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IP屬地：廣東 上傳時間：2022-03-05 格式：DOC 頁數(shù)：11 大?。?06KB 積分：12 舉報 版權申訴

1、基因定點突變?nèi)ヂ砸弧⒍c突變的目的把目的基因上面的一個堿基換成另外一個堿基。二、定點突變的原理定點突變是指通過聚合酶鏈式反應（PCR）等方法向目的DNA片段（可以是基因組，也可以是質(zhì)粒）中引入所需變化（通常是表征有利方向的變化），包括堿基的添加、刪除、點突變等。定點突變能快速、高效的提高DNA所表達的目的蛋白的性狀及表征，是基因爭辯工作中一種格外有用的手段。 體外定點突變技術是爭辯蛋白質(zhì)結構和功能之間的簡單關系的有力工具，也是試驗室中改造/優(yōu)化基因常用的手段。蛋白質(zhì)的結構打算其功能，二者之間的關系是蛋白質(zhì)組爭辯的重點之一。對某個已知基因的特定堿基進行定點轉變、缺失或者插入，可以轉變對應的氨基

2、酸序列和蛋白質(zhì)結構，對突變基因的表達產(chǎn)物進行爭辯有助于人類了解蛋白質(zhì)結構和功能的關系，探討蛋白質(zhì)的結構/結構域。而利用定點突變技術改造基因：比如野生型的綠色熒光蛋白（wtGFP）是在紫外光激發(fā)下能夠發(fā)出微弱的綠色熒光，經(jīng)過對其發(fā)光結構域的特定氨基酸定點改造，現(xiàn)在的GFP能在可見光的波長范圍被激發(fā)（吸取區(qū)紅移），而且發(fā)光強度比原來強上百倍，甚至還消滅了黃色熒光蛋白，藍色熒光蛋白等等。定點突變技術的潛在應用領域很廣，比如爭辯蛋白質(zhì)相互作用位點的結構、改造酶的不同活性或者動力學特性，改造啟動子或者DNA作用元件，提高蛋白的抗原性或者是穩(wěn)定性、活性、爭辯蛋白的晶體結構，以及藥物研發(fā)、基因治療等等方面。

3、 通過設計引物，并利用PCR將模板擴增出來，然后去掉模板，剩下來的就是我們的PCR產(chǎn)物，在PCR產(chǎn)物上就已經(jīng)把這個點變過來了，然后再轉化，篩選陽性克隆，再測序確定就行了。三、引物設計原則引物設計的一般原則不再重復。突變引物設計的特殊原則：（1）通常引物長度為2545 bp，我們建議引物長度為3035 bp。一般都是以要突變的堿基為中心，加上兩邊的一段序列，兩邊長度至少為11-12 bp。若兩邊引物太短了，很可能會造成突變試驗失敗，由于引物至少要11-12個bp才能與模板搭上，而這種突變PCR要求兩邊都能與引物搭上，所以兩邊最好各設至少12個bp，并且合成多一條反向互補的引物。 （2）假如設定的

4、引物長度為30 bp，接下來需要計算引物的Tm值，看是否達到78（GC含量應大于40%）。 （3）假如Tm值低于78，則適當轉變引物的長度以使其Tm值達到78（GC含量應大于40%）。 （4）設計上下游引物時確保突變點在引物的中心位置。 （5）最好使用經(jīng)過純化的引物。       Tm值計算公式：Tm=0.41×(% of GC)675/L+81.5 注：L：引物堿基數(shù)；% of GC：引物GC含量。四、引物設計實例以GCGACG為例：5-CCTCCTTCAGTATGTAGGCGACTTACTTATTGCGG-3（1）首先設

5、計30 bp長的上下游引物，并將A (T)設計在引物的中心位置。Primer #1: 5-CCTTCAGTATGTAGACGACTTACTTATTGC-3 Primer #2: 5-GCAATAAGTAAGTCGTCTACATACTGAAGG-3（2）引物GC含量為40%，L為30，將這兩個數(shù)值帶入Tm值計算公式，得到其Tm=75.5（Tm=0.41×40-675/30+81.5）。通過計算可以看出其Tm低于78，這樣的引物是不合適的，所以必需調(diào)整引物長度。（3）重新調(diào)整引物長度。Primer #1: 5-CCTCCTTCAGTATGTAGACGACTTACTTATTGCGG-3 P

