血細(xì)胞分析儀的溯源及國(guó)際參考方法

1、作者單位:日本神戶(hù)市西區(qū)高琢臺(tái)日本SYSMEX株式會(huì)社學(xué)術(shù)部國(guó)際學(xué)術(shù)交流血細(xì)胞分析儀的溯源及國(guó)際參考方法藤本敬二為加強(qiáng)對(duì)血細(xì)胞分析儀的溯源及國(guó)際參考方法了解,作者主要對(duì)血細(xì)胞計(jì)數(shù)分析(紅細(xì)胞計(jì)數(shù)、白細(xì)胞計(jì)數(shù)、血小板計(jì)數(shù)、血紅蛋白以及紅細(xì)胞壓積的國(guó)際參考方法建立的過(guò)程和及其概要進(jìn)行了闡述,并對(duì)國(guó)際參考方法與各實(shí)驗(yàn)室目前方法學(xué)的溯源性進(jìn)行了論述。在具體工作流程上,對(duì)使用人新鮮血或經(jīng)過(guò)了穩(wěn)定固化加工的血細(xì)胞確立檢驗(yàn)結(jié)果溯源性方法及其注意事項(xiàng)進(jìn)行了介紹,同時(shí)論述了室間質(zhì)控和室內(nèi)質(zhì)控的重要性。1.血細(xì)胞分析和國(guó)際血液學(xué)標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)的歷史:血細(xì)胞計(jì)數(shù)是臨床檢查中最基本最重要的項(xiàng)目,檢測(cè)內(nèi)容包括紅細(xì)胞,白細(xì)

2、胞和血小板等血細(xì)胞計(jì)數(shù)項(xiàng)目以及血紅蛋白濃度的測(cè)定。血細(xì)胞計(jì)數(shù)最初是使用顯微鏡對(duì)顯微鏡視野內(nèi)的各種細(xì)胞以人工目視的方法進(jìn)行計(jì)數(shù),但是,1953年Coulter公司的創(chuàng)始人,W1H1Cloulter成功的研制出世界第一臺(tái)自動(dòng)“流體中懸浮顆粒分析儀”之后1,2,經(jīng)過(guò)不斷的技術(shù)革新,其自動(dòng)化技術(shù)逐步應(yīng)用于血細(xì)胞分析儀中。另外,作為一種簡(jiǎn)便的檢測(cè)血液中紅細(xì)胞濃度的方法,可將全血放入試管中,經(jīng)過(guò)離心分離后測(cè)量沉淀的紅細(xì)胞體積與樣品體積的比例,即所謂的紅細(xì)胞壓積(Packed Cell Volume,PVC?，F(xiàn)在,紅細(xì)胞壓積的檢測(cè)也已經(jīng)成為自動(dòng)血細(xì)胞分析儀的檢測(cè)指標(biāo)之一。紅細(xì)胞中的血紅蛋白具有輸送氧氣功能,

3、其定量檢測(cè)最初使用試管進(jìn)行檢測(cè)的,現(xiàn)在該方法也已經(jīng)實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化,已成為自動(dòng)血細(xì)胞分析的指標(biāo)之一。這類(lèi)可實(shí)現(xiàn)血細(xì)胞分析自動(dòng)化的裝置通常被稱(chēng)之為血細(xì)胞分析儀或Hematology Analyzer,最初在歐洲和北美被迅速普及。1963年,在歐洲血液學(xué)會(huì)里斯本會(huì)議(葡萄牙上,召開(kāi)了題為“血細(xì)胞分析技術(shù)及其標(biāo)準(zhǔn)化”的研討會(huì),大家發(fā)現(xiàn),被認(rèn)為是比顯微鏡檢查準(zhǔn)確度高的各種自動(dòng)血細(xì)胞分析儀的檢測(cè)結(jié)果大相徑庭(室間差異,為了解決這個(gè)問(wèn)題,大會(huì)設(shè)立了國(guó)際血液學(xué)標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)(International Council for Standardization in Haematology。其中的血紅蛋白檢測(cè)專(zhuān)家組和血

4、液細(xì)胞分析專(zhuān)家組一直在展開(kāi)各種活動(dòng),致力于確立血紅蛋白檢測(cè)的國(guó)際參考方法和血液細(xì)胞分析的國(guó)際參考方法。2002年末,血細(xì)胞分析的基本指標(biāo)紅細(xì)胞、白細(xì)胞、血小板分析及血紅蛋白濃度以及PCV檢測(cè)的國(guó)際參考方法都已確立。2.血細(xì)胞分析(紅細(xì)胞、白細(xì)胞、血小板國(guó)際參考方法概略:紅細(xì)胞和白細(xì)胞的國(guó)際參考方法制定于1994年3。檢測(cè)系統(tǒng)中的所有血液流路部分都采用加工后多年不會(huì)變形的石英玻璃部件,定量部使用水銀壓力計(jì)。為了最大程度減少流體檢測(cè)中的誤差,設(shè)計(jì)盡可能簡(jiǎn)單,檢測(cè)原理為電阻法。根據(jù)檢驗(yàn)原理,需要對(duì)全血樣品進(jìn)行數(shù)萬(wàn)倍的稀釋,為了最大程度減少稀釋過(guò)程中的誤差,要使用A級(jí)的精密燒瓶和精密吸管。儀器對(duì)同時(shí)通

