò)位。7確認(rèn)前可在項(xiàng)目列表中雙擊項(xiàng)目名稱以刪除測(cè)試；如果已按Accept鍵，可在微孔

42、板圖中刪除管。8已經(jīng)確認(rèn)后也能增加測(cè)試樣本。包括使用微管稀釋樣品添加測(cè)試項(xiàng)目，但系統(tǒng)設(shè)定中選擇下一管或下一架，則不能添加。注意不能更改已確認(rèn)樣品的稀釋狀態(tài)。9確認(rèn)后，樣品架圖上選中的試管位顏色發(fā)生改變，綠色為樣品、淺蘭色為用來(lái)稀釋樣本的空管或經(jīng)稀釋的質(zhì)控或經(jīng)預(yù)處理的標(biāo)準(zhǔn)、紅色為質(zhì)控。10必要時(shí)，在Sample 對(duì)話框的Factor欄中輸入稀釋倍數(shù)（5-100），按Accept鍵。在試管架上會(huì)顯示出稀釋管的位置。所有稀釋管標(biāo)本設(shè)定好后，按Accept鍵。注：定義稀釋管時(shí)試管類型仍然為樣品管，按確定鍵后，會(huì)自動(dòng)變?yōu)橄♂尮?。如果樣品處理器類型?297-014，必須在稀釋管槽內(nèi)從右到左依次放入稀釋微

43、管。在稀釋杯內(nèi)加入適當(dāng)稀釋液。11預(yù)稀釋倍數(shù)：在此Pre-dilution中輸入樣品加樣前的預(yù)稀釋倍數(shù)，以便MultiCalc能計(jì)算出正確的結(jié)果。12原始標(biāo)本：選擇Use primary，則系統(tǒng)會(huì)吸取等量的稀釋樣品和原樣品。否則只吸取稀釋樣品。該功能只是對(duì)選中的項(xiàng)目有效。13復(fù)管數(shù)：如希望樣品復(fù)管數(shù)不同與檢驗(yàn)項(xiàng)目中設(shè)定的復(fù)管數(shù)，在 # Repl欄中輸入需要的復(fù)管數(shù)。該功能只是對(duì)選中的項(xiàng)目有效。14增加管：Add tubes顯示除樣品外的其他和該待測(cè)樣品有關(guān)的試管數(shù)，如稀釋管、微管等。15.條形碼：選中Barcode ，則以條形碼來(lái)識(shí)別試管。326 微孔板圖：1點(diǎn)擊樣品架圖下方Plate Map

44、按鍵，顯示測(cè)試項(xiàng)目的微孔板圖。圖中黃色為校準(zhǔn)品，紅色為質(zhì)控，綠色為樣品，淺蘭色為稀釋液，紫色為稀釋質(zhì)控，深蘭色為手動(dòng)樣品，灰色為空管。2在微孔板圖左下方顯示實(shí)驗(yàn)板總數(shù)、當(dāng)前第幾塊板和在浮育器中的位置、試劑盒的總數(shù)及位置。3按 Prev 和 Next ，顯示前一板和下一塊板狀態(tài)。4按 Delete test 、 Delete Plate 和 Delete Well 分別可刪除當(dāng)前測(cè)試項(xiàng)目、刪除當(dāng)前測(cè)試中的最后一塊微孔板、刪除選定的微孔，同時(shí)與之相應(yīng)的試管也被刪除5按 Pack Plates ，整理刪除后的微孔板。6按 Rack map 鍵，系統(tǒng)提示裝載微孔板，然后直接進(jìn)行測(cè)量。327 結(jié)束創(chuàng)建工

45、作表工作表創(chuàng)建完成后，按儀器上的Load按扭裝載樣品，然后鼠標(biāo)點(diǎn)擊屏幕上的 Close ， 結(jié)束創(chuàng)建工作表，此時(shí)系統(tǒng)會(huì)顯示出校準(zhǔn)品圖，裝載校準(zhǔn)品。（五）Auto DELFIA自動(dòng)時(shí)間分辨熒光免疫分析儀 試劑/材料裝載程序1 樣品管/架裝載1.1 鎖定加樣臂：在裝載試管架之前，按Lock鍵鎖定加樣臂，裝載完畢后按Lock釋放加樣臂。1.2 將有紅色數(shù)字標(biāo)記的質(zhì)控試管架和樣品架依次放到裝載位置，質(zhì)控架在最前面，從樣本運(yùn)送器最右邊的起始端開始裝載試管架，將試管架有條形碼端向外。關(guān)上進(jìn)樣倉(cāng)蓋子，按Load鍵。1.3 待質(zhì)控架檢測(cè)完成后自動(dòng)退出，放于樣本處理器中央的特定位置，關(guān)上蓋后按Load鍵，儀器自

