纖維素酶及其在生產(chǎn)燃料酒精中的應(yīng)用

1、纖維素酶及其在生產(chǎn)燃料酒精中的應(yīng)用摘 要:植物利用二氧化碳，通過光合作用產(chǎn)生的木質(zhì)纖維是地球上最豐富、最廉價而又可再生的資源。木質(zhì)纖維主要成分是纖維素和半纖維素，纖維素和半纖維素的利用一直是研究熱點課題。而纖維素酶能有效地將農(nóng)作物秸桿等富含纖維素的物質(zhì)水解為葡萄糖，最終經(jīng)過發(fā)酵產(chǎn)生生物酒精。因此，尋找高效低價的纖維素酶，然后利用它來生產(chǎn)酒精，這對于解決人類文明發(fā)展的能源與環(huán)境問題具有化時代的意義，具有廣闊的發(fā)展前景。關(guān)鍵詞: 微生物;纖維素酶;燃料酒精；發(fā)展前景Celluase and its using on the Production of BioethanolAbstract:Lign

2、ocelluloses are the most abundant and cheapest sources of carbohydrate,continually replen-ished by photosynthetic reduction of carbon dioxide with sunlight energy, its composed by cellulose and hemicellulose. To date, how to make use of this resource is the hot topic for research.Cellulase enzymes c

3、an effectively hydrolyze cellulose to glucose in maize straw, which can produce ethanol for the energy after fermentation.Therefore, the search for efficient and low-cost cellulase,and then use it to produce alcohol,which has great significance and a broad development prospects in solving energy and

4、 environmental issues during the development of human civilization.Key words:microbe;cellulose,bioethanol; development prospect能源與環(huán)境問題制約著人類文明的發(fā)展。近幾年來，可持續(xù)再生的生物能源研究與應(yīng)用取得了巨大的進展，其中生物酒精成為一種可替代石油、廉價環(huán)保的能源。目前生物酒精主要是采用淀粉為原料生產(chǎn)的，成本價是汽油的兩倍。為此，利用纖維素酶以富含纖維素的生物廢料為原料生產(chǎn)酒精的生產(chǎn)技術(shù)已經(jīng)成為研究的熱點，全世界已有幾十套中試生產(chǎn)線或試生產(chǎn)線。其中，生產(chǎn)上的主要障礙

5、是酶解成本過高，占總生產(chǎn)成本的40%55%，只有在酶的成本降低至1/10，投資成本降低30%，利用纖維素酶生產(chǎn)出來的酒精才能與石油相競爭。因此，生產(chǎn)高效低價的纖維素酶對于其在生產(chǎn)酒精工業(yè)上的運用具有重要意義。1 纖維素酶的組成、結(jié)構(gòu)及作用機制1.1纖維素酶的組成1.2纖維素酶的結(jié)構(gòu)纖維素酶分子普遍具有類似的結(jié)構(gòu),由球狀纖維素催化結(jié)構(gòu)、纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域和連接橋3部分組成2。纖維素酶中最大的功能區(qū)是催化區(qū)，它體現(xiàn)酶的催化活性及對特定水溶性底物的特異性。不同來源的纖維素酶分子大小差別很大，但它們的催化區(qū)的大小卻基本一致。纖維素酶的結(jié)合結(jié)構(gòu)域主要維持酶分子的構(gòu)象穩(wěn)定性，調(diào)節(jié)酶對可溶性和非可溶性底物的結(jié)

