免疫組化的原理和步驟

1、免疫組織化學的概念： 免疫組化是利用抗原與特異性結合的原理，通過化學反應使標記的顯色劑 (熒光素、酶、金屬離子、同位素) 顯色來確定組織細胞內(nèi)抗原(多肽和蛋白質(zhì))，對其進行定位、定性及定量的爭辯，稱為免疫組織化學。 免疫組化試驗所用的有哪些？ 免疫組化試驗中常用的抗體為單抗體和多抗體。單抗體是一個B淋巴細胞分泌的抗體，應用細胞融合雜交瘤技術免疫動物制備。多克隆抗體是將純化后的抗原直接免疫動物后，從動物血中所獲得的免疫血清，是多個B淋巴細胞克隆所產(chǎn)生的抗體混合物。 免疫組化試驗所用的組織和細胞標本有哪些？ 試驗所用主要為組織標本和細胞標本兩大類，前者包括石蠟切片（病理大片和組織芯片）和冰凍切片，

2、后者包括組織印片、細胞爬片和細胞涂片。 其中石蠟切片是制作組織標本最常用、最基本的方法，對于組織形態(tài)保存好，且能作連續(xù)切片，有利于各種染色對比觀看；還能長期存檔，供回顧性爭辯；石蠟切片制作過程對組織內(nèi)抗原暴露有肯定的影響，但可進行抗原修復，是免疫組化中首選的組織標本制作方法。 石蠟切片為什么要做抗原修復？有哪些方法？ 石蠟切片標本均用甲醛固定，使得細胞內(nèi)抗原形成醛鍵、羧甲鍵而被封閉了部分抗原打算簇，同時蛋白之間發(fā)生交聯(lián)而使抗原打算簇隱蔽。所以要求在進行IHC染色時，需要先進行抗原修復或暴露，即將固定時分子之間所形成的交聯(lián)破壞，而恢復抗原的原有空間形態(tài)。 常用的抗原修復方法有微波修復法，高壓加熱

3、法，酶消化法，水煮加熱法等，常用的修復液是pH6.0的0.01 mol/L的檸檬酸鹽緩沖液。 免疫組化常用的染色方法有哪些？ 依據(jù)標記物的不同分為免疫熒光法，免疫酶標法，親和組織化學法，后者是以一種物質(zhì)對某種組織成分具有高度親合力為基礎的檢測方法。這種方法敏感性更高，有利于微量抗原(抗體)在細胞或亞細胞水平的定位，其中生物素抗生物素染色法最常用。 抗體交叉反應的緣由： 指抗體除與其相應的抗原發(fā)生特異性反應外還與其它抗原發(fā)生反應。產(chǎn)生的緣由有以下幾個方面： 1. 抗原特異性指用于免疫動物的抗原性物質(zhì)中含有多種抗原分子，它引起動物產(chǎn)生針對多種抗原分子特異性的相應抗體。任何其它物質(zhì)只要含有一種或多種

4、與上述物質(zhì)相同的抗原分子，必將與上述多特異性的抗血清發(fā)生交叉反應。 2. 共同打算簇即兩種抗原分子中都含有相同的抗原打算簇。 3. 打算簇相像，兩種不同的抗原打算簇，假如結構大致相同，由于空間構象關系，某一打算簇的相應抗體可以與大致相同的打算簇發(fā)生交叉反應。當然抗原一抗體之間構象相像時的結合力小于吻合時的結合力。 免疫細胞化學技術 一、免疫細胞化學技術的概述 *免疫細胞化學(immunocytochemistry, ICC) -是利用抗原與抗體特異性結合的原理，通過化學反應使標記抗體的顯色劑 (熒光素、酶、金屬離子、同位素) 顯色來確定細胞內(nèi)抗原的成分(主要是多肽和蛋白質(zhì))，對其進行定位、定性

5、及定量的爭辯，稱為。 (一) 對抗原和抗體的要求 *具有特異性高和親和力強的抗體是試驗成功的首要條件。 -對抗體的要求：純度高、比活性強； *高度特異性抗體的獲得，取決于抗原的純度。 -對抗原的要求：純度高，免疫原性強，穩(wěn)定無變化。 (二) 抗原 (antigen, Ag) *抗原的概念：凡是在機體內(nèi)引起體液免疫和(或)細胞免疫反應的物質(zhì)，稱為抗原。抗原具有兩個方面的特性： -免疫原性：引起機體產(chǎn)生抗體和(或)致敏淋細胞的特性； -免疫反應性：抗原能與相應的抗體及致敏淋巴細胞發(fā)生特異的結合或反應的特性。 *依據(jù)抗原是否顯示免疫原性分為： -完全抗原：分子量較大，一般在10kDa以上，并具有較簡