6、rimer #2: 5-CCGCAATAAGTAAGTCGTCTACATACTGAAGGAGG-3在引物兩端加5mer（斜體下劃線處），這樣引物的GC含量為45.7%，L值為35，將這兩個數(shù)值帶入Tm值計算公式，得到其Tm為80.952（Tm=0.41×47.5-675/35+81.5），這樣的引物就可以用于突變試驗了。五、突變所用聚合酶及Buffer引物和質(zhì)粒都預備好后，當然就是做PCR嘍，不過對于PCR的酶和buffer，不能用平常的，我們做PCR把整個質(zhì)粒擴出來，延長長度達到幾個K，所以要用那些GC buffer或擴增長片段的buffer，另外，要用保真性能較好的PFU酶來擴增

7、，防止引進新的突變。除了使用基因定點突變試劑盒，如Stratagene和塞百盛的試劑盒，但價格昂貴?？梢允褂酶弑Ｕ娴木酆厦?，如博大泰克的金牌快速taq酶、Takara的PrimeSTARTM HS DNA polymerase。六、如何去掉PCR產(chǎn)物最簡潔的方法就是用DpnI酶，DpnI能夠識別甲基化位點并將其酶切，我們用的模板一般都是雙鏈超螺旋質(zhì)粒，從大腸桿菌里提出來的質(zhì)粒一般都被甲基化愛護起來（除非你用的是甲基化缺陷型的菌株），而PCR產(chǎn)物都是沒有甲基化的，所以DpnI酶能夠特異性地切割模板（質(zhì)粒）而不會影響PCR產(chǎn)物，從而去掉模板留下PCR產(chǎn)物，所以提質(zhì)粒時那些菌株肯定不能是甲基化缺陷株

8、。DpnI處理的時間最好長一點，最少一個小時吧，最好能有兩三個小時，由于假如模板處理得不潔凈，哪怕只有那么一點點，模板直接在平板上長出來，就會導致試驗失敗。七、如何拿到質(zhì)粒直接把通過DpnI處理的PCR產(chǎn)物拿去做轉化就行了，然后再篩選出陽性克隆，并提出質(zhì)粒，拿去測序，驗證突變結果。八、圖示九、定點突變操作步驟A 誘導突變基因（PCR反應）以待突變的質(zhì)粒為模板，用設計的引物及Muta-direct酶進行PCR擴增反應，誘導目的基因突變。1. 設計點突變引物。  注參考引物設計指導2. 預備模板質(zhì)粒DN A注用dam+型菌株（例如DH5菌株）作為宿主菌。在end+型菌株中常有克隆數(shù)低的現(xiàn)

9、象，但是對突變效率沒有影響。提取質(zhì)粒DNA時我們建議您使用本公司的質(zhì)粒提純試劑盒。3. 選項對比反應體系（50l反應體系）10×Reaction Buffer5lpUC18 control plasmid（10ng/l，total 20ng）2lControl primer mix（20pmol/l）2ldNTP mixture（each 2.5mM）2ldH2O 38lMuta-direct Enzyme1l4. 樣品反應體系（50l反應體系）10×Reaction Buffer5lSample plasmid（10ng/l，total 20ng） 2lSamp

10、le primer (F)（10pmol/l）1lSample primer (R)（10pmol/l）1ldNTP mixture（each 2.5mM）2ldH2O38lMuta-direct Enzyme1l5. PCR反應條件注按如下參數(shù)設置PCR擴增條件。CyclesTemperature Reaction Time1cycle95 30sec15cycle9530sec551min721min per plasmid Kb6. PCR擴增反應完成后冰育5分鐘，然后置于室溫（避開反復凍融）。注 按下列供應的PCR條件進行擴增，把握PCR循環(huán)數(shù)。留意當突變點位點超過4個時會發(fā)生突變率降