6、 合專一性；連接橋可保持球狀纖維素催化結(jié)構(gòu)和纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域之間的距離,有助于不同酶分子間形成較為穩(wěn)定的聚集體。1.3纖維素酶的作用機制一般地，外切酶作用于不溶性纖維表面，使形成結(jié)晶結(jié)構(gòu)的纖維素長分子鏈開裂，長鏈分子末端部分發(fā)生游離易于水化；內(nèi)切酶則作用于經(jīng)外切酶活化的纖維素，分其-1,4鍵，產(chǎn)生纖維二糖、三糖等短鏈低聚糖；而-葡萄糖苷酶再將纖維二糖、三糖等分解成葡萄糖，完成協(xié)同反應(yīng)全過程2。當(dāng)然協(xié)同作用順序不是絕對的，各酶的功能也不是這樣簡單、固定的。2 纖維素酶的來源及微生物產(chǎn)生纖維素酶的特點2.1 纖維素酶的來源纖維素酶的來源非常廣泛，原生動物、軟體動物、昆蟲和植物的一些組織等能產(chǎn)生纖維

7、素酶，絲狀真菌、細菌和放線菌等在一定條件下也能產(chǎn)生纖維素酶。微生物以外的生物生產(chǎn)纖維素酶缺乏大規(guī)模應(yīng)用的實際意義，因此在工業(yè)生產(chǎn)中都利用微生物來進行該酶的生產(chǎn)。2.2 微生物產(chǎn)生纖維素酶的特點細菌生產(chǎn)的纖維素酶的活力較低，并多數(shù)不能分泌到細胞外。在細菌中，目前對生產(chǎn)高溫纖維素酶的耐熱梭狀芽胞桿菌和作為基因工程菌的大腸桿菌產(chǎn)生纖維素酶研究較多。絲狀真菌具有產(chǎn)酶的諸多優(yōu)點:產(chǎn)生的纖維素酶為胞外酶，便于酶的分離和純化；產(chǎn)酶效率高，且產(chǎn)生的纖維素酶酶系結(jié)構(gòu)較為合理，酶之間有強烈的協(xié)同作用；同時可產(chǎn)生許多半纖維素酶、果膠酶、淀粉酶等。從纖維素酶的工業(yè)化制備及其應(yīng)用的角度，研究和采用絲狀真菌產(chǎn)酶具有更大的

8、意義。絲狀真菌中，酶活力較強的菌種為木霉、曲霉、根霉和青霉等。從目前的研究進展來看，由于里氏木霉 Rut C30和 QM 9414 同時具有較為穩(wěn)定的性狀、優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)纖維素酶的能力和較好的“抗代謝阻遏”能力，因此，它們被認為是最具有工業(yè)應(yīng)用價值的菌株6。3 纖維素酶的生產(chǎn)工藝3.1 發(fā)酵制備纖維素酶纖維素酶是誘導(dǎo)酶，發(fā)酵過程中纖維素酶的大量合成必須有誘導(dǎo)物的作用。纖維素、纖維低聚糖及其他結(jié)構(gòu)類似物均可作為纖維素酶的誘導(dǎo)物。因此，用于纖維素酶發(fā)酵制備的培養(yǎng)基，首先必須加入這些物質(zhì)。為降低成本，簡化誘導(dǎo)物的制備工藝，通常采用富含這些物質(zhì)的原料(包括植物纖維原料、各種酒糟、乳糖、淀粉水解糖等)作碳源，

9、使產(chǎn)酶過程中充當(dāng)碳源的物質(zhì)同時起著誘導(dǎo)物的作用。除碳源外，還要加入適當(dāng)?shù)牡?，同時注意碳氮比的合理搭配，因為低碳氮比將導(dǎo)致培養(yǎng)初期菌體的過快生長和對碳源消耗過快，高碳氮比將由于氮源不足而出現(xiàn)菌生長繁殖太慢。纖維素酶的生產(chǎn)可采用固態(tài)發(fā)酵或液體深層發(fā)酵兩種工藝。固態(tài)發(fā)酵法具有投資少、工藝簡單、價格低廉等優(yōu)點，然而固體發(fā)酵法存在很大的缺陷，以秸稈為原料的固體發(fā)酵法生產(chǎn)的纖維素酶很難提取、精制，而且此法所產(chǎn)生的酶制劑外觀粗糙且質(zhì)量不穩(wěn)定，生產(chǎn)效率較低，易污染雜菌，不適于大規(guī)模生產(chǎn)。液體發(fā)酵生產(chǎn)時，將原料送入發(fā)酵罐內(nèi)發(fā)酵，同時接入纖維素酶菌種。發(fā)酵過程中，需要從發(fā)酵罐底部通入無菌空氣對物料進行氣流攪拌，