6、單的化學組成。 *免疫原性最強的是蛋白質(zhì)抗原，多糖次之；脂類和核酸必需和蛋白質(zhì)及多糖形成復合物才具有良好的免疫原性。 -半抗原：又稱為不完全抗原，分子量較小。例如：某些短肽、多糖、類脂和藥物等。 *半抗原必需與載體結合，才能獲得免疫原性。 載 體 ：通常是具有高度免疫原性的大分子物質(zhì)，具有將免疫原性傳遞給耦聯(lián)的半抗原力量。 -常用的載體有鑰孔血藍蛋白(keyhole limpet hemocyanin，KLH)、牛血清白蛋白(bovine serum albumin, BSA)、卵白蛋白(Ovalbumin，OVA)等。 -用戊二醛或碳化二亞胺作為交聯(lián)劑通過功能基團-NH2、-COOH等將半抗

7、原結合到載體上。結合比例為5kDa結合525個分子的小肽。 （三）抗體 (antibody, Ab) 1、抗體的概念： *機體受到抗原刺激后，由漿細胞合成并分泌出一類具有與抗原發(fā)生特異性結合的球蛋白，被稱為抗體。 -抗體主要存在于血清內(nèi)； -抗體都是免疫球蛋白，但免疫球蛋白并不肯定都是抗體。 -免疫球蛋白依據(jù)重鏈的結構及抗原特異性不同分為五種，既IgG、 IgD、IgE、 IgA、IgM。 2、免疫組化試驗中常用的抗體：單克隆抗體和多克隆抗體。 *單克隆抗體：是一個B淋巴細胞克隆分泌的抗體，是應用細胞融合雜交瘤技術免疫動物制備的。 -特異性強、抗體產(chǎn)量高。 *多克隆抗體：是將純化后的抗原直接免

8、疫動物后，從動物血中所獲得的免疫血清，是多個B淋巴細胞克隆所產(chǎn)生的抗體混合物。 -特異性低，會產(chǎn)生抗體的交叉反應。 -多克隆抗體廣泛應用于石蠟包埋組織切片，可削減假陰性染色機會。 -抗原與抗體的結合，要求量保持肯定比例，當抗原或抗體過量時，是不能聚合成大顆粒。 3、抗體的制備多克隆抗體的制備 *動物的選擇 *佐劑(adjuvant) *免疫方法 *免疫劑量 *抗體效價的測定 *放血或定期抽血 (1) 動物的選擇 選擇什么動物來免疫取決于： *所需抗血清的量 -小鼠只能供應1.01.5ml的血液，而山羊能供應幾升。 *能供免疫用的抗原量 -小鼠50mg足夠，而山羊需要幾毫克。 (1) 動物的選擇

9、(續(xù)) *動物的品系：免疫動物與供應抗原的動物之間的種系差異越大越好。 -例如哺乳動物的抗原可選擇非哺乳動物來制備抗體。 -常用的動物有兔、羊、馬、豬等，以兔(新西蘭兔，年輕，健壯，體重在2.5kg左右，雄性)為最常用。 (2) 佐劑 (adjuvant) *一般可溶性抗原注射后，快速從注射部位集中、吸取代謝。佐劑可延長潴留時間，且延長免疫刺激作用。因此在制備抗體的過程中，常將抗原和佐劑一起注射。 *最常用的佐劑是弗氏佐劑，又分為: -弗氏不完全佐劑(Freund's incomplete adjuvant) -弗氏完全佐劑(Freund's complete adjuvant

10、) 弗氏不完全佐劑 (Freund's incomplete adjuvant, FIA) *是由油劑(石蠟油或植物油)與乳化劑(羊毛脂或Tween80)混合而成，比例為1:1、2:1、3:1或5:1，可依據(jù)需要而定，通常2:1。 *使用時與水溶性抗原按1:1比例充分混合，使抗原分散在佐劑中形成油包水乳劑。 弗氏完全佐劑 (Freund's complete adjuvant, FCA) *在弗氏不完全佐劑中加入活卡介苗或死的結核分枝桿菌(終濃度為220mg/ml)，即成為FCA。 *免疫動物時，將弗氏佐劑與抗原按體積 1:1 混合乳化后(油包水)注入動物。 -一般首次注射時用

