誤配修復(fù)與化療抵抗

1、    誤配修復(fù)與化療抵抗        關(guān)鍵詞誤配修復(fù)；化療抵抗中分類號R394.2文獻標識碼A文章編號1001-7399(2000)04-0326-03細胞能精確地將自己的遺傳信息傳遞給子代，其中必有信息傳遞保真度維持系統(tǒng)；其二，不斷發(fā)現(xiàn)腫瘤組織中較正常組織明顯為高的遺傳信息失真，表明在遺傳信息傳遞過程中，保真度維持系統(tǒng)在腫瘤組織是不健全的?；谝陨蟽牲c指導(dǎo)思想，在人類遺傳性非息肉病性結(jié)直腸癌（hereditary non-polyposis colorectal can

2、cer，HNPCC）研究中，人們發(fā)現(xiàn)了E.Coli MutS、MutL的同源物，而正是該同源物組成的誤配修復(fù)系統(tǒng)（mismatch repair，MMR）在遺傳信息的傳遞過程中與細胞其他機制一起起“DNA損傷檢測器”的作用，及時修復(fù)DNA損傷。而在對MMR系統(tǒng)的深入研究中尚發(fā)現(xiàn)，該系統(tǒng)還參與細胞周期調(diào)控、細胞凋亡、男女性不育不孕、腫瘤化療抵抗，甚至在染色體水平也起作用，參與染色體有絲分裂聯(lián)會與互換過程。本文著重對MMR系統(tǒng)與腫瘤化療抵抗的研究狀況作一綜述。1誤配修復(fù)系統(tǒng)（MMR）1.1MMR系統(tǒng)的組成因為某些基因的缺陷，使細菌的基因組突變率明顯升高，所以，這些基因最早被命名為mut基因，即產(chǎn)生

3、突變子（mutator）的基因之意。首先在E.Coli中發(fā)現(xiàn)4個mut基因：MutS、MutL、MutH、MutU,被稱為MutHLS系統(tǒng)。在酵母菌，不久也發(fā)現(xiàn)了6個MutS、MutL同源物：MSH1-6。在人類，至今已發(fā)現(xiàn)6個同源物，其中MutS與MutL同源物各3個，它們的染色體定位，相對分子質(zhì)量如表11。表1MutS和MutL同源物細菌MMR人類的同源物染色體定位相對分子質(zhì)量* (×103)MutShMSH22p22-21105hMSH3（DUP1/MRP1）5q11-13127hMSH6(GTBP/p160)2p16-15153MutLhMLH13p23-2185hPMS12

4、q31-33106hPMS27p2296*不同文獻報道略有出入1.2人類MMR功能在HNPCC最早發(fā)現(xiàn)MMR系統(tǒng)之后，人們紛紛著手該系統(tǒng)功能的探索，隨著對MMR系統(tǒng)功能認識的不斷深入，其中一些成分的具體作用已部分明確。1997年，Crul等2提出的誤配修復(fù)作用模式如1所示。1人類誤配修復(fù)模型DNA上的損傷被MSH2和GTBP或者一種未知蛋白識別，然后MLH1、PMS2結(jié)合上去，接著，DNA雙鏈被解開，最終在RPA的輔助下由DNA聚合酶修復(fù)損傷誤配修復(fù)蛋白能識別復(fù)制后DNA鏈上誤配的核苷酸，然后將它校正的作用已被許多人接受，目前爭論的焦點是不同的MMR組分在該過程中的具體作用。在發(fā)揮誤配識別功能

5、的 hMutS（hMSH2-hMSH6復(fù)合體）與hMutS（hMSH2-hMSH3復(fù)合體）兩者之間在識別的損傷特異性差異上爭議較大。對識別后進一步發(fā)生的效應(yīng)認識也不是很一致。不同實驗的結(jié)果對hMutS與hMutS的識別損傷特異性，尤其是對損傷核苷酸個數(shù)存在不同的認識， 但似乎有一點較為一致， 即單核苷酸誤配主要由hMutS識別修復(fù)；單核苷酸的IDL誤配由hMutS或(和)hMutS完成；較大片段的IDL誤配主要由hMutS識別修復(fù)，偶爾hMutS也參與這一作用。這一作用在酵母菌內(nèi)也得到證實。除此以外，Marra等4在CHOR和HL60R兩種細胞系的研究還發(fā)現(xiàn)，hMSH3與hMSH6兩種蛋白的比