11、低的現(xiàn)象。MutationCycles 12Nucleotide15cycles3Nucleotides18cyclesB 突變質(zhì)粒選擇PCR反應結束后使用Mutazyme酶消化甲基化質(zhì)粒從而選擇突變質(zhì)粒DNA。1. 預備PCR反應產(chǎn)物2. 加入1l（10U/l）Mutazyme酶37溫育1小時。注當質(zhì)粒DNA用量過多時Mutazyme酶可能發(fā)生與樣品反應不完全的現(xiàn)象。因此我們建議為了保證突變率請嚴格遵照試驗步驟進行操作。假如突變率低，可以適當延長反應時間或增加Mutazyme酶用量。C轉化反應完畢后在質(zhì)粒DNA上會產(chǎn)生缺口，當把這個質(zhì)粒DNA轉入E.coli中時請選擇dam+型菌株，例如DH

12、5。1. 將10l樣品加到50l感受態(tài)細胞里，然后放置在冰上30分鐘。 2. 接下來可以參照一般的轉化步驟進行。序列分析通常當LB平板上出白色菌落則表明發(fā)生了突變。 為了證明這一結果，我們建議對白色單菌落進行測序分析。先講最簡潔的一個點的定點突變技術，其它較長片段的突變，刪除，插入技術以后會漸漸奉上：在做試驗之前，我們首先要搞清楚試驗的目的和試驗的原理。 試驗的目的應當比較明確吧：就是要把自己的基因上面的一個堿基換成另外一個堿基。一般狀況下我們會有幾種可能使我們需要這樣去做：第一：我們吊出來的基因有點突變，信任這可能是大家經(jīng)常會遇到的問題?；蚝貌缓啙嵉醭鰜恚⒀b進了自己的載體，卻發(fā)覺有一兩個

13、堿基跟自己的預期序列或全部的公共數(shù)據(jù)庫不匹配，然后暴昏。 大家試驗室里面還是用Taq酶為主吧，Pfu這樣的高保真酶大家應當用得不多吧，Taq酶的優(yōu)點和缺點都很明顯：優(yōu)點就是擴增效能強，缺點就是保真性差，其錯配機率是比較高的，相關數(shù)字忘了，大家可以去網(wǎng)上查那個數(shù)字，不過感覺假如是2000bp的基因，假如擴四五十個循環(huán)的話，很大機率會消滅點突變，當然這也跟具體PCR體系里的Buffer有很大關系，具體狀況這里就不爭辯了。其次：要爭辯基因的功能，在基因上自己選定位置更換堿基的保守序列，或者改造成不同的亞型，總之就是要人工改造堿基序列符合自己的試驗需要，信任這也是那些爭辯基因的人經(jīng)常的一種思路吧。 對

14、于第一種狀況：我們首先要分析消滅堿基不匹配的位置是不是重要的位置，假如不是很重要，大可不必管它，比如說是三聯(lián)密碼子的最終一位，堿基的轉變并沒有引起相應氨基酸的轉變，那么一般狀況下也可以不去理它。另外，在NCBI上人類的基因的版本始終在變化，也就是說同一個基因有不同的版本，或者稱不同的亞型，其堿基序列有些許的差異，只要自己克隆出來的堿基序列與其中一個相匹配，一般也就可以不做定點突變了。假如有時間沒錢，那干脆重新PCR然后再克隆進自己的載體了，不過最好換個保真性好一點的酶如PFU，或者PCR循環(huán)數(shù)低一點，不過這些東西有時候也得靠運氣啦。實在不行的話再來做定點突變。對于其次種狀況：這種狀況下一般也就

15、只能做定點突變了。 接下來開頭聊一聊定點突變的原理吧，那個Stratagene試劑盒！上面有一個說明書，說得好像很正規(guī)，不過上面好多都是什么專利啊什么留意之類的話，看都不看，我們簡明扼要地只講試驗方面，通過設計引物，并利用PCR將模板擴增出來，然后去掉模板，剩下來的就是我們的PCR產(chǎn)物，在PCR產(chǎn)物上就已經(jīng)把這個點變過來了，然后再轉化，篩選陽性克隆，再測序確定就行了。大家馬上就會想到幾個問題了：第一：引物怎么設計呢？其次：模板怎么去掉呢？第三：怎么拿到質(zhì)粒呢？對于第一個問題：怎么設計引物？我只能講一些原則，并舉一些例子。引物設計的原則其它貼子上都有講，這里就不重復了：不過這種突變引物要加上一個