46、動(dòng)裝載樣品架。1.4 如在系統(tǒng)設(shè)置中選擇了稀釋微管，根據(jù)系統(tǒng)提示所需的稀釋微管量，從右向左裝載稀釋微管。1.5 裝載完畢，按Close 鍵如果樣品量非常少，可以手動(dòng)加樣（在Analytes & samples的Tube type列表中Man. Pipetted 或在Worklist 的 comment區(qū)域中輸入M 。待儀器對(duì)其他孔完成吸樣后，系統(tǒng)提示手工加樣到呈深蘭色的空孔，操作者拿出板加樣，要求每孔加樣時(shí)間不超過2分10秒，在屏幕上顯示倒計(jì)時(shí)，完成手工加樣后，按IN/OUT按鈕，或按OK 以確認(rèn)已手工吸樣。否則，到時(shí)間后板被自動(dòng)運(yùn)送到下一步操作區(qū)，并報(bào)警為未手工加樣）。9點(diǎn)擊主屏上的

47、Schedule 按鈕，在屏幕上顯示檢測(cè)項(xiàng)目的最佳順序和時(shí)間進(jìn)程。不同的顏色代表不同的功能。黃色表示測(cè)試板的加樣時(shí)間、深蘭色表示孵育時(shí)間、淺蘭色表示稀釋時(shí)間或預(yù)處理時(shí)間、紅色表示清洗、加液等時(shí)間。在Priority 欄下，對(duì)不同的項(xiàng)目設(shè)置不同的優(yōu)先級(jí)，從而再制時(shí)間表。2 微孔板裝載1 鼠標(biāo)點(diǎn)擊Load plate 圖標(biāo)，樣品處理器加樣臂自動(dòng)移到左邊以方便操作。這時(shí)屏幕出現(xiàn)裝板信息。在每行前面的紅箭頭表示正在裝載的微孔板。2 由于系統(tǒng)的洗板機(jī)每次清洗兩條板孔，如測(cè)試板條為奇數(shù)，則用清潔的空板補(bǔ)足成偶數(shù)板條。3 檢查每個(gè)板孔是否潮濕，可用干凈軟紙擦干。否則會(huì)造成板條感應(yīng)出錯(cuò)，和測(cè)量熒光時(shí)計(jì)數(shù)錯(cuò)誤。

48、4 待微孔板支架到位后，依列表順序?qū)⒌谝粔K微孔板放到支架內(nèi)，微孔板的條形碼向右（A板條在右邊），然后按IN/OUT鍵，系統(tǒng)自動(dòng)將微孔板送進(jìn)溫育器內(nèi)。如有第二塊板，系統(tǒng)讀取完板的批號(hào)后，微孔板支架返回裝載位置繼續(xù)裝載，直到所有微孔板裝載完畢。5 如板上條碼讀不出，則顯示錯(cuò)誤信號(hào)。如板放錯(cuò)位，點(diǎn)擊Retry 后取出板，以正確方法重新放入支架中，如果是條碼的問題，則點(diǎn)擊Ignore 并輸入板的批號(hào)，不必輸板的系列號(hào)。6 在裝載板時(shí)，系統(tǒng)檢查每一次板的支架在孵育器中的位置，如有問題，則該板就不能被裝入，并需要重新運(yùn)行系統(tǒng)，啟動(dòng)程序會(huì)把支架重新帶入孵育器中。3 試劑裝載1 點(diǎn)擊Load reagents

49、 圖標(biāo)，顯示需要裝載的試劑及相應(yīng)的信息，每行前面的紅箭頭表示正在被條碼機(jī)讀取的試劑盒。根據(jù)提示檢查相應(yīng)的信息。2在試劑杯(cassettes)右邊帖上條形碼，條形碼上的批號(hào)要與試劑盒上的一致。在條形碼上還標(biāo)有微孔板的編號(hào)，用來(lái)定義相應(yīng)的微孔板。3根據(jù)屏幕列表所示，在試劑架上從左到右依次放置已開蓋的所需試劑 ，在示蹤劑和抗體瓶上放黑色的防揮發(fā)帽。示蹤劑的位置標(biāo)記在試劑杯的底部。試劑杯有四種類型，適用于不同的試劑。4放好所有試劑后，按 OK 鍵，條形碼開始讀取試劑條碼，完成后提示裝載微孔板。（二）Auto DELFIA自動(dòng)時(shí)間分辨熒光免疫分析儀 開始運(yùn)行1點(diǎn)擊Start run 圖標(biāo)，開始自動(dòng)運(yùn)行