6、例失衡同樣會引起誤配修復(fù)功能的不完整。即MSH3與MSH6競爭性與MSH2結(jié)合，實驗還發(fā)現(xiàn)MSH3的輕微改變會引起MutS與MutS濃度的很大波動，而MSH6的改變則影響相對較小。總之，MSH3與MSH6比例的過大或過小均會使細胞總的誤配修復(fù)功能下降。在MMR中，hMSH2與hMLH1的作用必不可少。而有關(guān)hPMS1、hPMS2的作用目前已在研究之中，后者被認為較前者重要。這也可以從它們在HNPCC中的突變率得到說明5，6：hMSH2 45%60，hMLH1 30%49，hPMS1與hPMS2各占5%6。然而，有人在研究小鼠免疫球蛋白多樣性機制時發(fā)現(xiàn)，細胞的某些糾錯修復(fù)系統(tǒng)的作用是導(dǎo)致基因突變

7、的出現(xiàn)而不是減少錯誤7。Cascalho等提出，即MMR會不會將新合成的鏈“錯誤”地作為模板來校正與之不配對的老鏈呢？如果是這樣，那么復(fù)制產(chǎn)生的突變最終不是被修復(fù)，而是被固定下來，并傳給后代。對于誤配修復(fù)的單鏈識別問題，目前尚無定論。以上是復(fù)制中產(chǎn)生誤配的修復(fù)，由非復(fù)制時的自發(fā)突變（如C脫氨基轉(zhuǎn)變?yōu)閁，或進一步甲基化為T，而產(chǎn)生GU或GT誤配，這在真核細胞DNA上的CpG序列上多見）或化學物質(zhì)作用下產(chǎn)生的誤配，除“長補丁修復(fù)”和“短補丁修復(fù)”可以修復(fù)外，TDG(thymine DNA glycosylase)類糖基化酶也能進行修復(fù)，并且在真核細胞內(nèi)效率較高。這類酶包括：TDG、UDG（urac

8、il DNA glycosylase）和次黃嘌呤DNA糖基化酶等，它們能特異識別誤配的堿基并且切除之，產(chǎn)生一個AP位點（ apurine or apyramide site）, 繼而由AP內(nèi)切酶HAP1（human apurinic endonuclease1,HAP1）與其他酶一起將缺少嘌呤或嘧啶的核苷酸從骨架上切除，最后由pol等酶修復(fù)缺口，該途徑不涉及單鏈的識別問題。有關(guān)MMR系統(tǒng)在細胞周期調(diào)控及細胞凋亡，染色體聯(lián)會互換中也起一定的作用，但目前認識還處于初始階段。2誤配修復(fù)（MMR）與腫瘤化療抵抗的關(guān)系凡是以腫瘤細胞DNA為化療藥物作用靶點的化療過程，應(yīng)該說其作用效果跟MMR系統(tǒng)的狀態(tài)密

9、切相關(guān)。這些藥物包括：DNA烷化劑類，如馬利蘭、N-甲基-N?-硝基-N-亞硝基胍（ MNNG）、N-甲基-N-亞硝基脲（MNU)、甲基芐肼、Temozolomide (甲基芐肼的活化形式)、卡氮芥（BCNU）等；抗代謝類藥物，如6-硫鳥嘌呤(6-TG)、6-巰基嘌呤(6-MG)等；鉑類化合物，如順鉑、卡鉑等；拓撲異構(gòu)酶II抑制劑，如阿霉素等。所有這些藥物都是直接或間接地以DNA為作用靶點，引起DNA的損傷，最終產(chǎn)生殺滅腫瘤細胞的效果。在烷化劑與DNA作用中形成加合物，其中的O6-甲基鳥嘌呤對細胞毒性最大。當O6-甲基鳥嘌呤形成后，在DNA復(fù)制時，子鏈以T與O6-mG相配對，形成O6-mGT，