16、原則： 一般都是以要突變的堿基為中心，加上兩邊的一段序列，兩邊長度至少為11-12base pair。 若兩邊引物太短了，很可能會造成突變試驗失敗，大家應當都知道，引物至少要11-12個base pair才能與模板搭上，而這種突變PCR要求兩邊都能與引物搭上，所以兩邊最好各設至少12個base pair，并且合成多一條反向互補的引物。這么說大家可能不是很清楚，那我就舉個例子吧：X71661.1 TATCAGGAGGAATTTGAGCACTTTCAACAAGAATTGGATAAAAAAAAAGAGGAATTCCAG 960現(xiàn)有序列 TATCAGGAGGAATTTGAGCACTTTCAACAAGA

17、ATTGGATAAAAAAAAAGAGGAATTCCAG 924* *|-deletion X71661.1 AAGGGCCACCCCGACCTCCAAGGGCAGCCTGCGGAGGAAATATTTGAGAGTGTAGGAGAT 1020現(xiàn)有序列 AAGGGCCACCCCGACCTCCAAGGGCAGCCTGCGGAGGAAATATTTGAGAGTGTAGGAGAT 984（上面為目的序列，下面為現(xiàn)有序列：我們發(fā)覺有一個A堿基的缺失，其直接結果是在表達蛋白時后面的氨基酸全部錯配） 我們以它為中心設計引物：兩邊各至少12個堿基，左邊由于含有較多的A造成引物GC%含量過低，故拉長引物使GC%含量

18、不至過低，也使引物退火溫度上升。故合成引物CAACAAGAATTGGATAAAAAAAAAGAGGAATTCCAGAAG并合成反向互補引物CTTCTGGAATTCCTCTTTTTTTTTATCCAATTCTTGTTG 其實也不肯定要反向互補序列，只要反向引物也是兩邊都有大于12個堿基，同時符合引物設計的原則就行了。 引物合成公司有很多家，大家可以去查找，不同廠家的引物在價錢質(zhì)量上有一些差別，不過價錢一般都是一塊多一個堿基，合成時間約為一周。 這樣的結果是PCR時把整個質(zhì)粒都給擴出來了，得到的PCR產(chǎn)物是一條鏈完整，另一鏈有缺刻的PCR產(chǎn)物對于其次個問題： 怎么去掉模板呢？再簡潔的方法就是用Dp

19、nI酶，DpnI能夠識別甲基化位點并將其酶切，我們用的模板一般都是雙鏈超螺旋質(zhì)粒，從大腸桿菌里提出來的質(zhì)粒一般都被甲基化愛護起來（除非你用的是甲基化缺陷型的菌株），而PCR產(chǎn)物都是沒有甲基化的，所以DpnI酶能夠特異性地切割模板（質(zhì)粒）而不會影響PCR產(chǎn)物，從而去掉模板留下PCR產(chǎn)物，所以提質(zhì)粒時那些菌株肯定不能是甲基化缺陷株，不會那么湊巧吧，哈哈。關于第三個問題： 直接把通過DpnI處理的PCR產(chǎn)物拿去做轉化就行了，呵呵，然后再篩選出陽性克隆，并提出質(zhì)粒，拿去測序（這個就不用我多說了吧），驗證突變結果，一般都沒問題的啦，我做了幾十個突變了，到目前為止還沒有做不出來的，呵呵，不要砸我啊。下面講

20、一下具體的試驗步驟以及一些試驗中要留意的事情：1、 依據(jù)現(xiàn)有基因設計引物；2、 合成引物并預備好模板；3、 PCR，4、 DpnI處理酶切產(chǎn)物；5、 轉化酶切產(chǎn)物；6、 篩選 陽性克?。?、 送測序并測全長。最終就是慶祝啦，呵呵，沒什么簡單的。 引物和質(zhì)粒都預備好后，當然就是做PCR嘍，不過對于PCR的酶和buffer，不能用平常的，我們做PCR把整個質(zhì)粒擴出來，延長長度達到幾個K，所以要用那些GC buffer或擴增長片段的buffer，另外，要用保真性能較好的PFU酶來擴增，防止引進新的突變。那種Quick change試劑盒分為幾種不同的類型 什么QuikChange® Sit

