PCR抑制劑和增強劑（課堂PPT）

1、.1PCR抑制劑和增強劑.2PCR抑制劑 SDS 苯酚 乙醇 異丙醇 乙酸鈉 氯化鈉 EDTA 血紅素（heme） hemin（氯高鐵血紅素） tannic acids（丹寧酸） 肝素尿素二甲苯胺溴酚蘭腐殖質(zhì) 植物多糖聚苯乙烯、聚丙烯 鐵離子bilirubin（膽紅素） 膽酸鹽.3抑制劑來源抑制劑來源抑制劑抑制劑來源來源膽酸鹽糞便復(fù)雜多糖糞便，植物材料膠原質(zhì)組織血紅素（heme）血液腐植酸土壤，植物材料，自然界水黑色素頭發(fā)，皮膚尿素尿血色素hemoglobin 血液靛青染料粗斜紋棉布聚苯乙烯，聚丙烯紫外線照射塑料管蛋白酶牛奶鈣離子牛奶，骨頭.4抑制劑的作用濃度SDS離子去污劑 ，蛋白變性，0.

2、01%即可完全抑制PCR反應(yīng)，0.005%可顯著降低產(chǎn)量 苯酚蛋白變性，0.5%即可完全抑制PCR反應(yīng)，0.2%可顯著降低產(chǎn)量 乙醇大于1%的濃度可抑制PCR反應(yīng)，但在某些系統(tǒng)中可增加產(chǎn)量。異丙醇抑制作用比乙醇稍強乙酸鈉大于5mM時抑制PCR反應(yīng)氯化鈉大于25mM時抑制PCR反應(yīng)EDTA0.5mM可使PCR產(chǎn)物減少，1mM完全沒有PCR產(chǎn)物。血色素 1mg/ml肝素0.15I.U./ml尿素20mM（相當(dāng)于10l PCR體系中含0.6l尿液）氯高鐵血紅素0.1ng/l 丹寧酸0.1ng/l .5例1：操作時溫度不同產(chǎn)生的抑制劑 Shames等人（1995）使用PVP（polyvinylpyro

3、llidone）在4分離糞便中的細(xì)菌DNA，然后用Chelex100處理。盡管用PVP在室溫也可以分離DNA，但得到的DNA用于PCR擴增效果不夠好，也許因為在更高的溫度釋放出了更多的PCR抑制劑。 .6例2：間接產(chǎn)生的抑制劑Yoshii T等人1992年，用單根頭發(fā)提取DNA擴增線粒體DNA一段333bp的非編碼區(qū)。所有實驗均截取5cm長的毛干后研究表明染色劑中的過氧化后研究表明染色劑中的過氧化氫可以使不溶于水的黑色素變氫可以使不溶于水的黑色素變成水溶性的。成水溶性的。頭發(fā)種類截取毛干區(qū)域擴增成功率自然黑發(fā)離根部11cm內(nèi)100%離根部11cm外部分成功離根部16cm外幾乎不成功白頭發(fā)離根部

4、31cm外可成功染成深咖啡色的黑頭發(fā)完全失敗染成深咖啡色的白頭發(fā)可成功擴增.7PCR增強劑 PCR增強劑可以增加所需PCR產(chǎn)物的產(chǎn)量或減少非特異性產(chǎn)物。有許多的PCR增強劑，原理各不相同，這些試劑不可能對所有的PCR反應(yīng)都起作用。 根據(jù)其作用和原理，可以大致分為三類： 1.用于擴增高GC含量或形成復(fù)雜二級結(jié)構(gòu)的模板（共溶劑） 2.用于保護DNA聚合酶的活性和穩(wěn)定性 3.用于優(yōu)化引物和模板的結(jié)合.81.用于擴增高GC含量或形成復(fù)雜二級結(jié)構(gòu)的模板的增強劑 甜菜堿（betaine），二甲基亞砜（DMSO）和甲酰胺（formamide），甘油，適合于擴增高GC含量和形成復(fù)雜二級結(jié)構(gòu)的模板。 甜菜堿1M

5、、DMSO1-10（5%？）、甲酰胺1-5、甘油1-10對某些反應(yīng)可以顯著提高產(chǎn)量，但過量的這些試劑會抑制PCR反應(yīng)。.9 在高濃度時，許多添加劑和共溶劑都可以抑制PCR，對不同濃度的引物和模板DNA的組合都應(yīng)該通過經(jīng)驗來確定其最適濃度。根據(jù)我們的觀點，當(dāng)PCR出現(xiàn)問題時首先考慮的不應(yīng)該是使用這些增強劑，而應(yīng)該是對反應(yīng)體系的控制成分進行優(yōu)化，尤其是鎂離子和鉀離子的濃度。這個普遍這個普遍規(guī)律的一個例外是規(guī)律的一個例外是GC-Melt（Clontech公司）的應(yīng)用公司）的應(yīng)用，我們發(fā)現(xiàn)它常常能夠克服和解決對富含G+C的模板進行擴增時效率低下的問題。 分子克隆實驗指南 Frackman et al.