11、完全佐劑乳化，其次次或第三次注射時用不完全佐劑或不用佐劑。 佐劑與抗原乳化的方法 *研磨法：適于制備大量的佐劑抗原 -先將不完全佐劑加熱，取1.73ml放人無菌玻璃研缽內(nèi)；緩緩滴入0.23ml活卡介苗，邊滴邊按同一方向研磨，使菌體完全分散。 -按同樣方法滴人抗原，每加一滴應研磨至小滴消逝。滴加抗原的速度要慢，待抗原全部加人后，應成為乳白色粘稠的油包水乳劑。 *缺點：研缽壁上粘附大量乳劑，抗原損失較大，對微量或難得抗原不宜接受。 佐劑與抗原乳化的方法(續(xù)) *注射器混合法 -將等量的完全佐劑和抗原分別吸人兩個5ml注射器內(nèi)，然后插入三通管內(nèi)，交替推動針管混勻，往復操作直至形成粘稠的乳劑為止。 *

12、優(yōu)點：無菌操作，節(jié)省抗原或佐劑。 *缺點：不易乳化，時間長。 佐劑與抗原乳化的方法(續(xù)) *快速乳化法：利用超聲波粉碎器可快速乳化抗原和佐劑混合物。 -將抗原和佐劑按所需量加入一中，置于超聲波粉碎器上，粉碎頭浸入液面下 0.5cm，離瓶底0.5cm左右，以免打碎。 -每次乳化 1015s，然后置冰箱lmin左右。反復乳化34次即可完全乳化。管內(nèi)殘余量800r/min離心510min收集。 *優(yōu)點：簡潔、快速、節(jié)省材料。 乳化劑的鑒定 *推斷乳化是否充分，可將一滴乳化好的液體滴在水面上(冷水中)，如能長時間保持圓珠形而不散開，表示乳化達到要求。 (3) 免疫方法免疫途徑 *常有靜脈、腹腔、肌肉、

13、皮下、皮內(nèi)、淋巴結、腳掌等注射。 *一般接受多點注射方法 -常在足、掌、腋窩淋巴結四周、背部兩側、頜下、耳后等處的皮內(nèi)或皮下。 -皮內(nèi)易引起細胞免疫反應，有利于提高抗體的效價。 (3) 免疫方法免疫途徑 (續(xù)) *幾點說明： -大動物一般不用腹腔注射 -顆?？乖褪褂米魟r不能靜脈注射 -抗原貴重可接受淋巴結內(nèi)微量注射法，只需10100mg抗原即可獲得較好的免疫效果。 -皮內(nèi)注射較困難，特殊是天冷時更難注入。 (3) 免疫方法次數(shù)及間隔時間 *次數(shù)一般為23次(初次免疫和加強免疫) -首次注射后，1015天再加強注射； -劑量同首次或為首次的一半，用不全佐劑或不用佐劑。 *間隔時間，一般而言，

14、動物越大，間隔越長 -豚鼠、大鼠為78天，兔子為1015天，羊為1428天； -第三次注射的間隔時間更長些，效果更好。 舉例1：家兔的免疫 *初次免疫 -用50200mg Ag加入FCA，在背部皮下注射68點，每點0.10.2ml，也可肌肉內(nèi)或皮內(nèi)注射； *兩周后，加強免疫 -將50200mg Ag于PBS或FIA中，在肌肉、皮下、靜脈或腹腔內(nèi)注射； *抗體效價的檢測：加強免疫一周后，耳緣靜脈采血 -抗體效價測定可用環(huán)狀沉淀試驗、瓊脂雙向集中法等方法。前者抗體效價在1:4000以上，后者在1:16以上，即可采血，取血清進一步提純。 舉例2：微量抗原淋巴結內(nèi)注射免疫家兔 *一般選擇2.53.0k

15、g的新西蘭種公兔 -先在其兩腳墊注射完全福氏佐劑0.2ml(卡介苗每兔合5mg)； -10天后，見胭窩淋巴結腫大，然后將抗原注射至腫大的淋巴結內(nèi)，第一次注射抗原用完全福氏佐劑混合乳化； -以后每隔20天用不完全福氏佐劑乳化抗原，以同樣方法加強2次，各次注射的抗原均為2550mg； -末次注射兩周后兔耳放血測價 (可達1:128)。 舉例3：豚鼠和大鼠的免疫 *初次免疫 -用10100mg Ag加入FCA，在背部皮內(nèi)注射46點，每點 0.lml，也可肌肉內(nèi)或皮下注射； *加強免疫 -每隔 78天，將1050mg Ag于 PBS或FIA中。在肌肉、皮下或靜脈注射； *抗體效價的檢測 (4) 免疫劑