10、發(fā)酵完后的物料經(jīng)過處理可得到纖維素酶產(chǎn)品。液體發(fā)酵雖有發(fā)酵動力消耗大、設(shè)備要求高等缺點，但液體發(fā)酵對原料的利用率高、生產(chǎn)條件易于控制、產(chǎn)量高、工人勞動強度小、產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定，可大規(guī)模生產(chǎn)。因此，目前此方法是大規(guī)模生產(chǎn)的可行方法。其生產(chǎn)流程圖5如圖1所示：圖1 典型液體深層發(fā)酵纖維素酶生產(chǎn)工藝流程圖3.2 纖維素酶的分離純化粗纖維素酶液的提純可采用蛋白質(zhì)提純的常用技術(shù)，包括熱失活分離提純法、分級沉淀法、層析法、離子交換法和超濾法等。工業(yè)上用于生產(chǎn)纖維素酶的粗酶制劑常采用硫酸按鹽析法、酒精沉淀法、丹寧沉淀法和離心噴霧干燥法等方法。4 利用纖維素酶生產(chǎn)燃料酒精加入纖維素酶，利用纖維素原料生產(chǎn)燃料酒精，

11、能解決能源危機、環(huán)境污染和資源浪費問題。工業(yè)上利用纖維素原料生產(chǎn)酒精的工藝流程如下：酸或酶 酵母 纖維素原料預(yù)處理水解糖化酒精發(fā)酵酒精4.1 纖維素原料的預(yù)處理方法在進行酶解前對木質(zhì)纖維素進行預(yù)處理，可以破壞其結(jié)晶結(jié)構(gòu)，提高酶的結(jié)合性和催化水解率。目前，物理方法預(yù)處理已研究的有機械粉碎、高壓熱水預(yù)處理、蒸汽爆碎處理、微波照射和輻射處理等。傳統(tǒng)的物理處理等方法不僅耗能較多，而且不同程度的存在環(huán)境污染，難以在大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)中應(yīng)用。而常用的化學(xué)預(yù)處理方法有酸法預(yù)處理和堿法預(yù)處理等。4.2 水解糖化過程及發(fā)酵產(chǎn)生酒精在水解糖化過程中，可以用酸或者纖維素酶進行，但是酸水解過程要求容器是防腐蝕、耐酸、耐

12、壓的，容器體積也較大。另外，酸水解常會伴隨生成有毒產(chǎn)物乳糖醛、酚類等物質(zhì)，需要改善工藝，減少這些物質(zhì)的產(chǎn)生。酶水解產(chǎn)率高，而且副產(chǎn)物很少，對于進一步的乙醇發(fā)酵減輕了提純的工作量，具有更好的應(yīng)用價值。加入纖維素酶后，纖維素首先被纖維素酶Cl和Cx分解為纖維二糖，然后由-葡糖苷酶將纖維二糖分解為葡萄糖，葡萄糖由酵母發(fā)酵生成乙醇，反應(yīng)式如下:C1-Cx -葡萄糖苷酶 酵母 纖維素纖維二糖葡萄糖酒精葡萄糖對-葡糖苷酶有阻礙作用，纖維二糖對C1-Cx有阻礙作用，隨著發(fā)酵的進行，葡萄糖不斷為酵母所利用，這些阻礙作用就會逐漸降低，纖維素在纖維素酶作用下不斷生成葡萄糖，為酵母作用生成酒精。但是，纖維素的酶解需