6、(1998) have demonstrated (using NMR analysis) that the PCR additive provided by QIAGEN in their PCR core kit (Q-Solution) and that provided by CLONTECH in the Advantage-GC cDNA PCR kit is in fact Betaine which is available at a fraction of the cost as a 5M solution from Sigma-Aldrich (cat. # B 0300)

7、 .102.用于保護聚合酶的活性和穩(wěn)定性的增強劑 有的反應(yīng)中，0.1mg/ml的BSA、 0.1-10的明膠（gelatin）或非離子型的去污劑，可以解決一些擴增失敗的問題，這類試劑可以增加聚合酶的穩(wěn)定性，減少試劑在管壁上的吸附。 BSA可以抵抗血色素、黑色素等的抑制作用. 非離子去污劑，例如Tween-20, NP-40和Triton X-100等，可以抵抗痕量的強離子去污劑的抑制作用，比如0.01%的SDS。.113.用于優(yōu)化引物和模板的結(jié)合 銨離子的添加，可以減少引物和模板的錯配，提高反應(yīng)的特異性，可以讓PCR對反應(yīng)條件的要求更低，所以很多PCR試劑都包含了10-20mM的硫酸銨。 氯化

8、四甲胺tetramethyl ammonium chloride（TMAC） （15-100mM ）也起到類似的作用.124.其它增強劑 PEG 亞精胺 單鏈DNA結(jié)合蛋白.13例：Relief of Amplification Inhibition in PCR with Bovine Serum Albumin or T4 Gene 32 Protein 已知抑制劑：已知抑制劑： EDTA,SDS,Triton X-100，hemin（氯高鐵血紅素），bilirubin（膽紅素），sodium glycocholate (甘膽酸鈉)，sodium cholate plus deoxycho

9、late（脫氧膽酸鈉），sodium taurocholate,（牛黃膽酸鈉），tannic acids（丹寧酸），humic acid(腐植酸)，氯化鐵，氯化鈉，采自泥炭和Suwannee河的腐植酸和fulvic acid(棕黃酸) .14 PCR反應(yīng)：擴增Bacteroides distasonis基因組 消除腐植酸抑制作用的最優(yōu)BSA濃度是200-400ng/l，最優(yōu)gp32濃度是100-150ng/l 因此，所有已知的抑制劑在檢測時，都同時做了不含BSA和gp32的檢測和含有400ng/l BSA或150ng/l gp32的檢測。 抑制水平的定義：通過瓊脂糖電泳觀察，能夠可重復(fù)性的降低

10、PCR產(chǎn)量的最低抑制劑濃度。.15不添加任何增強劑.16PCR體系中加入400ng/l BSA.17PCR體系中加入150ng/l gp32.18加和不加增強劑的比較.19結(jié)果1抑制劑不加增強劑時的抑制水平加入增強劑后的抑制水平增強劑效果EDTA 1mM 1mM 無效FeCl3 1mM 10M100倍bilirubin（膽紅素） 10g/l100g/l10倍，不明顯Humic acid，Hemin，tannic acid 0.1ng/l 10ng/l 100倍fulvic acid 1ng/l 100ng/l 100倍.20結(jié)果2 1. BSA和gp32都不能減少最小濃度的下列抑制劑的抑制作用：0.1M 氯化鈉，0.1M SDS，10%Triton X-100，1-10g/l任何一種膽酸鹽，EDTA。 2. hemin的抑制作用可以被BSA或gp32明顯減輕（1000倍），但其降解產(chǎn)物bilirubin卻不能（小于10倍）。 3.氯化鐵在含BSA或gp32時，抑制水平降低100倍（1mM VS 0.01mM），在氯化鐵濃度大于1mM時，因為形成難溶的氫氧化物，釋放氫離子，PCR反應(yīng)體