10、該誤配被MMR識別蛋白hMutS或hMutS識別，在其他成分的參與下將子鏈上包含該誤配的若干核苷酸切除，產(chǎn)生一個缺口。但由于母鏈上的O6-mG依然存在，故在修復(fù)時，與之配對的仍然是T而不是C，結(jié)合上去的T再次被識別、切除，這樣，反復(fù)識別、切除，但由于某種原因而不能將這種損傷完全修復(fù)，使得細胞DNA雙鏈斷裂的危險升高，最終引起細胞凋亡，即表現(xiàn)為對該烷化劑治療的敏感，一旦細胞MMR缺陷，則細胞無法在MMR作用下產(chǎn)生凋亡，表現(xiàn)出耐藥性，這種可能的機制暫被稱為“識別、切除、但修復(fù)不能”假說。在MNNG、MNU、Temozolomide、甲基芐肼、馬利蘭情況可能都是這樣，但并非所有烷化劑。上述機制只是一

11、種推測，尚有待進一步研究證明8，9。MMR缺陷使細胞對烷化劑產(chǎn)生抵抗，而用相應(yīng)的正常MMR基因能糾正缺陷細胞對烷化劑的敏感性。Fink等1的實驗證明，MMR缺陷的大部分細胞對特定的化療藥物的敏感性降低。Boyer等3從22個不同組織來源的腫瘤細胞系中檢測出10個MMR缺陷的細胞系（包括HCT116、SW48等），這10個細胞系均表現(xiàn)為MIN，并對MNNG抵抗。能被有相應(yīng)正常MMR基因的染色體糾正，MIN消失，并恢復(fù)對MNNG的敏感性。Branch等發(fā)現(xiàn)，有hMSH6缺陷的DLD-1人類結(jié)腸癌細胞系，對MNU敏感性下降。在抗代謝類藥物，如6-TG等化療抵抗中，6-TG進入細胞后首先轉(zhuǎn)化成2?-脫

12、氧-6-硫鳥苷酸，摻入到DNA中去，然后在S-腺苷蛋氨酸作用下甲基化，生成S6-甲基硫鳥嘌呤。后者在復(fù)制時在新鏈中由C或T與之配對，無論哪一個與之配對均能被MMR識別。余下的作用機制被認為跟烷化劑相似。最近也有實驗結(jié)果表明，摻入到DNA鏈的6-TG即能被MMR識別，然后產(chǎn)生凋亡。一旦MMR系統(tǒng)功能缺陷，那么，細胞將對抗代謝類藥物表現(xiàn)為抵抗9，10，并可用野生型的相應(yīng)基因逆轉(zhuǎn)。而對于鉑類化合物，如順鉑、卡鉑等，在對多種腫瘤的化療中曾經(jīng)有良好的療效，如卵巢癌、頭頸部癌、非小細胞肺癌等。鉑類藥物進入體內(nèi)后，被腫瘤細胞攝取，并與核內(nèi)的DNA形成多種形式的加合物：(a)單獨與G結(jié)合；(b)形成雙鏈間G-

13、順鉑-G交聯(lián)；（c）1,2-(GpG)單鏈內(nèi)交聯(lián)；(d)1,3-d(GpNpG)單鏈內(nèi)交聯(lián)(N為A、T、G、C中任一種)；(e)1,2-d(ApG)單鏈內(nèi)交聯(lián)等。對于鉑類與DNA形成的不同加合物，目前認為起主要修復(fù)作用的是NER系統(tǒng)（nucleoside excision repair,NER），但MMR系統(tǒng)也在其中起一定的作用。有關(guān)MMR系統(tǒng)可能是細胞對順鉑敏感性的決定因素的現(xiàn)象最早是在大腸桿菌中觀察到的，隨后在真核細胞也發(fā)現(xiàn)類似情況。Anthoney等11發(fā)現(xiàn)用順鉑治療人類卵巢癌細胞系會出現(xiàn)hMutL(hMLH1-hPMS2)成分hMLH1蛋白的缺陷，進而使細胞系對順鉑耐藥。隨后有人在hM