13、要大量的纖維素酶，而且酶的成本很高。因此工業(yè)化利用纖維素酶生產(chǎn)酒精還需要尋求廉價多產(chǎn)的酶源。5 纖維素酶研究的技術(shù)進展5.1產(chǎn)酶菌株的選育及誘變育種利用物理、化學(xué)誘變劑單獨或復(fù)合處理微生物細胞或孢子是選育高產(chǎn)突變種行之有效的方法，至今仍是育種的有效方法之一。崔福綿等從生霉棉布上分離出的康氏術(shù)霉CP88105經(jīng)加熱和亞硝基胍處理后，獲得一株高產(chǎn)突變株CP88329。在固體培養(yǎng)基上28培養(yǎng)72h，所產(chǎn)纖維素酶復(fù)合物具有高的酶活力，產(chǎn)酶活力水平均為出發(fā)菌株的3倍。在用纖維素類原料發(fā)酵酒精方面，韓如等利用纖維素粘附厭氧滾管的方法得到了直接轉(zhuǎn)化纖維素產(chǎn)乙醇的菌株Clostridium sp.EVA4，用

14、1%纖維素濾紙培養(yǎng)120h后，該菌株產(chǎn)乙醇濃度為1123mg/L，纖維素降解率為59%。5.2重組DNA技術(shù)用基因工程技術(shù)構(gòu)建含纖維素酶基因的克隆菌株，表達具有較高酶活力的纖維素酶。如Kondo等將帶有葡萄糖糖化酶基因的表達質(zhì)粒pGA11導(dǎo)入酵母菌宿主YF207中，得到的菌株YF207/pGA11可在超過300h的條件下連續(xù)高產(chǎn)酒精且濃度達150g/L；能快速有效利用纖維二糖高產(chǎn)酒精的重組菌(Klebsiella oxytocaP2)，在利用10%葡萄糖和10%纖維二糖發(fā)酵產(chǎn)乙醇時，乙醇得率達到理論得率的96%以上；通過基因工程手段將相應(yīng)的水解酶基因轉(zhuǎn)移到Z.mobilis中，使得該菌株能夠利

15、用木糖、甘露糖、乳糖甚至淀粉、纖維素等多種碳源；早在1986年，Pina，Calderon通過原生質(zhì)體融合法，將發(fā)酵結(jié)合酵母菌株與釀酒酵母進行屬間融合，前者有可利用纖維質(zhì)物質(zhì)，耐高溫的特性，融合子具有雙親特性，可利用乳酸與纖維質(zhì)原料做碳源制酒，性能穩(wěn)定。在生產(chǎn)酒精行業(yè)中，還必須培育出耐高糖、高滲而又有較高發(fā)酵能力的酵母用于生產(chǎn)。6.利用纖維素酶生產(chǎn)酒精的發(fā)展前景6.1進一步選育高產(chǎn)復(fù)合酶系菌株由于纖維素酶是復(fù)合酶系，目前發(fā)現(xiàn)主要以上述3種成分為主，但是實際應(yīng)用中對纖維素的分解仍然不徹底，尤其是對天然纖維素原料。再則由于自然界中的菌株產(chǎn)酶性能不高、各菌株酶組分活性各異、且存在某種特定組分酶活性較

16、低的缺陷。所以目前資料中報道的所 選育出來的菌種應(yīng)用于生產(chǎn)還不是很理想。有待進一步篩選出產(chǎn)酶更高、更全面的菌株。通過把握不同菌種采用不同誘變光的強度、照射時間等處理條件，發(fā)現(xiàn)更好的、更理想的方法來實現(xiàn)提高菌株產(chǎn)酶。6.2纖維素酶分子水平研究得到突破基因工程技術(shù)已用來克隆、表達具有較高酶活的纖維素酶。由于纖維素水解需要多種酶成分的協(xié)同作用，而目前基因工程纖維素酶功能單薄，不足以徹底降解纖維素。因此，以后的基因工程纖維素酶既要克服木質(zhì)素、木聚糖的障礙，又能克服反饋抑制作用。利用釀酒酵母具有把葡萄糖轉(zhuǎn)化為酒精的能力，將3類主要纖維素酶基因?qū)脶劸平湍?，實現(xiàn)纖維素直接轉(zhuǎn)化生產(chǎn)酒精，還可生產(chǎn)SCP、多糖