21、e-Directed Mutagenesis Kit標準點突變試劑盒 、QuikChange® XL Site-Directed Mutagenesis Kit長模板單點突變試劑盒（>8kb）從原理上是一樣的，只是PCR的酶和BUFFER不一樣，后面用了比較適合長片段擴增的酶和BUFFER罷了，沒什么特殊的東西。另外，DpnI處理的時間最好長一點，最少一個小時吧，最好能有兩三個小時，由于假如模板處理得不潔凈，哪怕只有那么一點點，模板直接在平板上長出來，就會導致試驗失敗。試驗板長出來的菌有兩種可能 一種是質(zhì)粒DPNI沒處理潔凈長出來的（模板），一種是PCR產(chǎn)物轉化出來的 （突變體

22、）不過這兩種菌長得一模一樣_，即使提出質(zhì)粒來也是一樣（酶切和PCR都無法區(qū)分），除了測序，是分不出來的， 做PCR時也最好做一個負對比（不加引物），試驗管由于PCR時有引物，所以在DNPI處理前里面既含有模板又含有PCR產(chǎn)物，而對比管由于PCR時沒放引物，所以在DPNI處理前里面只有模板。 假如兩者都拿去DNPI處理 就能夠證明模板已經(jīng)被去除潔凈。若試驗順當?shù)脑拺斒牵赫龑Ρ乳L菌負對比不長菌。假如消滅正負對比都長菌，那么就是DpnI沒處理好，假如正負對比都不長菌，那么有兩種可能，一種是PCR陰性，也就是說PCR出問題了，另外一個可能就是轉化出問題了。要搞清楚是哪個問題，跑膠說明不了問題，那就做

23、個轉化的對比，拿試劑盒的對比試驗去試感受態(tài)，馬上就能知道轉化有沒問題。假如正對比很多菌，負對比有幾個菌，那么就是DPNI處理得不潔凈，這個時候就得靠運氣了_大家有什么問題我們可以連續(xù)爭辯。另外，假如大家既沒有DpnI酶也沒有好的PCR酶和BUFFER的話，那也有其它方法進行定點突變，只是麻煩一點，假如大家有需要的話，我會把方法貼上來。對于多點突變技術及較長片段的缺失插入技術，同樣的，假如大家有需要的話，我會把方法貼上來。 不過，假如你有錢的話，那就去買那個試劑盒吧，其中QuikChange® Site-Directed Mutagenesis Kit標準點突變試劑盒 、QuikCha

24、nge® XL Site-Directed Mutagenesis Kit長模板單點突變試劑盒（>8kb）的原理我上面已經(jīng)說了，只是補充了一些我認為的留意事項。假如你更有錢的話，那么你可以叫其它公司幫你做定點突變服務，大約是改一個點1000元左右。假如有需要我可以供應公司的聯(lián)系方式。 下面我以一個例子為例來講100個bp以下的堿基插入缺失或者轉變試驗方案。其實這種方案并不是那么好的，只不過考慮到大家一般都沒有TYPEII限制性內(nèi)切酶或者UDG and NTHIII（另外兩種方法），所以才打算先介紹這種方法。 首先先說明一點，這種 方法在原理上存在肯定成功機率，也就是說有運氣成分

25、。而定點突變則一般都是百分之百成功的，而這種100bp以下的插入缺失或者堿基轉變可能要測幾個克隆才能挑到一個好的克隆，大家假如要用請慎重考慮。 同樣的，我只變那幾十個堿基，并沒有轉變載體及其它地方，所以我還是依靠于DPNI酶。舉例：Homo sapiens FzE3 是一個人類基因，其含有32個氨基酸的信號肽MRDPGAAAPLSSLGLCALVLALLGALSAGAGA，后面是成熟肽QPYHGEKGISVPDHGFCQPISIPLCTDIAYNQTILPNLLGHTNQEDAGLEVHQFYPLVKVQCSPELRFFLCSMYAPVCTVLDQAIPPCRSLCERARQGCEALMNKF