50、，顯示試劑架各試劑和消耗品的情況。 2 按照?qǐng)D中的位置檢查試劑位置、吸嘴、稀釋杯及板條量是否正確，點(diǎn)擊 OK 。3 屏幕上顯示微孔板處理器和樣品處理器的液體量。檢查是否達(dá)到屏幕所示的最低限度液體量。注：殘留量 ：樣品處理器： 清洗瓶為 -2.5L ；去離子水瓶為 -1.5L 稀釋液瓶為 -6mL。微孔板處理器：清洗液瓶和去離子水瓶均為 -1.5L；左邊增強(qiáng)液瓶不少于1/3瓶。4 檢查完畢后按 OK ，系統(tǒng)開始自檢準(zhǔn)備運(yùn)行。確認(rèn)吸嘴、稀釋杯、防蒸發(fā)帽是否已經(jīng)放好，各瓶液量足夠、廢液瓶有足夠的空間等。自檢無(wú)誤后，屏幕顯示出測(cè)量時(shí)間表并開始運(yùn)行。5 運(yùn)行進(jìn)程屏幕出現(xiàn)測(cè)量進(jìn)程圖，實(shí)時(shí)顯示當(dāng)前運(yùn)行的狀態(tài)

51、及時(shí)間。如果運(yùn)行過程中由于某種原因進(jìn)程被終止，會(huì)在進(jìn)程圖上顯示一紅叉，可在歷史記錄中查閱有關(guān)信息。注意：出現(xiàn)問題后，下次運(yùn)行之前請(qǐng)重新啟動(dòng)系統(tǒng)。（七）運(yùn)行結(jié)束運(yùn)行結(jié)束后，測(cè)出的計(jì)數(shù)值被保存在計(jì)數(shù)文件中，計(jì)數(shù)值由MultiCalc計(jì)算后打印出。確保MultiCalc處在計(jì)數(shù)狀態(tài)以保證結(jié)果會(huì)自動(dòng)輸出。（八）卸載運(yùn)行結(jié)束后鼠標(biāo)點(diǎn)擊Unload 圖標(biāo)，選擇卸載樣品/卸載微孔板，點(diǎn)擊 OK 鍵，按提示卸載完成后鼠標(biāo)點(diǎn)擊取消鍵。（九）查看加樣圖加樣圖是一8×12的矩陣圖，對(duì)應(yīng)微孔板的每一孔。在每一孔內(nèi)有如下信息：序列號(hào)、探針號(hào)、試管或校準(zhǔn)品、計(jì)數(shù)值和錯(cuò)誤信息。其中：探針號(hào)：第幾根探針進(jìn)行加樣。試

52、管或校準(zhǔn)品：所加樣品為血清或校準(zhǔn)品。其中R代表試管，S代表校準(zhǔn)品，D代表稀釋微管，P代表位置。例如：R2P3代表試管架2的第3個(gè)試管。計(jì)數(shù)值：實(shí)際測(cè)量出的計(jì)數(shù)值。錯(cuò)誤信息：L-液體量過少（蘭色代表稀釋液過少，綠色代表預(yù)處理故障）；E-空試管或校準(zhǔn)品瓶；C-加樣探針堵塞；F-液體表面有氣泡；W-交叉污染警告。鼠標(biāo)左鍵點(diǎn)擊每一孔，可看每一孔的詳細(xì)信息。四、結(jié)果測(cè)試結(jié)果保存到C:wiacalcoauxAfp-bhcg.a文件中，將該文件拷貝到f:中。（二）Auto DELFIA自動(dòng)時(shí)間分辨熒光免疫分析儀 維護(hù)保養(yǎng)程序（一）該軟件提供了維護(hù)計(jì)劃表。每次維護(hù)都會(huì)被記入數(shù)據(jù)庫(kù)存檔。1在主屏點(diǎn)擊 Maint

53、enance 圖標(biāo)的History ，輸入用戶名 OK 2進(jìn)入 Maintenance History 窗口，顯示當(dāng)前儀器保養(yǎng)情況和下次保養(yǎng)時(shí)間。3在Maintenance History 窗口，點(diǎn)擊Settings鍵 出現(xiàn)Maintenance Settings窗口，激活需做保養(yǎng)檢查盒，在Reporting框中可選擇off 或overdues或 All OK 2 在Maintenance History 窗口點(diǎn)擊 Register 鍵，選擇所需的保養(yǎng)方式 OK 接受。（二）每日保養(yǎng)52.1 Washer test洗板機(jī)功能測(cè)試 1 點(diǎn)擊Maintenance /Plate processor