17、等產(chǎn)品。但是，要獲取具有全纖維素酶的高產(chǎn)菌株，原生質(zhì)體融合技術(shù)是理想的育種途徑。它可打破物種間細胞不能相互融合的障礙。通過細胞融合，就能獲得既能分解纖維素，又能分解木質(zhì)素的穩(wěn)定的雜種菌株，構(gòu)建具有纖維素分解能力的釀酒酵母菌也勢在必得。6.3工程菌技術(shù)條件的進一步成熟含纖維素原料的酶解糖化與酒精發(fā)酵在同一反應(yīng)器中連續(xù)進行時，除了消除葡萄糖因濃度高對纖維素酶的反饋抑制，還要協(xié)調(diào)酶水解與酵母發(fā)酵的最適溫度pH值、發(fā)酵特性等指標。同時以后成熟的工程菌會有3個顯著特性:一是能提高酒精對糖的收率，以降低酒精生產(chǎn)的原料消耗；二是具有一定的耐溫性，以提高發(fā)酵溫度，降低大型發(fā)酵裝置夏季高溫季節(jié)的冷卻費用；三是具

18、有很強的耐酒精性能，以提高發(fā)酵終點發(fā)酵液中的酒精濃度。7 展望生物多樣性與人類生存密切相關(guān)已為人們所共識。由于微生物的多樣性、傳代生長速度快、培養(yǎng)可控性、生產(chǎn)成本低、易進行基因突變、克隆重組及高效表達等優(yōu)點，使人類能很快獲得優(yōu)良的基因工程菌，微生物酶源無疑將會發(fā)揮更大的作用和潛力。相信在不久的將來極有可能直接以纖維素為原料制取酒精，從而從根本上變革傳統(tǒng)的酒精生產(chǎn)工藝。盡管纖維素作為直接碳源進行的研究還處于初級階段，但從目前的研究結(jié)果和發(fā)展趨勢來看，纖維素酒精發(fā)酵對我們已不遙遠。參考文獻：1 劉春芬,賀稚非,蒲海燕,等.纖維素酶及應(yīng)用現(xiàn)狀J.糧食與油脂,2004,(1):15-17.2 王巧蘭,

19、郭剛,林范學(xué).纖維素酶研究綜述J.湖北農(nóng)業(yè)科學(xué),2004,(3):14-18.3 王俊增.酒精生產(chǎn)中應(yīng)用纖維素酶提高酒率的理論探索J.山東食品發(fā)酵,1994(4):28-30.4 肖春玲, 徐常新.微生物纖維素酶的應(yīng)用研究J.微生物學(xué)雜志,2002,22(2):33-35.5 曾家豫,馮克寬.纖維素酶制備工藝的研究J.甘肅農(nóng)業(yè)科技,2000(4):46-47.6 彭宇輝.纖維素酶的制備及其在食品工業(yè)中的應(yīng)用J.企業(yè)技術(shù)開發(fā),2000,(11):11-12.7 Baker J O, Adney W S, Thomas S R, et al. Synergism between purified

20、bacterial and fungal cellulases. Enzymatic Degradation of Insoluble Polysaccharides,1995,618:113-141.8 Himmel, M E, Adney W S, Baker J O, et al. Advanced bioethanol production technologies:A perspective. Fuels and Chemicals from Biomass,1997,666:2-45.9 高培基,曲音波,王祖農(nóng).纖維素酶解過程的分析和測定J.生物工程學(xué)報,1988,4(4):324.10 謝占玲, 吳潤.纖維素酶的研究進展J.草業(yè)科學(xué),2004(4):72-76.11 徐學(xué)萬,張芳.纖維素酶的特性及其在食品工業(yè)中的應(yīng)用J.糧食與食品工業(yè),