生物工程上游實(shí)驗(yàn)報(bào)告

1、利用不同的方法篩選和鑒定轉(zhuǎn)化子作者:XXX學(xué)院:生命科學(xué)學(xué)院班級(jí):XXXX學(xué)號(hào):XXXXX同組人員:XXX摘要:本實(shí)驗(yàn)通過使用限制性內(nèi)切酶切割質(zhì)粒，用定向克隆的方法相連，并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中，然后對(duì)轉(zhuǎn)化產(chǎn)物進(jìn)行了篩選和鑒定.從所得的五個(gè)轉(zhuǎn)化子中，經(jīng)過PCR、瓊脂糖電泳鑒定，搖瓶發(fā)酵，觀察是否有綠色熒光蛋白基因篩選出有重組質(zhì)粒的大腸桿菌.關(guān)鍵詞: PCR 酶切 重組質(zhì)粒 大腸桿菌 凝膠電泳1 引言質(zhì)粒具有穩(wěn)定可靠和操作簡便的優(yōu)點(diǎn).在實(shí)際工作中，由于量少，連接產(chǎn)物沒有也不可能再經(jīng)過分離純化而獲得純的重組質(zhì)粒，連接產(chǎn)物中混有載體自連而成的空載體、載體與目的片段連接而成的目的重組質(zhì)粒和載體與非目的片段連

2、接而成的非目的重組質(zhì)粒.同時(shí)，細(xì)菌的轉(zhuǎn)化效率極低，進(jìn)行轉(zhuǎn)化后，絕大部分細(xì)菌是沒有被轉(zhuǎn)化的.因此有必要對(duì)轉(zhuǎn)化產(chǎn)物進(jìn)行篩選和鑒定.首先，通過抗生素抗性從轉(zhuǎn)化后代中篩選出轉(zhuǎn)化子.因?yàn)榉寝D(zhuǎn)化菌沒有質(zhì)粒而缺乏相應(yīng)的抗生素抗性，所以，將轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布在含有相應(yīng)抗生素的培養(yǎng)基上篩選，只有含有相應(yīng)抗性的抗生素抗性基因才能生長繁殖形成菌落.其次，通過菌落直接PCR從轉(zhuǎn)化子中篩選出轉(zhuǎn)基因生物，擴(kuò)增出特殊目的基因片段，判斷所得轉(zhuǎn)化子是否為重組子.但因?yàn)镻CR技術(shù)的高靈敏性，往往會(huì)產(chǎn)生假陽性結(jié)果.因此有必要進(jìn)一步進(jìn)行鑒定.從候選重組子中進(jìn)行搖菌培養(yǎng)關(guān)注菌株表達(dá)形態(tài)，若出現(xiàn)熒光蛋白則說明菌株成功轉(zhuǎn)化并表達(dá)了GFP熒光蛋白

3、。2 材料與方法2.1 材料:實(shí)驗(yàn)九所得轉(zhuǎn)化子2.2 設(shè)備用具：PCR儀，恒溫?fù)u床，臺(tái)式高速離心機(jī)，恒溫水浴鍋，瓊脂糖凝膠電泳裝置，凝膠成像系統(tǒng)裝置，三角瓶電熱恒溫培養(yǎng)箱，電泳儀，超凈臺(tái)，移液槍，1.5mL離心管2.3 試劑rTaq酶：10×PCR buffer；dNTP mixtures(10mM)前向引物P1：5-CGCGAATTCATGGCAGATCAG-3反向引物P2：5-AGAGCGGCCGCCTTTGCCATCATAACTTTGACACAAA-3限制性核酸內(nèi)切酶Hind；ddH2O；限制性核酸內(nèi)切酶緩沖液:10×M buffer，0.5×TBE buf

4、fer；EB母液；質(zhì)粒提取試劑；酶切試劑；酶反應(yīng)終止液；1%瓊脂糖；無菌蒸餾水；6×loading buffer；礦物油.LB液體培養(yǎng)基配方:稱胰蛋白胨7g，酵母提取物3.5g，NaCl 7g于1000ml的三角瓶中，加入700ml蒸餾水?dāng)嚢枞芙?，然后用NaOH調(diào)pH至7.5，加塞，包扎瓶口，高溫蒸汽滅菌備用。2.2 方法2.2.1 轉(zhuǎn)化子的篩選選出在實(shí)驗(yàn)九中，LB固體培養(yǎng)基上生長出來的白色菌落.選取五個(gè)，做好標(biāo)記.2.2.2 菌落直接PCR用無菌牙簽分別挑取5個(gè)白色單菌落，在編好號(hào)碼的PCR反應(yīng)管中的底部分別涂抹，然后在PCR管仲配制75L反應(yīng)體系.反應(yīng)體系如下:DNA templ