5、過(guò)檢測(cè)部位的細(xì)胞不具有修正功能,但可對(duì)一系列不同稀釋比例的標(biāo)本進(jìn)行校準(zhǔn)。利用不同濃度的標(biāo)本同時(shí)通過(guò)檢測(cè)部位的細(xì)胞數(shù)的比例不同的原理,以連續(xù)稀釋的檢測(cè)結(jié)果計(jì)算出無(wú)限稀釋倍率濃度時(shí)的檢測(cè)結(jié)果(在該濃度下,可認(rèn)為沒(méi)有細(xì)胞同時(shí)通過(guò)檢測(cè)部,并將該結(jié)果確定為所測(cè)標(biāo)本的“真值”。血小板的國(guó)際參考方法于2001年4確定。在此之前曾對(duì)各種方法經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期的討論,由于各種方法各有優(yōu)劣都沒(méi)有得到通過(guò),新的參考方法是采用流式細(xì)胞術(shù)以單克隆抗體(CD41和CD61對(duì)全血進(jìn)行識(shí)別,得到紅細(xì)胞總數(shù)和血小板總數(shù)的比率。再根據(jù)血小板和紅細(xì)胞的比率,乘以紅細(xì)胞參考方法所檢測(cè)得到的紅細(xì)胞真值來(lái)間接計(jì)算出血小板的真值。3.血紅蛋白的定量

6、和PCV國(guó)際參考方法簡(jiǎn)介:血紅蛋白的定量是血細(xì)胞分析項(xiàng)目之中最早確立國(guó)際參考方法的指標(biāo),隨后又進(jìn)行過(guò)多次改定5。檢測(cè)時(shí)使用商品化的分光光度計(jì),采用氰化高鐵血紅蛋白法進(jìn)行檢測(cè)。檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確度除了取決于分光光度計(jì)的質(zhì)量,還有賴(lài)于檢測(cè)所用的石英比色杯的精度,標(biāo)本的稀釋精度,以及是否根據(jù)參考方法中的規(guī)定對(duì)試劑進(jìn)行調(diào)整,是否按照規(guī)定使用清潔的過(guò)濾網(wǎng)對(duì)標(biāo)本進(jìn)行測(cè)試前的過(guò)濾等。在過(guò)去,實(shí)驗(yàn)室中一直以精密毛細(xì)管法作為PCV的參考方法6,但是由于精密毛細(xì)管的一端需要封入黏土(seal,而且精密毛細(xì)管中血液各組分的交界部分不清晰或不均一,造成紅細(xì)胞的沉積部分越到下方越容易因?yàn)閴嚎s過(guò)度而脫水變形,越往上越容易混入

7、白細(xì)胞,血小板或血漿(trapped plasma,所以,人們一直在探討可以代替精密毛細(xì)管法的新方法,2001年新的參考方法確立了7。該法同精密毛細(xì)管法相比,從開(kāi)始操作開(kāi)始到往精密毛細(xì)管內(nèi)吸入紅細(xì)胞的步驟是相同的,但是計(jì)算時(shí)卻慎重地避開(kāi)了精密毛細(xì)管的上部和下部?jī)H取中央部分,通過(guò)國(guó)際參考方法測(cè)定該部位的血紅蛋白濃度。其結(jié)果與國(guó)際參考方法測(cè)得的全血的血紅蛋白濃度的比率為PCV。只是這種測(cè)定方法在檢驗(yàn)室里實(shí)際操作中還有很多困難,所以,目前正在討論更具有可行性的適用于檢驗(yàn)室的參考方法。41血細(xì)胞分析結(jié)果的溯源性:如上所述,由于確立了血細(xì)胞分析儀的基本檢測(cè)指標(biāo)紅細(xì)胞,白細(xì)胞,血小板,血紅蛋白,PCV 的