16、量 *抗原性強的抗原量應小，過大反會引起免疫抑制； *免疫周期長的動物可少量多次注射，短的可大量少次。 (4) 免疫劑量 (續(xù)) *各種動物首次免疫抗原劑量和加強免疫的劑量 (5) 抗體效價的檢測 多采免疫雙向集中法 【基本原理】 *指抗原和抗體在同一凝膠內(nèi)都集中，彼此相遇后形成特異性的沉淀線。 -將抗原與抗體分別加入同一凝膠板中兩個相隔肯定間距的小孔內(nèi)，使兩者進行相互集中，當抗原抗體濃度之比相適宜時，彼此相遇形成一白色弧狀沉淀線。 *優(yōu)缺點：簡便，但敏感性較低，易消滅假陰性結果。 免疫雙向集中法的操作步驟 *將玻璃板用水洗凈后用75乙醇沖洗，晾干后放在水平臺上備用。 *將1agar 溶化后，

17、置56水浴。 *在玻璃板上鋪膠，約1.5mm 厚，凝固后打孔(直徑 3rnm)，孔間距10mm。 *中心孔加5ml 抗原樣品，四周孔內(nèi)每孔加5ml 抗血清(抗體預先作系列倍比稀釋即 1:2、1:4、1:8、1:16、1:32等比例)。 *凝膠板置濕盒內(nèi)，室溫集中24h。 *觀看結果。 抗體效價檢測的其它方法 *環(huán)狀沉淀試驗，需較多的抗血清，現(xiàn)已很少用； *對流免疫電泳，比瓊脂免疫雙集中法敏感，較簡便、有用； *酶聯(lián)免疫吸附試驗 (ELISA)。 放血或定期抽血 常用以下3種方法 *頸動脈放血法：放血量較多，動物不易中途死亡。例如：2.5kg白兔可放血約80ml。家兔、山羊、綿羊等動物

18、采血常用此法。 *心臟采血法：常用于家兔、豚鼠、大白鼠、雞等小動物，但操作不當易引起動物死亡。 *靜脈采血：家兔可用耳緣靜脈采血；山羊、綿羊、馬和驢可用頸靜脈采血，這種放血法可隔日1次，有時可采集多量血液。 放血或定期抽血 (續(xù)) *采血過程中，動作要輕柔，盡量避開溶血 *血液凝固后，準時離心收集血清，否則細胞溶解釋放的雜蛋白(例如蛋白水解酶)將污染抗體并將抗體水解，降低效價； *加疊氮化鈉，分裝，低溫保存，也可加肯定的愛護劑如BSA、甘油等。 二、組織和細胞標本的制備 *標本制備恰當，是免疫組化成功的首要條件 *免疫組化對組織和細胞標本的要求 -保持所檢標本原有的結構、形態(tài)； -在

19、原位最大程度地保持待測抗原(或抗體)的免疫活性，既不淬滅、流失或彌散，也不被隱蔽。 *免疫組化的組織和細胞標本，制作流程與常規(guī)處理方法基本相同，但對組織、細胞的處理又有其特殊要求及留意事項。 -各種抗原由于其含量及特性的差異對標本處理方式常有不同要求，因此要選擇適用于本試驗的最佳方法。 免疫組化中常用的組織和細胞標本 *組織標本 -石蠟切片 -冰凍切片 *細胞標本 -組織印片 -片(細胞爬片) -細胞涂片 (一) 石蠟切片 *石蠟切片是制作組織標本最常用、最基本的方法 -最大優(yōu)點是組織形態(tài)保存好，且能作連續(xù)切片，有利于各種染色對比觀看； -石蠟塊還能長期存檔，供回顧爭辯。 *石蠟切片制作過程對

20、組織內(nèi)抗原顯現(xiàn)有肯定的影響，但可通過某些措施予以改善，因而它是大多數(shù)免疫組化中首選的組織標本制作方法。 1、取材的特殊要求及留意事項 *標本新穎：一般在2h以內(nèi)進行，超過2h，組織將有不同程度的自溶，其抗原或變性消逝，或嚴峻彌散。 *取材部位：除取病灶或含待檢抗原部位外，還應取病灶與正常交界處，即所取組織切片中同時應有抗原陽性和陰性區(qū)，以形成自身對比。 -細胞壞死后，不僅抗原彌散或消逝，而且常引起非特異著色，干擾觀看，因此取材時應盡可能避開壞死區(qū)。 1、取材的特殊要求及留意事項(續(xù)) *避開擠壓：取材時組織受擠壓可使邊緣部細胞形態(tài)轉變并加深非特異著色，因而取材時應使用鋒利的刀刃； -鑷取組織動