5、ate buffer 用牙簽挑取菌落在PCR管中涂抹10×PCR buffer 7.5LdNTP mixture 6L前向引物(P1) 3L后向引物(P2) 3LrTaq 酶 1LddH2O 54.5L（up to 75L）所有試劑按量仔細(xì)添加后，輕輕混勻，稍離心即可.為了防止反應(yīng)混合液蒸發(fā)，最后添加15L礦物油.PCR儀的參數(shù)設(shè)置94 4min94 30s62 30s 35 cycles72 30s72 5min瓊脂糖凝膠電泳檢測:反應(yīng)結(jié)束后，取10L產(chǎn)品，加入2L 6×loading buffer，混勻后點(diǎn)樣，電泳15min.觀察產(chǎn)物帶.2.2.3 質(zhì)粒提取及大小鑒定:

6、照上述電泳的結(jié)果，用無菌牙簽從平板上挑選出2個(gè)PCR反應(yīng)陽性菌落，接種于含Amp10g/mL的10mL LB液體培養(yǎng)基中，37下震蕩培養(yǎng)24h，觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果，并以別組的結(jié)果沒有綠色熒光蛋白基因的液體培養(yǎng)基作為陰性對(duì)照，對(duì)比觀察并拍照記錄。(附LB液體培養(yǎng)基的配制方法)LB液體培養(yǎng)基配制方法:稱取胰蛋白胨7g，NaCl 7g,酵母提取物3.5g于1000ml三角瓶中，加入700ml蒸餾水?dāng)嚢枞芙猓湃敫邏簻缇佒袦缇鷤溆?，每個(gè)同學(xué)使用時(shí)，每個(gè)液體培養(yǎng)基只需要10ml左右。3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果3.1 PCR產(chǎn)物電泳圖圖 1 菌落直接PCR產(chǎn)物電泳圖3.2 液體培養(yǎng)基觀察綠色熒光 3號(hào)（陽性菌）1號(hào)（陽性菌

7、）陰性對(duì)照?qǐng)D 2 液體培養(yǎng)基大腸桿菌綠色熒光現(xiàn)象圖4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析4.1 菌落直接PCR結(jié)果在上一次的轉(zhuǎn)化試驗(yàn)中，在含有氨芐青霉素的培養(yǎng)基中，有大量的大腸桿菌生長，我從中挑選出5個(gè)菌落直接PCR。進(jìn)行凝膠電泳后，結(jié)果如圖1所示. 圖1中，1、3為陽性轉(zhuǎn)化子，2 、4 、5為陰性轉(zhuǎn)化子，因此，5個(gè)菌落中有2個(gè)（1、3）呈陽性。再對(duì)比marker可知，1、3的窄條帶大小均為768bp，與GFP片段大小相符。綜上初步判斷，1、3所代表的菌落為所需鑒定的轉(zhuǎn)化子。4.2 質(zhì)粒提取與大小鑒定在質(zhì)量相同的情況下，各種DNA的遷移率為超螺旋>線性>開環(huán).由于DNA分子的構(gòu)型不同，電泳時(shí)受到阻力不同

8、，導(dǎo)致了泳動(dòng)速率的不同.對(duì)于相對(duì)分子質(zhì)量相同的DNA分子，其物理構(gòu)象越接近球狀，泳動(dòng)時(shí)遇到的阻力就越小，速率越快.所以，共價(jià)閉合環(huán)狀超螺旋的構(gòu)象最接近球狀，速率最快，因此從電泳結(jié)果看，（結(jié)果如圖1所示）在堿基數(shù)約為100處有條帶且條帶較寬，說明酶切不是非常完全，但是相比其他組的酶切效果，也算是比較理想。編號(hào)為1和3的菌落的堿基數(shù)接近768bp,符合實(shí)驗(yàn)所需的綠色熒光基因的堿基數(shù)，而2、4、5號(hào)菌均無堿基數(shù)為768bp左右的條帶，說明在其轉(zhuǎn)化到大腸桿菌的載體中沒有連接目的基因（可能是非目的基因與載體相連），故對(duì)符合實(shí)驗(yàn)需求的1號(hào)和3號(hào)進(jìn)行搖菌。4.2 目的基因表達(dá)以別的組的沒有綠色熒光的液體培養(yǎng)