8、國(guó)際參考方法,一般醫(yī)療機(jī)構(gòu)血細(xì)胞分析儀的檢測(cè)結(jié)果在理論上可以溯源至國(guó)際參考方法(圖1。 圖1確保多實(shí)驗(yàn)室結(jié)果可溯源性的流程圖 具體的操作流程是,首先使用國(guó)際參考方法對(duì)加入抗凝劑EDTA2K 的正常人新鮮血液進(jìn)行檢測(cè),其結(jié)果作為該標(biāo)本的各指標(biāo)的真值。然后使用要校準(zhǔn)的血細(xì)胞分析儀(下稱(chēng)檢測(cè)系統(tǒng),對(duì)同一標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè),并對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行修正使其與國(guó)際參考方法的檢測(cè)結(jié)果相同。此時(shí),該檢測(cè)系統(tǒng)(B 與國(guó)際參考方法具有可溯源性,即A =B 。但是,如果將某一區(qū)域內(nèi)所有相同的檢測(cè)系統(tǒng)(C 都使用上述的同一份新鮮健康人血液進(jìn)行檢測(cè),并把檢測(cè)結(jié)果修正到與國(guó)際參考方法一致,實(shí)際操作中會(huì)存在許多困難。為了解決這一問(wèn)題,

9、可用已溯源到國(guó)際參考方法的檢測(cè)系統(tǒng)(B 檢測(cè)可以長(zhǎng)期保存的固定后的血液,然后再用其他相同的檢測(cè)系統(tǒng)(C 檢測(cè)該樣品,并把所得結(jié)果修正到與(B 相同,此時(shí),市場(chǎng)上相同的檢測(cè)系統(tǒng)便可以同與國(guó)際參考方法可溯源的儀器進(jìn)行間接溯源,即B =C 。A =B ,B =C ,所以A =C ,從而使市場(chǎng)上的檢測(cè)系統(tǒng)都可以與國(guó)際參考方法進(jìn)行溯源。用C 在對(duì)其他檢測(cè)系統(tǒng)D 進(jìn)行溯源性校準(zhǔn)時(shí),可以假定C 為A ,如果兩者之間使用新鮮健康人血液具有互換性的話(huà),再用固化后的血液進(jìn)行調(diào)整使C =D ,那么,A =B ,B =C ,C =D ,則A =D ,即D 也與國(guó)際參考方法具有可溯源性。進(jìn)而再繼續(xù)構(gòu)筑一系列這樣的流程,

10、就可以推進(jìn)各國(guó)、各地域的標(biāo)準(zhǔn)化,最終實(shí)現(xiàn)各單位間檢測(cè)結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)化。51標(biāo)準(zhǔn)化的目的及目前所存在的問(wèn)題:按照上述方法,理論上可使所有的血細(xì)胞分析儀實(shí)現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)化,實(shí)現(xiàn)所有患者的檢測(cè)結(jié)果達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)化這一目標(biāo)。但為實(shí)現(xiàn)這一目標(biāo)需要有一個(gè)前提條件,就是所有的血細(xì)胞分析儀均使用上述方法與國(guó)際參考方法進(jìn)行溯源。而目前的現(xiàn)狀是,由于各廠(chǎng)家生產(chǎn)的血球分析儀采用的檢測(cè)原理和試劑的性質(zhì)不同,造成結(jié)果的潛在差異8,9。尤其對(duì)于一些特殊標(biāo)本,在不同的檢測(cè)系統(tǒng)中得到的數(shù)值有時(shí)會(huì)與真正的數(shù)值出現(xiàn)差異。為此,檢測(cè)分析儀的生產(chǎn)廠(chǎng)家和經(jīng)銷(xiāo)商有責(zé)任向用戶(hù)長(zhǎng)期穩(wěn)定地提供該檢測(cè)系統(tǒng)的特殊標(biāo)本檢測(cè)結(jié)果及各種相關(guān)信息。而且為了能夠長(zhǎng)期地保持這

11、種可溯源性,需要客觀(guān)上保證該溯源體系中的所有檢測(cè)系統(tǒng)每年、每日、每時(shí)處于穩(wěn)定狀態(tài)。為此,各檢測(cè)系統(tǒng)一旦進(jìn)入溯源體系就都有必要積極地進(jìn)行室內(nèi)質(zhì)控和室間質(zhì)控。目前,中國(guó)衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心和各省的臨床檢驗(yàn)中心正在共同努力構(gòu)筑上述的溯源體系,筆者雖然力微,但也愿意為該事業(yè)貢獻(xiàn)自己的一份力量,每當(dāng)看到中國(guó)檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)專(zhuān)家和有關(guān)人士對(duì)這項(xiàng)事業(yè)的高漲熱情,極大地使命感引起我的思考,總能使我想起中國(guó)唐詩(shī)選第一首,魏徵的名詩(shī)述懷中的一節(jié)“人生感意氣,巧名誰(shuí)復(fù)論”的詩(shī)句。讓我們共同努力促進(jìn)溯源體系的構(gòu)筑和完善。參考文獻(xiàn)1Coulter WH.United states patent ,1953,20:26526508

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