26、GFQWPERLRCENFPVHGAGEICVGQNTSDGSGGPGGGPTAYPTAPYLPDLPFTALPPGASDGRGRPAFPFSCPRQLKVPPYLGYRFLGERDCGAPCEPGRANGLMYFKEEERRFARLWVGVWSVLCCASTLFTVLTYLVDMRRFSYPERPIIFLSGCYFMVAVAHVAGFLLEDRAVCVERFSDDGYRTVAQGTKKEGCTILFMVLYFFGMASSIWWVILSLTWFLAAGMKWGHEAIEANSQYFHLAAWAVPAVKTITILAMGQVDGDLLSGVCYVGLSSVDALRGFVLAPLFVYLFIGTS

27、FLLAGFVSLFRIRTIMKHDGTKTEKLEKLMVRIGVFSVLYTVPATIVLACYFYEQAFREHWERTWLLQTCKSYAVPCPPGHFPPMSPDFTVFMIKYLMTMIVGITTGFWIWSGKTLQSWRRFYHRLSHSSKGETAV，想在信號肽和成熟肽之間插入一個FLAG標簽并在標簽前面加上一個Leucine。即在信號肽和成熟肽之間插入一段序列：TTAATGGACTACAAAGACGATGACGACAAG（一共三十個bp）、試驗設計：信號肽：ATGCGGGACCCCGGCGCGGCCGTTCCGCTTTCGTCCCTGGGCTTCTGTGCCCTGGTG

28、CTGGCGCTGCTGGGCGCACTGTCCGCGGGCGCCGGGGCG成熟肽：CAGCCGTACCACGGAGAGAAGGGCATCTCCGTGCCGGACCACGGCTTCTGCCAGCCCATCTCCATCCCGCTGTGCACGGACATCGCCTACAACCAGACCATCCTGCCCAACCTGCTGGGCCACACGAACCAAGAGGACGCGGGCCTCGAGGTGCACCAGTTCTACCCGCTGGTGAAGGTGCAGTGTTCTCCCGAACTCCGCTTTTTCTTATGCTCCATGTATGCGCCCGTGTGCACCGTGCTCGATCAGGCCATCCC

29、GCCGTGTCGTTCTCTGTGCGAGCGCGCCCGCCAGGGCTGCGAGGCGCTCATGAACAAGTTCGGCTTCCAGTGGCCCGAGCGCCTGCGCTGCGAGAACTTCCCGGTGCACGGTGCGGGCGAGATCTGCGTGGGCCAGAACACGTCGGACGGCTCCGGGGGCCCAGGCGGCGGGCCCACTGCCTACCCTACCGCGCCCTACCTGCCGGACCTGCCCTTCACCGCGCTGCCCCCGGGGGCCTCAGATGGCAAGGGGCGTCCCGCCTTCCCCTTCTCATGCCCCCGTCAGCTCAAGGTGCCCCC

30、GTACCTGGGCTACCGCTTCCTGGGTGAGCGCGATTGTGGCGCCCCGTGCGAACCGGGCCGTGCCAACGGCCTGATGTACTTTAAGGAGGAGGAGAGGCGCTTCGCCCGCCTCTGGGTGGGCGTGTGGTCCGTGCTGTGCTGCGCCTCGACGCTCTTTACCGTTCTCACGTACCTGGTGGACATGCGGCGCTTCAGCTACCCAGAGCGGCCCATCATCTTCCTGTCGGGCTGCTACTTCATGGTGGCCGTGGCGCACGTGGCCGGCTTCTTTCTAGAGGACCGCGCCGTGTGCGTGGAGCG

31、CTTCTCGGACGATGGCTACCGCACGGTGGCGCAGGGCACCAAGAAAGAGGGCTGCACCATCCTCTTCATGGTGCTCTACTTCTTCGGCATGGCCAGCTCCATCTGGTGGGTCATTCTGTCTCTCACTTGGTTCCTGGCGGCCGGCATGAAATGGGGCCACGAAGCCATCGAGGCCAACTCGCAGTACTTCCACCTGGCCGCGTGGGCCGTGCCCGCCGTCAAGACCATCACTATCCTGGCCATGGGCCAGGTAGACGGGGACCTGCTGAACGGGGTGTGCTACGTTGGCTTCTCCAGTGT