21、作要輕； -經(jīng)窺鏡直接鉗取的組織往往有過度擠壓，觀看結果時應有所考慮。 2、固定及常用的固定液 *取材后的組織需馬上投于固定劑中 -固定使組織和細胞的蛋白質(zhì)凝固，終止內(nèi)源性或外源性酶反應，防止組織自溶或異溶，以保持原有結構和形態(tài)； -對免疫組化而言更有原位保存抗原的作用，避開抗原失活或彌散。 *常用固定液：固定劑品種很多，但大多屬于醛類和醇類。其固定原理不同，各有優(yōu)缺點。 -醛類（常用甲醛、戊二醛和多聚甲醛） -醇類（常用乙醇） -其它 （丙酮） (1) 醛類 *甲醛(福爾馬林)應用最廣 -原理：形成分子間的交聯(lián)，影響蛋白構型而使之固定。 -優(yōu)點：形態(tài)結構保存好，且穿透性強，組織收縮少。 -缺

22、點： *甲醛放置過久可氧化為甲酸，使溶液pH降低，影響染色； *醛基與抗原蛋白的氨基交聯(lián)形成羧甲基，使抗原打算簇的三維構象消滅空間障礙； *分子間交聯(lián)形成的網(wǎng)格結構可能部分或完全掩蓋某些抗原打算簇，使之不能充分暴露?？稍斐杉訇幮缘娜旧Y果。 -留意事項： *縮短固定時間，降低固定溫度(4°C)，為此組織塊不宜過厚。 *改用中性緩沖福爾馬林，以pH值7.27.4 0.01mol/L的磷酸鹽緩沖液配制成10甲醛固定液，削減固定液pH的變化。 *固定后充分水洗以削減分子間交聯(lián)。 *切片在作免疫組化染色前，先經(jīng)預處理使抗原再現(xiàn)(抗原修復)。 *戊二醛： -穿透性強，微細結構保存好，但對抗原有

23、肯定影響，常與其他固定劑聯(lián)合用作免疫電鏡固定液。 *多聚甲醛(常用4%)： -可用于免疫電鏡；也可用于免疫熒光染色。 *主要檢測組織內(nèi)一些性能嬌弱的抗原特殊是細胞表面抗原，例如各類淋巴細胸分化打算簇(CD)、主要組織相容性抗原等。 (2) 醇類 * 最常用的醇類固定劑是乙醇。 -其固定作用：使細胞內(nèi)蛋白、糖類發(fā)生沉淀。 -優(yōu)點：穿透性強、抗原性保存好。 -缺點： *脫水性強，易引起組織收縮、變硬，影響切片質(zhì)量，因而乙醇固定時間不宜過長(2h內(nèi))。 *乙醇使蛋白變性的作用輕，固定后可再溶解；染色過程中，溫育時間長，抗原可流失而減弱反應強度。 (3) 其它固定劑 *丙酮： -對抗原性的保存好，但脫

24、水性更強，較少 用于組織標本，但細胞爬片常用丙酮固定。 3、抗原修復緣由 *常規(guī)的石蠟切片標本均用甲醛固定，結果使得： -抗原性物質(zhì)形成醛鍵、羧甲鍵而被封閉了部分抗原打算簇； -蛋白之間發(fā)生交聯(lián)而使抗原打算簇隱蔽。 *要求：在染色時，需要先進行抗原修復或暴露，即將固定時分子之間所形成的交聯(lián)破壞，而恢復抗原的原有空間形態(tài)。 3、抗原修復方法 *化學方法 *加熱方法 -水浴加熱法 -微波照射法 -高壓加熱法 -酸水解法 (1) 化學方法 *主要是通過一些酶的作用，使抗原打算簇暴露。常用的酶有：胰蛋白酶、胃蛋白酶等。 -胰蛋白酶：一般使用濃度為0.050.1，消化時間為37°C，1040min，主要用于細胞內(nèi)抗原的顯示； -胃蛋白酶：一般使用濃度為0.1%0.4，消化時間為37°C、30180min，主要用于細胞間質(zhì)抗原的顯示。 *例如：Laminin、CollagenIV (2) 水浴加熱法 *將玻片放入裝有抗原修復液的容器中，加熱至沸騰，持續(xù)1015分鐘。 -優(yōu)點：操作簡潔、經(jīng)濟，適用于全部的試驗室， -缺點：對封閉堅固的抗原打算簇暴露不抱負。 (3) 微波照射法 *將玻片放入裝有抗原修復液的容器中，置微波爐加熱至95以上，持續(xù)