14、LH1缺陷的HCT116細胞系和hMSH2缺陷的HEC59細胞系觀察到對順鉑化療欠敏感，對卡鉑化療抵抗，在2008/A等細胞系也得到同樣的結(jié)果。還發(fā)現(xiàn)細胞對反鉑（transplatin）和乙二?；K（oxaliplatin）反應(yīng)性不受MMR狀態(tài)的影響，這表明細胞MMR系統(tǒng)對不同DNA加合物反應(yīng)性是不一樣的。對于MMR系統(tǒng)是如何參與順鉑化療抵抗問題，目前還沒有明確結(jié)論，但已有不同的假說來解釋。首先就是烷化劑化療耐藥中的“識別、剪切、但修復(fù)不能”假說；再有就是“保護機制”假說，即當產(chǎn)生DNA-順鉑加合物時，MMR成分識別了該加合物，并結(jié)合上去，這種結(jié)合起到了屏障作用，使損傷DNA無法經(jīng)細胞MMR外

15、的修復(fù)系統(tǒng)修復(fù)，結(jié)果使細胞產(chǎn)生凋亡。當MMR缺陷時，MMR喪失了對DNA上的損傷的屏障作用，損傷被修復(fù)，細胞產(chǎn)生了耐藥性。目前這還是一種推測，尚有待進一步實驗的證明。還有可能的就是細胞周期機制。在離體實驗中發(fā)現(xiàn)，對順鉑治療抵抗的細胞出現(xiàn)大量的G2期阻滯，而敏感的細胞則沒有13。Brown等14發(fā)現(xiàn)，hMLH1缺陷的細胞在化療藥物或放療下無法阻滯在G2期。因此，有人提出p53是細胞周期G1/S期的調(diào)控因子，而MMR系統(tǒng)是細胞內(nèi)G2/M周期轉(zhuǎn)折的調(diào)控因子。它可能是經(jīng)Wee1基因產(chǎn)物，使CDK1蛋白的Thr14、Thr15位磷酸化，從而使CDK1-CyclinB復(fù)合體失活，從而使細胞阻滯在G2期。I

16、keda等15在對結(jié)直腸癌研究時發(fā)現(xiàn)hMSH3的突變常會引起轉(zhuǎn)錄因子E2F的突變，這為兩者間的相互關(guān)系提供了更為直接的證據(jù)。其實，不僅是順鉑,MNNG和6-TG也能引起細胞G2期阻滯。Branch的實驗證明，hMLH1在6-TG引起的G2/M期阻滯中起重要作用。而G2期阻滯跟細胞化療抵抗又是怎樣的相互作用關(guān)系，目前尚不清楚?？傊?，依目前認識，MMR系統(tǒng)不僅參與染色體水平的調(diào)控，還在基因水平產(chǎn)生效應(yīng)；不僅在保證細胞存活、健康增殖和分化上起作用，還在誘導(dǎo)細胞凋亡中產(chǎn)生一定影響，由此，單從寬廣的作用時空上就顯示了該系統(tǒng)在分子生物學研究中的地位。而作為目前在腫瘤化療中碰到的最棘手問題化療耐藥，探討這兩

17、者之間的關(guān)系有著特殊重要的意義。作者簡介：陳修煦，男，24歲，在讀博士來茂德，男，39歲，教授，博士生導(dǎo)師陳修煦（浙江大學醫(yī)學院病理學教研室，杭州310031）來茂德（浙江大學醫(yī)學院病理學教研室，杭州310031）參考文獻1，F(xiàn)ink D, Aebi S, Howel SB et al.The role of DNA mismatch repair in drug resistance. Clin Cancer Res,1998；4:162，Crul M, Schellens JHM, Beijnen JH et al.Cisplatin resistance and DNA repair.C

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