54、 ,進(jìn)入Plate washer 界面 OK 2 把一塊96孔空的微孔板平穩(wěn)地放于微孔板的支架上，按IN/POUT按鈕。3 板被送入儀器內(nèi)，系統(tǒng)檢查板條數(shù)并灌滿洗液后返回到載板位。4 用仔細(xì)檢查每個(gè)孔是否均注滿，再放入載板位，按IN/OUT按鈕。5 板進(jìn)入儀器后孔內(nèi)液體被吸干，然后板被送出。6 檢查各孔是否完全被吸干?？芍貜?fù)操作，檢測(cè)完成后按 Close 鍵。7 如有孔沒有被加滿或吸干液體，可使用洗板機(jī)清洗保養(yǎng)程序。 522 Waste tray 清理廢物盤倒空廢物盤內(nèi)的吸頭，用自來(lái)水沖洗，晾干。523 Sampl e processor tubing 樣本處理器管道1 檢查樣本處理器管路系統(tǒng)

55、在灌水過程中是否有氣泡。如僅有小氣泡則沒問題；如果是大氣泡，可用Maintenance /Sample processor /Rinse 命令沖洗系統(tǒng)將氣泡排出；如有大量氣泡不能被排除，先檢查蠕動(dòng)泵內(nèi)管路連接和四個(gè)閥門是否有故障。2 在注射器中偶有小氣泡不成問題，但如存在大的氣泡，而且經(jīng)輕輕拍打注射器或擰緊接口、拉直管路也不能排除的，則要考慮更換注射器。524 Rinse沖洗（Rinse）進(jìn)入Maintenance /Sample processor/Rinse OK 。用去離子水沖洗樣本探針并浸泡針管。通常在運(yùn)行樣本測(cè)定后儀器會(huì)自動(dòng)沖洗。525 Temperature溫度點(diǎn)擊Options

56、/Show temperature ,以檢查溫度調(diào)節(jié)功能。通常在下列條件下，溫度在25±2范圍內(nèi)：室溫15-30；板處理器合上蓋子；在啟動(dòng)后至少二h保持溫度穩(wěn)定，如果不在這一范圍聯(lián)系工程師。（三）每周保養(yǎng)531 Instrument cleaning儀器清洗進(jìn)入Maintenance/instrument cleaning，顯示消毒或清洗項(xiàng)目及所需的時(shí)間，根據(jù)需要可選擇進(jìn)行。1 選擇對(duì)樣本或板處理器清洗、消毒后，拿掉其他樣本支架，按Yes 。接著對(duì)話框要求倒空廢液瓶，把裝有50ml 0.2 % 的次氯酸鈉溶液（2000PPM Cl ）或70%-80%乙醇溶液的瓶子放入試劑盒子最左邊位

57、置，并在試劑架的起始位置放兩個(gè)吸頭，放一空的微孔板，按OK 鍵或IN/OUT按鈕，板進(jìn)入儀器內(nèi)開始消毒。完成后板回到裝載位，取出。 2 如用于新生兒疾病篩查中FT3或FT4的檢測(cè)，則必須對(duì)移動(dòng)盤進(jìn)行消毒，這只能與洗板機(jī)消毒同時(shí)進(jìn)行。3 使用高效含氯溶液對(duì)板處理器消毒前先倒空廢液內(nèi)液體再消毒，因?yàn)樵鰪?qiáng)液會(huì)降低廢液的 PH值而釋放氯氣。 裝載板，點(diǎn)擊OK或按板邊上的IN/OUT按鈕， 4 當(dāng)清洗探針時(shí)，把盛有1：20倍稀釋的DELFIA Wash液的8支試管放于試管架上，用內(nèi)徑9-14mm的圓底試管，按OK，輸入試管架號(hào)（系統(tǒng)提供），按OK。5 當(dāng)消毒探針時(shí)，系統(tǒng)提示放置一個(gè)含70%-80%乙醇消毒液的8管洗液和4管水的架子，每管液體量至少35ml 。高氯溶液、丙酮、變質(zhì)酒精會(huì)毀壞探針。如果選擇了探針清洗和消毒兩項(xiàng)，系統(tǒng)會(huì)完成清洗后進(jìn)行消毒，最后會(huì)用水清洗。6 倒空廢液瓶并移去微孔板后按Yes鍵，把工作記錄入檔。最后用“Unload sample racks”命令取出支架。 532 Enhancement Solution outlet 增強(qiáng)液出口檢查增強(qiáng)液出口處是否曾有液體濺出，如有用棉簽拭干凈。533 Sample