32、GGACGCGCTGCGGGGCTTCGTGCTGGCGCCTCTGTTCGTCTACTTCTTCATAGGCACGTCCTTCTTGCTGGCCGGCTTCGTGTCCTTCTTCCGTATCCGCACCATCATGAAACACGACGGCACCAAGACCGAGAAGCTGGAGAAGCTCATGGTGCGCATCGGCGTCTTCAGCGTGCTCTACACAGTGCCCGCCACCATCGTCCTGGCCTGCTACTTCTACGAGCAGGCCTTCCGCGAGCACTGGGAGCGCACCTGGCTCCTGCAGACGTGCAAGAGCTATGCCGTGCCCTGCCCGCCCGG

33、CCACTTCCCGCCCATGAGCCCCGACTTCACCGTCTTCATGATCAAGTGCCTGATGACCATGATCGTCGGCATCACCACTGGCTTCTGGATCTGGTCGGGCAAGACCCTGCAGTCGTGGCGCCGCTTCTACCACAGACTTAGCCACAGCAGCAAGGGAGAGACCGCGGTATGA插入序列TTAATGGACTACAAAGACGATGACGACAAG 通過引物3端大于或等于18個堿基的匹配使引物與模板質(zhì)粒搭配，再通過引物5端的序列來補上那三十個堿基，先用PNK酶把引物磷酸化，再用下面這兩條引物把整個質(zhì)粒給擴增出來，上游和下游引物就剛好

34、把那三十個堿基給補上了，再參照引物的設計原則做一些潤色，細心的伴侶可以具體分析一下這兩條引物。擴出來后再用DPNI酶把模板質(zhì)粒去掉，再用連接酶把PCR產(chǎn)物的兩端連接起來（雖然是平端連接 ，可是由于是同一條PCR產(chǎn)物的兩端連接，效率會很高），轉化后，測序驗證，OK。設計引物forward primer:GGACTACAAAGACGATGACGACAAGCAGCCGTACCACGGAGAGAAG88.5reserve primer: ATTAACGCCCCGGCGCCCGCGGACAGT86.9 但是由于引物的合成是由3端向5端合成，而且每合成多一個堿基的效率最多也是百分之九十九點幾而不是百分之一

35、百，所以我們拿到手的引物其實是一個混合物，比如說我們合成一條長二十個堿基的引物，實際上拿到手的是一個混合物，里面即含有二十個堿基的引物，也含 有肯定比率的十九個、十八個、十七個堿基的引物。所以我們用這種方法做PCR時，假如連上的是足額長度的引物，那么試驗也就成功了，假如連上的是少一兩個堿基的引物，那么試驗就失敗了，不過引物當中主要的仍是足額長度的引物，所以成功機率還是蠻高的。不過送測序時就要做好預備，可能要測三五個才能拿到一個好的。 假如覺得這樣不好的話，我稍后會附上用TYPEII酶或者UDG，NTHIII做的方法，它們是通過互補粘端來連接，就不存在這個問題。下面附上具體試驗過程：第一步：設計

36、引物；其實只要符合一般引物設計原理就行了，順便說一下，引物一般的話，越長其質(zhì)量就其次步：引物PNK處理，一般合成的引物其三端是沒有磷酸化的，所以我們要自己進行磷酸化，一般可以讓其磷酸化過夜，不磷酸化的話最終一步連接就連不上哦。第三步：PCR，跟基因定點突變一樣，要用好的擴增酶和BUFFER，由于要把整個環(huán)高保真的壙增出來嘛；第四步：DPNI處理，跟基因定點突變一樣，要把模板去除潔凈。第五步：連接，加上連接BUFFER和連接酶連接，第六步：轉化。定點誘變(DpnI法)1、引物設計：每條引物都要攜帶有所需的突變位點，引物一般長2545bp,設計的突變位點需位于引物中部。2、反應：使用高保真的pyr

37、obest DNA聚合酶 ;循環(huán)次數(shù)少，一般為12個循環(huán)。反應體系：10x pyrobest Buffer                         5 uldNTP Mixture(10mM)             &#

38、160;         1ul                   模板DNA(550ng)                    

39、60;    1ulprimer 1 (125ng)                            1ulprimer 2 (125ng)                            1ulpyrobest DNA polymerase（TaKaRa）(5U/ul)    0.25ul加無菌蒸餾水至