9、基作為陰性對(duì)照，用藍(lán)光燈照射可明顯看出，本實(shí)驗(yàn)中電泳鑒定出堿基數(shù)接近768bp所對(duì)應(yīng)的1號(hào)和3號(hào)大腸桿菌菌落均含有目的基因和載體結(jié)合的重組質(zhì)粒，且在搖瓶培養(yǎng)后，均表達(dá)了綠色熒光基因，因此可以判斷，在第八次實(shí)驗(yàn)的PCR的純化與定向克隆以及第九次實(shí)驗(yàn)的轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)均非常成功。5 結(jié)論或討論5.1結(jié)論證實(shí)了轉(zhuǎn)化試驗(yàn)中所得到的，標(biāo)號(hào)為1和3的轉(zhuǎn)化子為重組子，其電泳結(jié)果顯示其堿基數(shù)約為768bp且含有目的基因GFP（綠色熒光蛋白基因）。5.2綜合討論實(shí)驗(yàn)材料由轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)所得，這次實(shí)驗(yàn)是從另一面去檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)八的定向克隆和實(shí)驗(yàn)九的轉(zhuǎn)化效率。從結(jié)果來看，實(shí)驗(yàn)八和實(shí)驗(yàn)九均非常成功，所以才有本試驗(yàn)中，綠色熒光蛋白基因在大

10、腸桿菌的表達(dá)。另外，從這個(gè)試驗(yàn)中，我得到了一些教訓(xùn)，將在下面一一列出：1、要善于和別人合作，提高效率；由于這個(gè)實(shí)驗(yàn)中，我們要處理5個(gè)菌落，且既要配制PCR反應(yīng)體系，又要配制培養(yǎng)基。因此，合理的分工顯得格外重要。比如可讓一個(gè)同學(xué)做輔助性步驟（如調(diào)好移液槍等），另一個(gè)同學(xué)專心做主要的步驟，這樣可節(jié)省許多時(shí)間。2、實(shí)驗(yàn)時(shí)要細(xì)心，由于加的試劑比較多，且加的量都很小，因此要注意嚴(yán)格控制加入試劑。注意不要加錯(cuò)試劑或者加多試劑、防止細(xì)菌污染樣品、調(diào)準(zhǔn)儀器等，否則實(shí)驗(yàn)將不能順利進(jìn)行。3、基因工程實(shí)驗(yàn)的儀器設(shè)備比較貴重，故一個(gè)實(shí)驗(yàn)室的儀器設(shè)備十分有限，而一個(gè)實(shí)驗(yàn)室做實(shí)驗(yàn)的有三四十人，因此為了趕上大家的進(jìn)度，我們

11、很容易會(huì)做得很急，但是正因?yàn)槲覀冏龅锰绷?，所以容易出錯(cuò)，導(dǎo)致重做。因此，要想把實(shí)驗(yàn)做好，則思路要清晰，一步一步來，不能急，對(duì)于一些相似的試劑，例如10 x loading buffer和10×M buffer非常相似，更要小心不能加錯(cuò),否則都要重做,更加跟不上大家的進(jìn)度，因此，做基因工程的實(shí)驗(yàn)，細(xì)心，耐心是非常重要的，因?yàn)橛賱t不達(dá)，另外，遇到不懂的問題要善于同學(xué)之間相互討論，若還是不懂，則主動(dòng)尋求老師的幫助。最后，特別感謝在基因工程實(shí)驗(yàn)這一門實(shí)驗(yàn)課中給予我?guī)椭睦蠋熍c同學(xué)，感謝XXX老師每節(jié)課耐心地給我們講授知識(shí)，也要感謝XXX老師的教導(dǎo)和實(shí)驗(yàn)員劉老師每節(jié)課都為我們準(zhǔn)備實(shí)驗(yàn)材料和各種試劑，以及指導(dǎo)我